MS2-Afinidad Purificación Junto Con La Secuenciación De ARN En Bacterias Gram-Positivas
Summary
La tecnología MAPS se ha desarrollado para escudriñar el targetome de un ARN regulador específico in vivo. El sRNA de interés está etiquetado con un aptámero MS2 que permite la co-purificación de sus socios de ARN y su identificación por secuenciación de ARN. Este protocolo modificado es particularmente adecuado para bacterias Gram-positivas.
Abstract
Aunque los pequeños ARN reguladores (ARNs) están muy extendidos entre el dominio bacteriano de la vida, las funciones de muchos de ellos siguen estando mal caracterizadas, en particular debido a la dificultad de identificar sus dianas de ARNm. Aquí, se describe un protocolo modificado de la purificación ms2-afinidad junto con la tecnología de secuenciación de ARN (MAPAS), con el objetivo de revelar todos los socios de ARN de un sRNA específico in vivo. En términos generales, el aptámero MS2 se fusiona con la extremidad 5′ del sRNA de interés. Esta construcción se expresa entonces in vivo, permitiendo que el MS2-sRNA interactúe con sus socios celulares. Después de la recolección bacteriana, las células se lisan mecánicamente. El extracto crudo se carga en una columna de cromatografía a base de amilosa previamente recubierta con la proteína MS2 fusionada con la proteína de unión a la maltosa. Esto permite la captura específica de MS2-sRNA y de los ARN que obran recíprocamente. Después de la elución, los ARN co-purificados se identifican mediante la secuenciación de ARN de alto rendimiento y el posterior análisis bioinformático. El siguiente protocolo se ha implementado en el patógeno humano Gram-positivo Staphylococcus aureus y es, en principio, transponible a cualquier bacteria Gram-positiva. En resumen, la tecnología MAPS constituye un método eficiente para explorar profundamente la red reguladora de un sRNA en particular, ofreciendo una instantánea de todo su targetome. Sin embargo, es importante tener en cuenta que los supuestos objetivos identificados por MAPS todavía necesitan ser validados por enfoques experimentales complementarios.
Introduction
Cientos, quizás incluso miles de pequeños ARN reguladores (ARNs) se han identificado en la mayoría de los genomas bacterianos, pero las funciones de la gran mayoría de ellos permanecen sin caracterizar. En general, los ARNs son moléculas cortas no codificantes, que desempeñan un papel importante en la fisiología bacteriana y la adaptación a entornos fluctuantes1,2,3. De hecho, estas macromoléculas están en el centro de numerosas redes reguladoras intrincadas, impactando las vías metabólicas, las respuestas al estrés, pero también la virulencia y la resistencia a los antibióticos. Lógicamente, su síntesis es desencadenada por estímulos ambientales específicos (por ejemplo, hambre de nutrientes, estrés oxidativo o de membrana). La mayoría de los sRNAs regulan múltiples ARNm diana a nivel post-transcripcional a través de emparejamiento de bases corto y no contiguo. Por lo general, impiden la iniciación de la traducción compitiendo con los ribosomas para las regiones de iniciación de la traducción4. La formación de sRNA: dúplex de ARNm también a menudo resulta en la degradación activa del ARNm objetivo mediante el reclutamiento de ARN específicas.
La caracterización de un sRNA targetome (es decir, el conjunto completo de sus ARN diana) permite la identificación de las vías metabólicas en las que interviene y la señal potencial a la que responde. En consecuencia, las funciones de un sRNA específico generalmente se pueden inferir de su targetoma. Para ello, se han desarrollado varias herramientas de predicción in silico como IntaRNA y CopraRNA5,6,7. En particular, se basan en la complementariedad de la secuencia, la energía de emparejamiento y la accesibilidad del sitio de interacción potencial para determinar los supuestos socios de sRNA. Sin embargo, los algoritmos de predicción no integran todos los factores que influyen en el emparejamiento de bases in vivo, como la implicación de las chaperonas de ARN8 favoreciendo interacciones subóptimas o la coexpresión de ambos socios. Debido a sus limitaciones inherentes, la tasa de falsos positivos de las herramientas de predicción sigue siendo alta. La mayoría de los enfoques experimentales a gran escala se basan en la co-purificación de las parejas de ARNm:ARNm que interactúan con una proteína de unión a ARN marcada (RBP)6,9. Por ejemplo, el método de interacción de ARN por ligadura y secuenciación (RIL-seq) identificó dúplex de ARN co-purificados con chaperonas de ARN como Hfq y ProQ en Escherichia coli10,11. Una tecnología similar llamada RETICULADO UV, Ligadura y Secuenciación de Híbridos (CLASH) se aplicó a la ARNasa E- y Hfq asociados a sRNAs en E. coli12,13. A pesar de los papeles bien descritos de Hfq y ProQ en la regulación mediada por sRNA en múltiples bacterias8,14,15,la regulación basada en ARN parece ser independiente de la chaperona de ARN en varios organismos como S. aureus16,17,18. Incluso si la purificación de los dúplex de ARN en asociación con RNases es factible como lo demuestran Waters y sus compañeros de trabajo13,esto sigue siendo complicado ya que las RNases desencadenan su rápida degradación. Por lo tanto, el enfoque de purificación de MS2-afinidad junto con la secuenciación de ARN (MAPS)19,20 constituye una alternativa sólida en tales organismos.
A diferencia de los métodos mencionados anteriormente, MAPS utiliza un sRNA específico como cebo para capturar todos los ARN que interactúan y, por lo tanto, no depende de la participación de un RBP. Todo el proceso se representa en la Figura 1. En resumen, el sRNA está etiquetado en el 5′ con el aptámero de ARN MS2 que es específicamente reconocido por la proteína de la capa MS2. Esta proteína se fusiona con la proteína de unión a la maltosa (MBP) para ser inmovilizada en una resina de amilosa. Por lo tanto, MS2-sRNA y sus socios del ARN se conservan en la columna de la cromatografía de la afinidad. Después de la elución con maltosa, los ARN co-purificados se identifican mediante secuenciación de ARN de alto rendimiento seguida de análisis bioinformáticos (Figura 2). En última instancia, la tecnología MAPS dibuja un mapa de interacción de todas las interacciones potenciales que ocurren in vivo.
La tecnología MAPS se implementó originalmente en la bacteria Gram-negativa no patógena E. coli21. Cabe destacar que MAPS ayudó a identificar un fragmento derivado del ARNt que interactúa específicamente con los sRNAs de RyhB y RybB y previene cualquier ruido transcripcional de ARN para regular los objetivos de ARNm en condiciones no inductoras. A partir de entonces, MAPS se ha aplicado con éxito a otros ARNs de E. coli como DsrA22,RprA23,CyaR23 y GcvB24 (Tabla 1). Además de confirmar objetivos previamente conocidos, MAPS extendió el targetome de estos sRNAs bien conocidos. Recientemente, MAPS se ha realizado en Salmonella Typhimurium y reveló que el sRNA SraL se une al ARNm rho, codificando para un factor de terminación de la transcripción25. A través de este emparejamiento, SraL protege rho mRNA de la terminación prematura de la transcripción desencadenada por Rho sí mismo. Curiosamente, esta tecnología no se limita a los ARNs y se puede aplicar a cualquier tipo de ARN celulares como se ejemplifica mediante el uso de un fragmento derivado del ARNt26 y una región 5′-no traducida del ARNm22 (Tabla 1).
El método MAPS también se ha adaptado a la bacteria grampositiva patógena S. aureus19. Específicamente, el protocolo de lisis ha sido ampliamente modificado para romper eficientemente las células debido a una pared celular más gruesa que las bacterias Gram-negativas y para mantener la integridad del ARN. Este protocolo adaptado ya desentrañó el interactoma de RsaA27,RsaI28 y RsaC29. Este acercamiento dio penetraciones en el papel crucial de estos sRNAs en mecanismos reguladores de las propiedades de la superficie de la célula, de la absorción de la glucosa, y de las respuestas oxidativas de la tensión.
El protocolo desarrollado e implementado en E. coli en 2015 ha sido descrito recientemente con gran detalle30. Aquí, proporcionamos el protocolo MAPS modificado, que es particularmente adecuado para el estudio de redes reguladoras de ARN en bacterias Gram-positivas (pared celular más gruesa) ya sean no patógenas o patógenas (precauciones de seguridad).
Protocol
Representative Results
Discussion
Un protocolo modificado para bacterias Gram-positivas
El protocolo inicial de MAPS se desarrolló para estudiar el sRNA interactoma en el organismo modelo E. coli20,30. Aquí, se describe un protocolo modificado que es adecuado para la caracterización de las redes reguladoras dependientes de ARN en el patógeno humano oportunista S. áureo y es ciertamente transponible a otras bacterias Gram-positivas, patógenos o no.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la “Agence Nationale de la Recherche” (ANR, Grant ANR-16-CE11-0007-01, RIBOSTAPH, y ANR-18-CE12- 0025-04, CoNoCo, a PR). También se ha publicado en el marco del labEx NetRNA ANR-10-LABX-0036 y de ANR-17-EURE-0023 (a PR), como financiación del estado gestionado por ANR como parte de las inversiones para el futuro programa. DL recibió el apoyo del programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en virtud del Acuerdo de Subvención Marie Skłodowska-Curie n.º 753137-SaRNAReg. El trabajo en E. Massé Lab ha sido apoyado por subvenciones operativas de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud (CIHR), el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (NSERC) y la Subvención R01 GM092830-06A1 del Equipo de los Institutos Nacionales de Salud de los NIH.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt | 72.690.001 | |
| 15 mL centrifuge tubes | Falcon | 352070 | |
| 2 mL microcentrifuge tube | Starstedt | 72.691 | |
| 2100 Bioanalyzer Instrument | Agilent | G2939BA | RNA quantity and quality |
| 250 mL culture flask | Dominique Dutscher | 2515074 | Bacterial cultures |
| 50 mL centrifuge tubes | Falcon | 352051 | Culture centrifugation |
| Absolute ethanol | VWR Chemicals | 20821.321 | RNA extraction and purification |
| Allegra X-12R Centrifuge | Beckman Coulter | Bacterial pelleting | |
| Ampicilin (amp) | Sigma-Aldrich | A9518-5G | Growth medium |
| Amylose resin | New England BioLabs | E8021S | MS2-affinity purification |
| Anti-dioxigenin AP Fab fragment | Sigma Aldrich | 11093274910 | Northern blot assays |
| Autoradiography cassette | ThermoFisher Scientific | 50-212-726 | Northern blot assays |
| BamHI | ThermoFisher Scientific | ER0051 | Plasmid construction |
| BHI (Brain Heart Infusion) Broth | Sigma-Aldrich | 53286 | Growth medium |
| Blocking reagent | Sigma Aldrich | 11096176001 | Northern blot assays |
| CDP-Star | Sigma Aldrich | 11759051001 | Northern blot assays (substrate) |
| Centrifuge 5415 R | Eppendorf | RNA extraction and purification | |
| Chloroform | Dominique Dutscher | 508320-CER | RNA extraction and purification |
| DIG-RNA labelling mix | Sigma-Aldrich | 11277073910 | Northern blot assays |
| DNase I | Roche | 4716728001 | DNase treatment |
| Erythromycin (ery) | Sigma-Aldrich | Fluka 45673 | Growth medium |
| FastPrep device | MP Biomedicals | 116004500 | Mechanical lysis |
| Guanidium Thiocyanate | Sigma-Aldrich | G9277-250G | Northern blot assays |
| Hybridization Hoven Hybrigene | Techne | FHB4DD | Northern blot assays |
| Hybridization tubes | Techne | FHB16 | Northern blot assays |
| Isoamyl alcohol | Fisher Scientific | A/6960/08 | RNA extraction and purification |
| LB (Lysogeny Broth) | Sigma-Aldrich | L3022 | Growth medium |
| Lysing Matrix B Bulk | MP Biomedicals | 6540-428 | Mechanical lysis |
| MicroPulser Electroporator | BioRad | 1652100 | Plasmid construction |
| Milli-Q water device | Millipore | Z00QSV0WW | Ultrapure water |
| NanoDrop spectrophotometer | ThermoFisher Scientific | RNA/DNA quantity and quality | |
| Nitrocellulose membrane | Dominique Dutsher | 10600002 | Northern blot assays |
| Phembact Neutre | PHEM Technologies | BAC03-5-11205 | Cleaning and decontamination |
| Phenol | Carl Roth | 38.2 | RNA extraction and purification |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | New England Biolabs | M0530 | Plasmid construction |
| pMBP-MS2 | Addgene | 65104 | MS2-MBP production |
| Poly-Prep chromatography column | BioRad | 7311550 | MS2-affinity purification |
| PstI | ThermoFisher Scientific | ER0615 | Plasmid construction |
| Qubit 3 Fluorometer | Invitrogen | 15387293 | RNA quantity |
| RNAPro Solution | MP Biomedicals | 6055050 | Mechanical lysis |
| ScriptSeq Complete Kit | Illumina | BB1224 | Preparation of cDNA librairies |
| Spectrophotometer Genesys 20 | ThermoFisher Scientific | 11972278 | Bacterial cultures |
| SpeedVac Savant vacuum device | ThermoFisher Scientific | DNA120 | RNA extraction and purification |
| Stratalinker UV Crosslinker 1800 | Stratagene | 400672 | Northern blot assays |
| T4 DNA ligase | ThermoFisher Scientific | EL0014 | Plasmid construction |
| TBE (Tris-Borate-EDTA) | Euromedex | ET020-C | Northern blot assays |
| ThermalCycler T100 | BioRad | 1861096 | Plasmid construction |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P9416-100ML | Northern blot assays |
| X-ray film processor | hu.q | HQ-350XT | Northern blot assays |
| X-ray films Super RX-N | FujiFilm | 4741019318 | Northern blot assays |
Referências
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