Summary
ここでは、 ショウジョウバエ 胚タンパク質およびRNAの収集から事前包埋および包埋、免疫染色、およびmRNAin situ ハイブリダイゼーションまでの検出および局在化のためのプロトコールについて記載する。
Abstract
カルシウム誘導カルシウム放出シグナル伝達(CICR)は、多くの生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たしている。細胞の増殖およびアポトーシス、発生および老化から、ニューロンシナプス可塑性および再生までのすべての細胞活性は、リアノジン受容体(RyRs)と関連している。カルシウムシグナル伝達の重要性にもかかわらず、初期の発達におけるその機能の正確なメカニズムは不明である。妊娠期間の短い生物として、 ショウジョウバエのメラノガスター の胚は、発生中のCICR関連タンパク質およびその調節因子の分布および局在を調査するための主要な研究対象である。しかし、脂質が豊富な胚とキチンが豊富な絨毛膜のために、その有用性はガラス表面に胚を取り付けることの難しさによって制限される。本研究では、 ショウジョウバエ 胚のスライドへの付着を著しく増強する実用的なプロトコルと、組織化学、免疫組織化学、 およびin-situ ハイブリダイゼーションを成功させるための詳細な方法を紹介します。クロムミョウバンゼラチンスライドコーティング法および胚プレエンベディング法は 、ショウジョウバエ の胚タンパク質およびRNA発現を研究する際の収量を劇的に増加させる。このアプローチを実証するために、ショウ ジョウバエのメラノガスターの初期胚発生中のRyRのよく知られた調節因子であるDmFKBP12/Calstabinを研究した。我々は、 DmFKBP12 を合胞体芽細胞胚葉期の早い段階で同定し、発生中の DmFKBP12 の動的発現パターンを報告した:最初は合胞胚葉に均等に分布したタンパク質として、次いで細胞芽球の期間中に皮質の基底層に予め局在し、その後、初期の胃胞の3gem層期に原始ニューロンおよび消化アーキテクチャに分布する。この分布は、これらの層に由来する重要な器官系、すなわち食道下および食道上神経節、腹側神経系、および筋骨格系においてRyRが果たす重要な役割を説明する可能性がある。
Introduction
カルシウム誘導カルシウム放出シグナル伝達(CICR)は、骨格/平滑筋および心臓血管機能、細胞増殖およびアポトーシス、発達、老化、ニューロンシナプス可塑性、および再生などの多くの生物学的プロセスにおいて重要な役割を果たしている1,2,3,4,5,6 .リアノジン受容体(RyRs)およびイノシトール1,4,5-三リン酸受容体(IP3R)は、それらの調節因子プロテインキナーゼA(PKA)、Ca2+/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼII(CaMKII)、FK506結合タンパク質(FKBP)、カルセクエストリン(CSQ)、トリアジン、およびジュンクチンによって制御されるカルシウムシグナル伝達経路における主要なプレーヤーである1,2,3,4,5,6.これらのタンパク質の異常なヒトの発現および変異は、不整脈7および発癌性増殖などの病理学的生理機能につながる可能性があります8,9。
FKBPは、RyRsによって小胞体網状(ER)からのカルシウム放出を調節する。このプロセスは収縮のメカニズムに不可欠であり、したがって、胚性RyRs1,2とともにカルシウム誘発カルシウム放出を介してミオシン - アクチン収縮によって生成されるすべての機械的運動に関与する。マウスモデルでは、RyR2およびその調節因子FKBP12/カルスタビンの欠如は、胚発生中または出生後早期のいずれかにおいて、常に致死的である10,11,12。FKBP12/カルスタビンノックアウトマウスは、胚発生中に不規則な興奮収縮結合(EC)および脳浮腫を伴う重大な心不全を示す。これは、FKBP12/カルスタビンが心臓と脳の発達の両方にとって重要なRyR2チャネル発現の調節に不可欠な役割を果たすことを示しています10。
RyRが実施したカルシウムスパークは、受精したメダカ卵の受精卵形成期に最初に発見されました13,14。しかし、初期胚発生におけるカルシウムシグナル伝達の機能に関する研究はほとんど行われていない。ショウジョウバエのメラノガスターでは、DmFKBP12 S107変異体から得られた結果は、幼虫の発育と健康寿命に対するこの遺伝子の重要性を支持する強力な証拠を提供し、これは酸化ストレスに対するその機能に起因する15,16。最近、ショウジョウバエのメラノガスター発生初期におけるFKBP12/カルスタビンタンパク質とメッセンジャーRNAの動的局在を同定しました17。この方法論に記載されたアプローチを用いて、我々は合胞体芽球(0-2時間)、細胞芽細胞胚葉(2-3時間)、初期ガストルーラ(3-12時間)、および後期ガストルーラ(12-24時間)の間にD.メラノガスターにおけるFKBP12/カルスタビンの発現を追跡することができた。本稿では、古典的なパラフィン切片化のための前胚包埋、胚切片のプレコーティングスライド処理、組織化学染色および免疫染色、遺伝子発現の同定のためのmRNA in-situハイブリダイゼーションなど、以前の研究におけるすべてのアプローチの詳細なプロトコルを提示する。
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Protocol
1. ブドウ果汁寒天プレートの作製
- 5gの寒天および5gのスクロースを150mLの蒸留水に加える。寒天とショ糖が完全に溶解するまで電子レンジを用いて沸騰させる。50mLの100%ブドウジュースと溶液を一緒に混ぜる。
- 1mLの100%プロピオン酸を加え、最終濃度を0.5%プロピオン酸にする。調製した溶液25mLを各プレートに注ぐ。寒天が固化した後、培地を4°Cに保存する。
2. コーティングスライド
- スライドを洗剤で前処理します。スライドを水道水で3回、蒸留水で1回洗います。その後、スライドを45°Cのオーブンで2時間乾燥させます。
- スライドを約450 mLの重クロム酸カリウム硫酸溶液(20 gの重クロム酸カリウム、40 mLの蒸留水、および400 mLの濃硫酸)に24時間浸漬する。スライドを水道水で3回、蒸留水で1回洗います。
- スライドを45°Cのオーブンで2時間乾燥させる。95%エタノールに2時間以上浸します。
- 1Lの蒸留水に0.5gの硫酸クロムカリウムおよび5gのゼラチンを加える。使用前に60°Cの水浴に溶かしてください。クロムミョウバンゼラチンは、4°Cで長期間保存することができます。
- スライドにクロムミョウバンゼラチン10μLを落とし、スライドの全面を溶液で完全かつ均等に覆う。ゼラチンの側面を上にしてスライドを42°Cのオーブンに48時間置きます。準備されたスライドは、後で使用するために4°Cで保存することができます。
メモ: これは重要な手順です。完全なコーティングが必要です。ショウジョウバエとその胚の場合、このスライドコーティングアプローチはポリリジンコーティングよりも効率的であるように見えます。
ショウ ジョウバエ 胚の埋め込み
-
ショウジョウバエ 胚採取
注: ショウジョウバエ の胚を0~2時間(合胞体芽細胞)、2~3時間(細胞芽球)、3~12時間(初期ガストルーラ)、12~24時間(後期ガストルーラ)の4つの期間に採取しました18。各期間における主胚型の割合を 表1に示す。- プラスチック収集瓶に400〜500匹のハエを入れ、酵母エキスを含むブドウジュース寒天プレートで瓶を覆う。 ショウジョウバエ の胚は、室温でブドウジュース寒天の上に敷設される。
- 4周期の胚を収集し、2 mLのPBS(137 mM NaCl、2.7 mM KCL、10 mM Na2HPO4、2 mM KH2PO4、pH 7.4)を各プレートに穏やかに加え、胚を浮遊させた。約200個の胚を50mLの遠沈管に移し、それを2分間氷上に保持して胚を沈降させる。
- 埋め込み前
- ショウ ジョウバエ の胚200個を1.5mLの遠沈管に移す。チューブを氷上に2分間保持して胚を落ち着かせ、上清をピペットで慎重に捨てます。チューブに50%漂白剤1mLを加え、2分間穏やかに振る。
注:漂白剤は新鮮に準備する必要があり、漂白剤の量は収集された胚の量によって異なる場合があります。 - ろ紙に注いで胚を穏やかに集め、毎回1mLのPBSで3回洗い流します。
- ろ紙で胚を約5mLのn-ヘプタンに移す。
- 混合物を新鮮な1.5 mL遠沈管に移す。メタノール1mLを加え、軽く振る。沈降後に胚を集める。
- 上清を除去し、胚を1mLのPBS中で3〜5回洗浄する。
- 400μLのブアン溶液(71%飽和ピクリン酸、24%ホルマリン、5%酢酸)で胚を30分間固定する。固定した胚を1mLのPBSで3回、毎回5分間洗浄する。
- 胚を凝集させるには、サンプルをゴム栓に移し、PBSを除去します。
- 2%アガロース-PBS溶液を調製し、溶液を60°Cに保つ。 200 μLの1.2%アガロース-PBS溶液を胚に加え、寒天ブロックに固定する。
- ストッパーからブロックを取り出し、ブロックをPBSに保存します。
注:埋め込み前のアプローチでは、温暖化促進が成功するために不可欠です。このステップで使用する遠沈管とマイクロピペットチップは、操作前に完全に予備加熱しておくことを強くお勧めします。
- ショウ ジョウバエ の胚200個を1.5mLの遠沈管に移す。チューブを氷上に2分間保持して胚を落ち着かせ、上清をピペットで慎重に捨てます。チューブに50%漂白剤1mLを加え、2分間穏やかに振る。
- パラフィン埋め込み
- 予め包埋した寒天ブロックを35%エタノール、50%エタノール、75%エタノール、および85%エタノールにそれぞれ15分間浸漬する。その後、95%エタノールおよび100%エタノールに2回浸漬する。
注:ブロック内の胚の数に応じて、各ブロック体積の約5〜10倍に続いて15〜30分間の段階的固定液が必要である。 - 胚ブロックを100%エタノールおよびキシレン(1:1比)溶液に15分間浸漬する。
- ブロックをキシレンに1分間移して、胚組織を透明にする。
- ブロックをキシレンとパラフィン(1:1の比率)に30分間浸します。
- ブロックをパラフィンI、パラフィンII、およびパラフィンIIIに毎回2時間浸漬する。
- 埋め込みボックスを事前にパラフィンで満たしてから、ブロックを埋め込みボックスの底に優しく水平に移します。パラフィンが自然に固化した後、固化したパラフィンブロックは4°Cで保存することができる。
注:埋め込み済みサンプルは、次の手順に従ってクライオセクションで使用できます。胚が上記のようにアガロースで予め包埋された後、試料は単にOCTコンパウンドに包埋される。その後、凍結切除は、日常的な凍結切除プロトコルに従って行うことができる。続いて、切片に定期的な染色アプローチを使用することができる。
- 予め包埋した寒天ブロックを35%エタノール、50%エタノール、75%エタノール、および85%エタノールにそれぞれ15分間浸漬する。その後、95%エタノールおよび100%エタノールに2回浸漬する。
4. ヘマトキシリン-エオジン染色
- ショウジョウバエの胚セクションを準備する。調製した切片を60°Cのオーブンに15分間入れ、次いで切片をキシレンに2回ずつ10分間沈めた。切片を100%エタノールとキシレン(1:1の比率)に2分間1回浸します。
- 切片を100%エタノールI、100%エタノールII、95%エタノール、85%エタノール、75%エタノール、50%エタノール、および蒸留水中で3分間水和させる。
- 切片をヘマトキシリン溶液で2分間染色する。スライドを1%酸アルコール溶液(塩酸1mL、70%エタノール100mL)に素早く浸し、スライドを蒸留水で洗浄します。
- スライドを50%エタノール、75%エタノール、85%エタノール、および95%エタノールに順次浸漬する。
- 切片をエオジン溶液で1分間染色する。
- スライドを95%エタノールI、95%エタノールII、95%エタノールIII、100%エタノールI、100%エタノールII、および100%エタノールIIIで毎回1分間脱水する。
- スライドを100%キシレンI、100%キシレンII、および100%キシレンIIIで毎回5分間クリアします。
- メーカーの指示に従ってニュートラルバルサムでスライドを取り付けます。
5. 過ヨウ素酸-銀メテナミン染色
- ショウジョウバエ胚のパラフィン切片を蒸留水に脱パラフィンして水和させる。
- 切片を1%過ヨウ素酸で室温で15分間酸化する。
- スライドを蒸留水で3回、それぞれ1分間すすいでください。
- スライドを、濾過したての銀メテナミン作業溶液(3%メテナミン、5%硝酸銀、5%ホウ酸ナトリウム溶液)の約40mL中で、60°Cで1時間20分間インキュベートする。 その後、スライドを蒸留水で1分間すすいでください。
- スライドを0.2%塩化金で2分間調子を整え、スライドを蒸留水で1分間すすいでください。
- スライドを3%チオ硫酸ナトリウムに3分間入れ、次いでスライドを蒸留水で1分間すすいだ。
- スライドをヘマトキシリンで30秒間対比染色する。スライドを水道水で3〜5分間洗う。
- スライドを70%エタノール、80%エタノール、95%エタノールI、95%エタノールII、95%エタノールIII、100%エタノールI、および100%エタノールIIでそれぞれ5分間脱水する。
- スライドを100%キシレンI、100%キシレンII、100%キシレンIIIでそれぞれ5分間クリアします。
- メーカーの指示に従ってスライドをニュートラルバルサムに取り付けます。
6. 免疫組織化学
- ショウジョウバエ胚のパラフィン切片を脱パラフィンし、標準プロトコールに従ってPBSに再水和する19。
- スライドをメタノール中の0.3%H2O2で室温で10分間処理し、光を避けてください。
- 適切な抗原賦活緩衝液を植物性蒸し器内のスライドのある容器中で約100°Cに予熱する。容器には蓋も必要です。スライドを容器に入れます。蒸し器のふたを閉めます。
- この時点から20分間、容器を蒸し器に保管してください。スライド容器の蓋は、蒸しプロセス中に水蒸気が入るように完全に締め付けないでください。
- スライドを室温に戻すのを待ってから、PBS-T(Tween-20 搭載のPBS、pH 7.2)でそれぞれ5分間3回、スライドをPBSで3回、それぞれ1分間すすいでください。
- PBS中の1%ウシ血清アルブミン(BSA)でスライドを室温で60分間ブロックする。
- スライドを一次抗体(抗FKBP12 at 1:1000)と共に4°Cまたは室温で一晩4時間インキュベートする。
- スライドをPBS-Tで4回、それぞれ5分間洗浄する。
- 二次抗体(抗ウサギ、1:5,000)と結合させたHRP標識ポリマーでスライドを室温で90分間塗布する。写真の漂白を避けるために、暗闇の中でこれを行います。
- スライドをPBS-Tで3回、それぞれ5分間洗浄します。
- スライドを5%3,3'-ジアミノベンジジン-四塩酸塩(DAB)とともに、顕微鏡下で反応生成物の色が適切になるまで2〜10分間インキュベートする。
- スライドをヘマトキシリンで30秒間対比染色し、スライドを蒸留水で2回ずつ5分間洗浄します。
- スライドを50%エタノール、70%エタノール、90%エタノール、95%エタノール、および100%エタノールでそれぞれ1分間脱水する。
- スライドを100%キシレンI、100%キシレンII、100%キシレンIIIでそれぞれ5分間クリアします。
- メーカーの指示に従ってスライドをニュートラルバルサムに取り付けます。
7. in-situ ハイブリダイゼーション
注: ショウジョウバエ 胚切片は、0.01%ジエチルピロカーボネート(DEPC)処理水で調製した。 in situ ハイブリダイゼーションに使用されるすべてのアクセサリは、事前にDEPC一晩治療を適用する。
- リボプローブ調製
- クローニングしたインサートから下流の制限酵素部位で切断し、5'オーバーハングを作成する制限酵素を用いて鋳型DNAを直線化します。線状化後、フェノール/クロロホルム抽出とその後のエタノール沈殿によって鋳型DNAを精製する。標準プロトコルを使用します。
- 精製した鋳型DNAを1 μgをRNaseフリーの遠沈管に加えます。遠沈管を氷の上に置きます。総容量13μLに十分なDEPC処理水を加える。
- 次に、2 μL の 10x NTP 標識混合物、2 μL の 10x 転写バッファー、1 μL のプロテクター RNase 阻害剤、2 μL の RNA ポリメラーゼ SP6 または RNA ポリメラーゼ T7 の順に試薬を加えます。
- 反応物をピペッティングと遠心分離機ですぐに混合する。37°Cで2時間インキュベートする。
注: インキュベーションを長くしても、標識 RNA の収量は増加しません。反応管に短いスピン(〜800rpm)を印加することは、次のステップに進む前に非常に重要です。このスピンにより、インキュベーションから生成される可能性のあるすべての内容物がチューブの底に来ることができます。 - RNaseフリーDNase Iを2 μL加えて鋳型DNAを除去し、37°Cで15分間インキュベートした。
- 2 μLの200 mM EDTA(pH 8.0)を加えて反応を停止させた。
注: DIG 標識 RNA プローブは、エタノール中で -15 ~ -25 °C で 1 年間保存できます。
- ショウジョウバエ胚部のプレハイブリダイゼーション
- ショウジョウバエ胚の切片を42°Cのオーブンに48時間置く。
- スライドを100%キシレンで10分間2回脱パラフィンします。
- スライドを100%エタノール、95%エタノール、90%エタノール、70%エタノール、および50%エタノールに5分間順次浸漬することによって水和させる。
- スライドをPBS中で5分間3回インキュベートし、固定液/ブアン溶液を組織から除去する。
- スライドを100ミリモル/Lグリシン/PBS溶液で2回、それぞれ5分間洗浄します。
- スライドをPBSで2回、それぞれ5分間洗浄します。
- スライドをPBS中の0.3%Triton X-100と共に15分間インキュベートし、膜を透過させる。
- スライドをPBSで3回、それぞれ5分間洗浄します。
- スライドを15 μg/mL RNaseフリープロテイナーゼKで37°Cで30分間インキュベートします。
- PBS中の4%パラホルムアルデヒドと共にスライドを3分間インキュベートし、消化を停止した。
- スライドをPBSで2回、それぞれ5分間洗浄します。
- スライドを100mMトリエタノールアミン緩衝液(pH8.0)中、0.25%(v/v)無水酢酸と共にそれぞれ5分間2回インキュベートする。
- スライドの湿気室にDEPC水を加えます。20 μLのプレハイブリダイゼーション溶液(100 μg/mLのサケ精子DNAを含む)をスライドに加える。スライドをスライドの湿気室に入れます。スライドを42°Cで4時間インキュベートする。
注:ウェットボックスの蓋の気密性を確保し、プリハイブリダイゼーション溶液およびそれに続くハイブリダイゼーション溶液の組織からの揮発および逸脱を防ぐために、ウェットボックスが常に水平に保たれることが必要である。
- ショウジョウバエ胚部のハイブリダイゼーション
- プレハイブリダイゼーション溶液を除去し、スライドを0.2x SSC(150 mM 塩化ナトリウム、15 mM クエン酸ナトリウム、pH 7.0)でそれぞれ5分間3回洗浄した。組織サンプルの周りの余分な0.2x SSCを拭き取ります。
- 30 μLのプローブハイブリダイゼーション溶液(プレハイブリダイゼーション溶液で希釈して2~6 ngのジゴキシン標識RNAプローブを含む)をピペットで塗布する。スライドをスライド湿気チャンバー内で42°Cで約20時間インキュベートする。
注:最後のノートの提案としてキャップタイトネスを確認してください。さもなければ、プレハイブリダイゼーションまたはプレハイブリダイゼーションのいずれかの漏出から生じるドライアップは、スライド中の擬似陽性を含む汚れたバックグラウンドを生成するであろう。
- 雑種形成
- ハイブリダイゼーション溶液を除去し、スライドを4x SSC溶液で37°Cでそれぞれ15分間4回洗浄した。
- スライドを 20 μg/mL の RNase A を含む 2x SSC 溶液で 37 °C で 30 分間洗浄します。
- スライドを1x SSC溶液で37°Cで15分間洗浄します。
- スライドを0.5x SSC溶液で37°Cで15分間洗浄します。
- スライドを0.1x SSC溶液で37°Cで15分間洗浄します。
- スライドをPBSで3回、それぞれ5分間洗浄します。
- スライドを洗浄バッファー (100 mM マレイン酸、150 mM NaCl、0.3% (v/v) Tween 20、pH 7.5) で 1 分間洗浄します。
- スライドを、新たに調製したブロッキング溶液(Tween 20を含まないマレイン酸緩衝液中の2%ヒツジ血清)100mL中で30分間インキュベートする。
- スライドを20mLの抗体溶液中で45分間インキュベートする。
- 各使用前に元のバイアル瓶に抗体を10,000rpmで5分間遠心分離し、表面から必要量を慎重にピペットでピペットします。抗ジゴキシゲニン-AP 1:5000(150 mU/mL)をブロッキング溶液で希釈する。
- スライドを100mLの洗浄緩衝液でそれぞれ15分間2回洗浄し、未結合の抗体コンジュゲートを除去した。
- スライドを20 mLの検出バッファー(100 mM Tris-HCl、100 mM NaCl、pH 9.5)で2~5分間平衡化します。
- スライドを、新しく調製したカラー基質溶液10mLと共にスライド水分チャンバー内でインキュベートする。反応は数分以内に始まり、16時間後に完了する。発色中は振ったり混ぜたりしないでください。
- スライドを50 mLの蒸留水で5分間洗浄し、反応を停止します。
- サンプルを暗闇の中で一晩乾燥させます。
- スライドを70%エタノール、80%エタノール、90%エタノール、95%エタノール、100%エタノールIおよび100%エタノールII中でそれぞれ3分間脱水する。
- スライドを100%キシレンI、100%キシレンII、100%キシレンIIIでそれぞれ20分間クリアします。
- ニュートラルバルサムでスライドを取り付けます。
- 画像を文書化し、反転顕微鏡とメーカーのソフトウェアで分析します。ImageJを用いて、縦軸に沿った、または胚の微分ゾーン内の正信号の密度に従って分布解析を行う。
注:ステップ7.4.12で新しく調製したカラー基質溶液とのインキュベーションの間、反応色は素眼でも見ることができる。立体視下で発色を検査する方法に関するこの観察。反応色が妥当である一旦、ステップ7.4.13を実施して反応を停止させることができる。
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Representative Results
この図は、高脂質およびキチン含有絨毛膜ショウジョウバエ胚(表1)を検査および実験のためにスライドガラス表面に付着させるという課題を克服するために使用されるプロトコルを記載している。図1に示すクロムミョウバンゼラチンスライドコーティング法を利用して、ショウジョウバエのスライド表面への付着を増強し、図2に示す胚プレエンベデッド法は、4つの初期発生段階(すなわち、合胞胚盤葉、細胞芽細胞、 ショウジョウバエ胚の早期および後期ガストルーラ)。図3は、合胞体および細胞芽細胞胚葉段階で検出されたFKBP12/カルスタビン抗体のタンパク質分布を示す。これらの組織化学的結果から、FKBP12発現は合胞胚葉では分極が少なく(パネルA〜H)、その後、栄養胚葉上皮の下の基底膜内に局在し始め、後極よりも前部でより多くの発現が見られる勾配を形成することがわかる(パネルI〜S)。最終的に、DmFKBP12/カルスタビンタンパク質は、初期および後期のガストラ胚期で観察されたものよりも細胞外分布が少ない原始胚組織の特定の建築成分に制限されるようになる(図4)。興味深いことに、上述の動的タンパク質分布は、DmFKBP12の対応するmRNAレベルを伴わず(図5)、タンパク質発現が未だ未知の転写後分子機構の結果であることを示している。CAGスライドコーティングとプレエンベディングの記載された方法は、カルシウムシグナル伝達におけるDmFKBP12の重要性をさらに調査し、マイクロインジェクションRNA干渉などの他の技術を組み合わせて、このまだ未知の分子メカニズムを発掘することを可能にします19。
本研究では、ショウ ジョウバエ 胚の組織学、組織化学的および免疫組織学的分析のためのクロムミョウバンゼラチンスライドコーティングおよび事前埋め込み法を開発する。このプレエンベディング法を使用して、胚は、縦断断面の分析を可能にするクライオおよびパラフィン切片化の両方のために効果的に収集される。これにより、決定的な発達段階におけるこのタンパク質の進化する発現パターンを記述することができ、タンパク質の発現を腸、脳、および連結神経系などの重要な生理学的システムの発達に結びつけることができた。これらの方法を採用することにより、 ショウジョウバエ 胚の発生期におけるRyR調節タンパク質およびmRNA FKBP12/Calstavinの動的分布を、合胞体および細胞芽細胞胚葉を含む決定的な段階、ならびに胃胞形成の初期段階および後期段階で調べることができました。我々のデータは、FKBP12/カルスタビンタンパク質およびそのRNAが合胞体胚盤皮の非常に早期に検出できることを示した。胚が発達するにつれて、FKBP12は胚葉の上皮の下の基底細胞層においてより密に分布するようになる。FKBP12/カルスタビンタンパク質は、その発現を動的に強化し、気孔、気孔および後腸中腸基礎を含む胚性筋肉含有組織への分布を区別します。芽球胚葉の始まりから胃の後期までのこれらの分布変化は、神経芽細胞、腹側神経、食道上神経節および脳を含む発達中のニューロン系にも記載されている。FKBP12/Calstavinのこれらの動的変化は、発生におけるその重要性を示唆しているが、タンパク質のmRNAレベルには反映されておらず、まだ同定されていないタンパク質発現の調節因子を示唆している。
図1:ショウジョウバエ胚におけるDmFKBP12タンパク質およびmRNAの分布を可視化するために免疫学およびRNAin-situハイブリダイゼーションで使用されるパラフィン切片のクロムミョウバンゼラチン(CAG)コーティング法のスケッチ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:ショウジョウバエ胚の発生におけるFKBP12およびDmFKBP12の発現プロファイルの事前埋め込み方法のスケッチ。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ショウジョウバエ胚の合胞体および細胞芽胞におけるDmFKBP12タンパク質の発現プロファイル。 (A-D)合胞体芽胞のH&E染色。初期合胞体芽胚葉におけるDmFKBP12分布の定量化は、核が分裂下にある初期合胞体芽胚葉が存在するD.(E-G)パネルに提示される。後期合胞体胚葉におけるDmFKBP12分布の定量化はHで提示される。(I-L)細胞芽球のH&E染色。後期細胞芽球におけるDmFKBP12分布の適格性は、L.(M−S)パネルにおいて提示され、細胞芽細胞胚葉におけるDmFKBP12タンパク質の分布を示す。OはM-Nのより大きな図を示す。(P-R)パネルは、M−Oに示される以前の細胞芽球に存在する。初期の細胞胚盤葉におけるDmFKBP12分布の定量は、A、E、I、MおよびPが60μm、B、C、F、J、K、N、QおよびRが40μmであり、GについてOが20μmであるS.スケールバーに提示される。YK、卵黄;CN、切断核;PP、卵の後極;BLD, 芽球皮, 核および細胞;BM、基底膜。データは平均として表され± * p < 0.05、** p < 0.01、*** p < 0.001 。データの定量はImageJで行った。まず、茶色の製品は、他のすべての色を削除するとともに画像に残っていました。第二に、茶色の画像を白黒に変更し、その結果、定量化のためにその密度を計算した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ショウジョウバエ胚の胃突起初期および後期段階におけるDmFKBP12タンパク質の発現プロファイル。A、DおよびGは、胃形成段階におけるショウジョウバエ胚のH&E染色を示す。B、C、E、Fは、胃形成初期におけるDmFKBP12の分布を示す。H、I、およびJ-Lは、胃形成後期におけるDmFKBP12の分布を示す。初期のガストルーラにおけるDmFKBP12分布の定量は、M.A、D、EおよびGのスケールバーは80μmであり、B、C、F、H、IおよびJ-Lは40μmである。NBL、神経芽細胞;ST, ストモダエウム;YK、卵黄;PMG, 後中腸基礎;BR, 脳, 食道上神経節;VNS, 腹側神経系;PV、プロベントリクルス;MUS, 筋肉;MGC、中腸カエカム;AMG, 前中腸ルディピギアン;MMG、中腸内;TR, 気管.データは平均として表され±SEM. ns, 有意ではない;** p < 0.01, *** p < 0.001.データ定量化は、ImageJ 1.50dを用いて、プロダクトブラウンのまま白黒画像に変更し、続いて前図の凡例で説明した白黒の濃度計算により行った。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:ショウジョウバエ胚の胚発生中のDmFKBP12 mRNAのin-situ局在化。Aは、FKBP12 mRNAが胚の細胞質内で発現した場合の合胞胚葉期におけるDmFKBP12 mRNAのin-situ局在を示す。BおよびCは、FKBP12 mRNAが胚盤葉細胞の内限で発現した場合の細胞芽細胞におけるDmFKBP12 mRNAのin-situ局在を示す。DおよびEは、初期の胃形成段階でFKBP12 mRNAのin-situ局在を示す。この段階では、主に発達中の腸に局在しています。F、GおよびHは、mRNAが筋肉および腸内で発現される場合、胃形成後期におけるFKBP12 mRNAのin-situ局在を示す。DmFKBP12 mRNAの陽性対照である。JはDmFKBP12 mRNAのネガティブコントロールである。A、C、E、G、Iのスケールバーは5μm、B、D、F、IおよびJのスケールバーは10μmです。CN、切断核;BLD, 胚盤葉, 核および細胞;CF、前斜め裂、頭蓋骨溝。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 胚期 | 0~2時間(%) | 2~3時間(%) | 3-12 時間 (%) | 12~24時間(%) |
| 合胞体芽胞 | 90.8 | 0 | 0 | 0 |
| 細胞芽細胞 | 6.9 | 91.54 | 0 | 0 |
| 初期のガストルーラ | 2.3 | 4.23 | 91.1 | 0 |
| 後期ガストルーラ | 0 | 4.23 | 8.93 | 93.3 |
表1:ショウジョウバエメラノガスターの発生における異なる段階の胚収集
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Discussion
RyRsおよびIP3Rs媒介性カルシウムシグナル伝達は、脊椎動物および無脊椎動物の両方の多くの生理学的および病理学的プロセスにおける基本的な経路である1,2,3,4。ヒトでは、RyR2遺伝子におけるCPVT関連R4496C変異などの点変異は、心筋細胞の筋小胞体からのカルシウム漏出をもたらし、心機能障害をもたらす。これらの変異は、身体活動中に心臓突然死のリスクが高い不整脈として存在し、この変異を運ぶように操作されたマウスモデルにおいて再現可能である。運動条件下では、このカルシウム漏れ変異を有するマウスは、その野生型の対抗部位によって実証されていない心臓突然死を経験した18、20、21、22。心臓におけるRyRs調節因子であるFKBP12の過剰発現は、マウスモデルにおける心臓死に関連するカリウムチャネルの高い割合と対応しており22、23、FKBP12ノックアウトマウスの表現型と一致した知見10、11。RyR1、RyR2、RyR3を含む哺乳類のRyRとその調節因子FKBPは30年以上にわたって十分に研究されてきたため、心臓病理学、骨格筋機能障害、早期発達と発癌後の脳機能達成に関連するほとんどの議事録が研究の焦点です24,25。
RyRの3つのアイソフォームを有する脊椎動物とは異なり、ショウジョウバエのハエは1つのRyR1,2,3,5しか持たない。最近、ショウジョウバエの胚発生の初期段階においてショウジョウバエRyR(DmRyR)の重要な機能を実証しました。我々は、ショウジョウバエの胚の初期における翻訳レベルと転写レベルの両方でのDmRyR発現を解明した:合胞体芽胞期、芽球胚葉期、および初期ガストラ段階。4つの段階すべてにおいて、DmFKBP12 mRNAは胚全体に均等に分布し、同じレベルにとどまっていたが、遺伝子のタンパク質発現は、発現プロファイルが前方に分極し、次いで特定の細胞層に分布して非常に動的であった19。この出版物で利用した方法論的プロトコルは、大量の代表的結果を得る能力にとって重要でした。
パラフィン切片化は、定量分析のためのタンパク質発現の組織学的検出のための基本的かつ実用的な技術である。パラフィン切片は、成虫昆虫におけるタンパク質発現を研究するための基礎的なツールである。しかし、これらの技術は、脂質が豊富な胚やキチンが豊富な絨毛膜のために、昆虫の発生時に複製することが困難であり、埋め込み、保存、およびスライド取り付けを困難にしている。胚に見られる脂質は、スライドの表面への胚切片の付着を可能にする力に干渉する。絨毛膜に見られるキチンは、胚を化学的および機械的干渉から保護する物理的障壁を提示するが、それはまた、スライドガラスへの胚サンプルの付着を制限する。これらの特性は昆虫の幼虫のより高い生存率を保証するが、それはそれらの in-situ タンパク質およびmRNA発現を研究する能力を大きく妨げる。この問題は、さまざまな方法でトラブルシューティングされています。Tween-20などの表面洗剤の使用は、ショウ ジョウバエ の胚を剥離し、研究に利用可能な胚の数を減少させることが多い。この技術では、 in-situ ハイブリダイゼーション用のmRNAを明らかにするために20時間のインキュベーションが必要ですが、サンプルをスライドからほぼ完全に剥離します。免疫組織化学およびmRNAのアンチセンス特異的認識を行う前にスライドガラスをクロムミョウバンゼラチン(CAG)でコーティングする技術は、胚とスライドガラスとの間の結合を増強することによってこれらの技術的障壁を解決する。
CAG増強付着に加えて、記載された ショウジョウバエ 胚の事前埋め込み技術は、正確に日付の付いたショウ ジョウバエ 胚の多数の収穫を可能にする。これにより、初期胚発生の様々な段階 におけるDmFKBP12/カルスタビン の動的発現を報告することができた。この技術を用いて研究できた最も初期の段階は、分化した分布が少なく、発現レベルが一般的に低い合胞体芽細胞胚葉期である。細胞胚盤葉および胃蓋期の胚を研究することにより、DmFKBP12/Calstavinの一般的なレベルは、胚が発達し、局在し始めるにつれて増加し、最初に前部投票に、次に3層段階の特定の層に局在することを見出した。この新知見は、カルシウムシグナル伝達に関与する FKBP12 が初期発生に重要な役割を果たし、その分化が ショウジョウバエのメラノガスター 発生に重要な役割を果たしていることを示唆している。
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Disclosures
著者らは開示するものは何もありません。
Acknowledgments
この研究は、中国国家自然科学財団(#31771377/31571273/31371256)、国家教育部(#MS2014SXSF038)の外国人特別科学者プログラム、国立教育省中央大学研究基金(#GK201301001/201701005/GERP-17-45)の支援を受け、XZは陝西省教育部の主要プログラム(#2019TS082/2019TS079)の#20JS138の支援を受けています。 陝西省科学技術部自然科学基礎研究プログラム青少年プロジェクト(#2020JQ-885)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| -20°C Refrigerator | Meiling Biology &Medical | DW-YL270 | Used for regent storage |
| -80°C Ultra low temperature refrigerator | Thermo | Forma 90 Series | Used for regent storage |
| Agar | Sigma-Aldrich | WXBB6360V | Preparation of grape juice agar plates |
| Anti-Digoxigenin-AP, Fab fragments | Roche | 11093274910 | For the detection of digoxigenin-labeled compound |
| Biochemical incubator | Shanghai Bluepard Instruments | LRH-250 | In-situ Hybridization |
| Bouin's solution | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 69945460 | Drosophila Embryo Embedding |
| Centrifuge | Eppendorf | 540BH07808 | In-situ Hybridization |
| Centrifuge tube | Denville | C-2170 | Drosophila Embryo Collection |
| Chrome Alum | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10001018 | Coating Slides |
| Constant temperature water bath | Jintan Henfeng Instruments | KW-1000DC | Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Dako REAL EnVision Detection System | Dako | K5007 | In immunohistochemical reaction or in situ hybridization reaction, it binds to the primary antigen antibody, and the target is labeled by staining. |
| DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | In-situ Hybridization |
| DIG RNA Labeling Kit | Roche | 11093274910 | RNA labeling with diagoxigenin-UTP by in vitro transcription with SP6 and T7 RNA polymerase |
| Drosophila melanogaster | Bloomington Stock Center | BDSC_16799, BDSC_19894, BDSC_11664 | The stocks of Drosophila melanogaster mutant |
| Electric blast drying oven | Tianjin Taiste Instruments | 101-0AB | For coating slides and paraffin embedding |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 230251 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| Ethanol | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 100092680 | Paraffin Embedding, Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Gelatin | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10010328 | Coating Slides |
| Gold chloride | Sigma-Aldrich | 379948 | Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | H3136 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| High Pure PCR Product Purification Kit | Roche | 11732668001 | For purification of PCR products |
| Intelligent constant temperature and humidity box | Ningbo Jiangnan Instruments | HWS | For fly maintenance |
| LE Agarose | HyAgarose | 14190108029 | Pre-embedding |
| Methanol | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10014108 | Drosophila Embryo Collection |
| Microscope | ZEISS | Observer.A1 | Hematoxylin-Eosin Staining, Immunohistochemistry, In-situ Hybridization and Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Microscope Slides | MeVid Labware Manufacturing | P105-2001 | Coating Slides |
| Neutral Gum | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10004160 | Hematoxylin-Eosin Staining |
| N-heptane | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 40026768 | Drosophila Embryo Collection |
| Paraffin slicer | Huahai science instrument | HH-2508III | In-situ Hybridization |
| Paraffin | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 69019461 | Paraffin Embedding |
| pH/mV Meter | Sartorius | PB-10 | For determing the pH value of a solution |
| Silver nitrate | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10018461 | Periodic Acid-Silver Methenamine Staining |
| Ultrapure water meter | Thermo | AFXI-0501-P | In-situ Hybridization |
| Xylene | Sinopharm Chemical Reagent at Beijing | 10023418 | Paraffin Embedding |
References
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