Summary
Ett λ-rödmedierat rekombinationssystem användes för att skapa en deletionsmutant av en liten icke-kodande RNA micC.
Abstract
Ett icke-kodande litet RNA (sRNA) är en ny faktor för att reglera genuttryck på posttranskriptionsnivå. Ett slags sRNA MicC, känt i Escherichia coli och Salmonella Typhimurium, kan undertrycka uttrycket av yttre membranproteiner. För att ytterligare undersöka regleringsfunktionen hos micC i Salmonella Enteritidis klonade vi micC-genen i Salmonella Enteritidis-stammen 50336 och konstruerade sedan mutanten 50336Δ micC med λ Red-baserat rekombinationssystem och den kompletterade mutanten 50336Δ micC / p micC som bär rekombinant plasmid pBR322 som uttrycker micC. qRT-PCR-resultat visade att transkriptionen av ompD i 50336Δ micC var 1,3 gånger högre än i vildtypsstammen, medan transkriptionen av ompA och ompC i 50336Δ micC var 2,2 gånger och 3 gånger högre än i vildtypsstammen. Dessa indikerade att micC undertrycker uttrycket av ompA och ompC. I följande studie upptäcktes patogeniciteten hos 50336ΔmicC genom att både infektera 6 veckor gamla Balb/c-möss och 1 dag gamla kycklingar. Resultatet visade att LD 50 av vildtypsstammen 50336, mutanterna 50336Δ micC och 50336Δ micC/pmicC för 6 veckor gamla Balb/c-möss var 12,59 CFU, 5,01 CFU respektive 19,95 CFU. LD50 av stammarna för 1 dag gamla kycklingar var 1,13 x 109 CFU, 1,55 x 10 8 CFU respektive 2,54 x 108 CFU. Det indikerade att deletion av micC förbättrade virulensen hos S. Enteritidis hos möss och kycklingar genom att reglera uttrycket av yttre membranproteiner.
Introduction
Icke-kodande små RNA (sRNA) är 40-400 nukleotider långa, som i allmänhet inte kodar för proteiner men kan transkriberas oberoende i bakteriekromosomer 1,2,3. De flesta sRNA kodas i de intergena regionerna (IGR) mellan genkodande regioner och interagerar med mål-mRNA genom basparningsåtgärder och reglerar målgenuttryck på posttranskriptionsnivå 4,5. De spelar viktiga regleringsroller i substansmetabolism, yttre membranproteinsyntes, kvorumavkänning och virulensgenuttryck5.
MicC är ett 109-nukleotid-litet RNA-transkript närvarande i Escherichia coli och Salmonella enterica serovar Typhimurium, som kan reglera multipelt yttre membranproteinuttryck såsom OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 och Omp36 6,7,8,9. MicC reglerar uttrycket av OmpC genom att hämma ribosombindning till ompC mRNA-ledaren in vitro och det kräver Hfq RNA-chaperon för sin funktion i Escherichia coli6. I Salmonella Typhimurium tystar MicC ompD-mRNA via en ≤12-bp RNA-duplex inom den kodande sekvensen (kodon 23-26) och destabiliserar sedan endonukleolytiskt mRNA7. Denna regleringsprocess stöds av chaperonprotein Hfq10. OmpC är ett rikligt yttre membranprotein som ansågs vara viktigt i miljöer där närings- och toxinkoncentrationerna var höga, till exempel i tarmen6. OmpD-porin är det vanligaste yttre membranproteinet i Salmonella Typhimurium och representerar cirka 1% av det totala cellproteinet11. OmpD är involverat i vidhäftning till humana makrofager och tarmepitelceller12. MicC undertrycker också uttrycket av både OmpC- och OmpD-poriner. Man tror att MicC kan reglera virulens. För att utforska nya målgener som regleras av MicC och studera virulensreglerande funktion hos micC, klonade vi micC-genen i Salmonella Enteritidis (SE) stam 50336 och konstruerade sedan mutanten 50336ΔmicC och den kompletterade mutanten 50336ΔmicC/p micC. Nya målgener screenades med qRT-PCR. Virulensen av 50336ΔmicC detekterades av möss och kycklinginfektioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla försök utfördes i enlighet med Nationella forskningsrådets guide för vård och användning av försöksdjur. Djurvårds- och användningskommittén vid Yangzhou University godkände alla experiment och procedurer som tillämpas på djuren (SYXK2016-0020).
1. Bakteriestammar, plasmider och odlingsförhållanden
- Använd de bakterier och plasmider som anges i tabell 1.
- Odla bakterier i LB-buljong eller på LB-agarplattor vid 37 °C, i närvaro av 50 μg/ml ampicillin (Amp) när så är lämpligt.
- Odlingsstammar som innehåller temperaturkänsliga plasmider används för deletionsmutantkonstruktion vid 30 °C.
2. Klon micC-gen av S. Enteritidis stam 50336
- Baserat på uppströms och nedströms sekvens av micC-genen av S. Typhimurium stam SL1344, designar primers vmicC-F och vmicC-R för att förstärka ett fragment innehållande micC-gen genom PCR med SE50336 genomiskt DNA som mall.
- Blanda 5 μL 10x PCR-reaktionsbuffert, 2 μL dNTP-blandning (2,5 mM), 1 μL vmicC-F- respektive vmicC-R-primrar, 5 μL mall, 1 μL Taq-DNA-polymeras och 35 μLddH2Otillsammans för PCR.
- Använd följande PCR-reaktionsbetingelser:fördenaturering vid 94 °C i 4 minuter; 94 °C i 30 sekunder, 53 °C i 1 min, 72 °C i 1 min i 25 cykler och förlängning vid 72 °C i 10 minuter.
- Sekvensera PCR-produkten för att erhålla micC-gensekvensen .
3. Konstruktion av micC-deletionsmutanten
Den micC-negativa mutanten av Salmonella Enteritidis stam 50336 konstruerades med λ-rödmedierad rekombination enligt beskrivningen tidigare13,14. De primers som används anges i tabell 2.
- Förstärka kloramfenikolkassett innehållande homologifragment av micC-genen .
- Designa micC-F- och micC-R-primrar för att förstärka kloramfenikol (Cm) kassetten från plasmid pKD3, inklusive 50 bp homologiförlängningar från 5' och 3' av micC-genen .
- Extrahera pKD3-plasmiden som PCR-mall.
- Blanda 5 μL 10x PCR-reaktionsbuffert, 2 μL dNTP-blandning (2,5 mM), 1 μL micC-F- respektive micC-R-primrar, 5 μL mall, 1 μL Taq-DNA-polymeras och 35 μLddH2Otillsammans som PCR-reaktionsblandning
- Förstärk cm-kassetten med följande PCR-reaktionsbetingelser: fördenaturering vid 94 °C i 4 minuter; 94 °C i 1 minut, 52 °C i 1 minut, 72 °C i 1 min i 10 cykler. 94 °C i 1 min, 63 °C i 1 min, 72 °C i 1 min i 25 cykler och förlängning vid 72 °C i 10 minuter.
- Upptäck storleken på PCR-produkten genom agarosgelelektrofores. Rena och återvinn PCR-produkten med DNA-gelåtervinningssats och bestäm koncentrationen av DNA med spektrofotometer.
VARNING: PCR måste utföras två gånger. Den första PCR-produkten späddes i förhållandet 1:200 och användes som mall för den sekundära PCR, för att eliminera interferensen av ytterligare rekombination med pKD3-plasmid.
- Konstruera 1st rekombinant stam 50336ΔmicC::cat
- Blanda 100 μL SE50336 kompetenta celler med 5 μL pKD46 plasmid jämnt och inkubera på is i 30 minuter. Värmechocka ovanstående blandning vid 42 °C i 90 sekunder och överför snabbt blandningen till is i 2 minuter för att omvandla pKD46-plasmiden till SE50336. Skärmpositiva kolonier genom odling över natten vid 30 °C på en ampereresistent platta (50 μg/ml).
- Tillsätt 30 mM L-arabinos till SE50336/pKD46 flytande kultur och framkalla rekombinasuttryck genom en 30 °C skakkultur i 1 timme. Förbered sedan kompetenta celler.
- Blanda 100 ng renad PCR-produkt (steg 3.1) och 40 μl SE50336/pKD46-kompetenta celler i en elektrisk stötkopp (t.ex. Bio-Rad). Utför elektrisk stöttransformation med parametrarna spänning 1,8 kV, puls 25 μF och motstånd 200 Ω.
- Efter elektrotransformation, överför blandningen till 1 ml SOC-medium och en skakkultur vid 150 rpm och 30 °C i 1 h. Smörj sedan blandningen på en cm (34 μg/ml) resistent LB-platta och odla vid 37 °C över natten för att screena positiv koloni.
- Odla ovanstående positiva koloni vid 42 °C i 2 timmar. Screena kolonin som är känslig för Amp (50 μg/ml) men resistent mot Cm (34 μg/ml) vid 37 °C över natten för att erhålla den 1:a rekombinanta stammen utan pKD46.
- Identifiera den 1:a rekombinanta stammen 50336ΔmicC::Cat.
- Extrahera 50336ΔmicC::Cat genomiskt DNA som PCR-mall. Använd samma PCR-reaktionskomponenter som i steg 2.1. Utför PCR-reaktionen under samma betingelser som i steg 2.1.
- Upptäck storleken på PCR-produkten genom agarosgelelektrofores och sekvensera PCR-produkten.
- Konstruera deletionsmutant 50336ΔmicC.
- Elektroporat 100 ng plasmid pCP20 till 40 μL 50336ΔmicC::Cat kompetenta celler med parametrarna spänning 1,8 kV, puls 25 μF och resistans 200 Ω, screena positiva transformanter på både amp (50 μg/ml) och cm (34 μg/ml) resistent platta vid 30 °C.
- Överför över positiva transformanter till icke-resistent LB och odla dem över natten vid 42 °C och isolera sedan enskilda kolonier på en LB-platta vid 37 °C. Välj den koloni som är känslig för både Amp och Cm. Denna mutant är micC-deletionsmutanten SE50336Δ micC.
- Verifiera 50336ΔmicC med PCR.
- Extrahera 50336ΔmicC genomiskt DNA som PCR-mall. Blanda 5 μLof 10x PCR-reaktionsbuffert, 2 μL dNTP-blandning (2,5 mM), 1 μL primer vmicC-F, 1 μL primer vmicC-R, 5 μL mall, 1 μL Taq DNA-polymeras och 35 μLddH2Otillsammans för PCR.
- Använd följande PCR-reaktionsbetingelser:fördenaturering vid 94 °C i 4 minuter; 94 °C i 30 sekunder, 53 °C i 1 min, 72 °C i 1 min i 25 cykler och förlängning vid 72 °C i 10 minuter.
4. Konstruktion av micC-kompletterad stam
- Designa primers pBR-micC-F och pBR-micC-R med NheI- och SalI-restriktionsställen.
- Förstärk micC-genen i full längd med flanksekvenser med PCR-reaktionsblandning som innehåller 5 μL SE50336 genomiskt DNA som mall, primrar 1 μL pBR-micC-F och 1 μL pBR-micC-R som primrar, 5 μLof 10x PCR-reaktionsbuffert, 2 μL dNTP-blandning (2,5 mM), 2 μL dNTP-blandning (2,5 mM) och 35 μLddH2O.
- Använd följande PCR-reaktionsbetingelser: fördenaturering vid 94 °C i 4 minuter; 94 °C i 30 sekunder, 52 °C i 50 sekunder, 72 °C i 1 min i 25 cykler och förlängning vid 72 °C i 10 minuter. Rena och återvinn PCR-produkten.
- Smält PCR-produkten respektive plasmiden pBR322 med restriktionsenzymet NheI och SalI och ligera dem med T4-ligas vid 16 °C över natten för att erhålla plasmiden pBR322-micC.
- Omvandla pBR322-micC till SE50336ΔmicC-kompetenta celler och screena positiv transformant för att erhålla den kompletterade stammen SE50336ΔmicC/pmicC. Extrahera plasmiden pBR322-micC från kompletterad stam och verifiera den genom restriktionsenzymuppslutning och sekvensering.
5. RNA-isolering och kvantitativ realtids-PCR
- Kultur SE50336, 50336ΔmicC och 50336ΔmicC/pmicC i LB-medium över natten vid 24 °C med 180 rpm skakodling till en OD600 av 2,0. Samla bakteriekultur genom centrifugering vid 13000 rpm i 2 min.
- Extrahera totalt RNA med TRIzol-reagens. Inkubera 50 μL isolerat RNA med 2 μL DNaseI och 6 μL 10x buffert vid 37 °C i 30 minuter för att avlägsna DNA. Bestäm RNA-kvantiteten genom att pipettera 1 μL RNA-prov till en mikrospektrofotometer.
- Syntes av cDNA
- Använd 1 μg totalt RNA för cDNA-syntes i 20 μL omvänd transkriptionsreaktionssystem (4 μL 5x buffert, 1 μL RT-enzymblandning, 1 μL RT-primerblandning, 10 μL totalt RNA och 4 μLddH2O). Inkubera ovanför reaktionssystemet vid 37 °C i 15 minuter och därefter vid 85 °C i 5 sekunder.
- Designa primers baserat på sekvensen av målgener ompA, ompC och ompD. Utför omvänd transkription-PCR med hjälp av ett RT-reagenskit. PCR-reaktionskomponenterna innehåller 2,5 μLof 10x PCR-reaktionsbuffert, 1 μL dNTP-blandning (2,5 mM), 1 μL målgen (ompA, ompC eller ompD) primrar, 2,5 μL mall, 0,5 μL Taq DNA-polymeras och 17,5 μL ddH2O.
- Använd följande PCR-reaktionsbetingelser:fördenaturering vid 94 °C i 4 minuter; 94 °C i 30 sekunder, 60 °C i 1 min, 72 °C i 1 min i 25 cykler och förlängning vid 72 °C i 10 minuter.
- Utför realtids-PCR med SYBR grönt RT-PCR-kit i ett RT-PCT-instrument i tre exemplar.
- Använd följande PCR-reaktionskomponenter: 10 μL 2x SYBR-buffert, 0,4 μLof framåtprimer respektive omvänd primer, 0,4 μL RoxDye II, 2 μLof cDNA och 6,8 μL RNasfriH2O.
- Använd följande PCR-reaktionsbetingelser:fördenaturering vid 95 °C i 1 min i en cykel; 95 °C i 5 s, 60 °C i 34 s i 40 cykler.
- Normalisera alla data till den endogena referensgenen gyrA. Använd 2-Δ Δ CT-metoden för datakvantifiering15.
6. Virulensanalyser
- Kultur SE50336, 50336ΔmicC och 50336ΔmicC/pmicC i LB-medium till tidig stationär fas (OD600 av 2-3) vid 24 °C, skörd genom centrifugering och späd till lämplig CFU ml-1 i steril PBS.
- För musinfektioner, späd de odlade stammarna till 10 CFU/200 μL, 102 CFU/200 μL och 103 CFU/200 μL gradientresuspensioner. Infektera grupper av fem 6-8 veckor gamla Balb / c-möss per stam genom subkutan injektion. Injicera kontrollgruppen med 200 μl fysiologisk saltlösning.
- För kycklinginfektioner, späd över tre stammar till 107 CFU/200 μL, 108 CFU/200 μL och 109 CFU /200 μL gradientresuspensioner. Infektera grupper av tjugo 1 dagar gamla kycklingar per stam genom subkutan injektion.
- Övervaka tecken på sjukdom och död hos försöksdjur dagligen. Beräkna LD50 (median dödlig dos) 14 d efter infektion enligt beskrivningen tidigare16. Bearbeta data med hjälp av dataanalysprogramvara.
- I infektionsgrupper, samla hjärta, lever, mjälte, lunga och njure av nydöda kycklingar. Väg 0,5 g av ovanstående vävnader separat och slipa dem med steril drift. Späd proverna gradvis, sprid dem på LB-plattan och odla i 8-10 timmar vid 37 °C. Registrera mängden salmonellastammar koloniserade i kycklingvävnader.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Konstruktion av mutanten 50336Δ micC och kompletterad stam 50336Δ micC /p micC
MicC-genklonresultatet indikerade att denna gen bestod av 109 bp som visade 100% identitet med S. Typhimurium. Baserat på sekvensdata konstruerades deletionsmutanten 50336ΔmicC och den kompletterade mutanten 50336ΔmicC/pmicC framgångsrikt. I detalj visade sekvenseringsresultaten att en 1,1 kb Cm motståndskassett förstärktes och användes för att konstruera 1: a rekombinanten. Denförsta rekombinanta 50336ΔmicC::cat validerades genom PCR med användning av primrar vmicC-F och vmicC-R med en förväntad bandstorlek på cirka 1200 bp PCR-produkter med Cm-insättning jämfört med 279 bp PCR-produkter i vildtypsstam (figur 1). I den andra rekombinationen eliminerades Cm-kassetten med pCP20. PCR-resultaten i kombination med sekvensering bekräftade att den isogena micC-mutanten konstruerades framgångsrikt och namngavs som 50336ΔmicC (figur 1).
MicC reglerar genuttrycket ompA, ompC och ompD
För att bestämma målen för MicC analyserades uttrycket av ompA-, ompC- och ompD-gener i SE-stammarna 50336, 50336ΔmicC och 50336ΔmicC/p micC genom kvantitativ PCR i realtid med gyrA som normaliserande intern standard. Resultaten visade att transkriptionen av ompA och ompC i 50336ΔmicC ökade ungefär 2,2 gånger och 3 gånger än i vildtypsstammen, medan ompD i 50336ΔmicC ökade något (1,3 gånger) än i vildtypsstam (figur 2). Det indikerade att micC kunde undertrycka uttrycket av ompA, ompC och ompD. OmpA var förmodligen en potentiell ny målgen som reglerades direkt av micC.
Om du tar bort micC förbättras S. Enteritidisvirulens hos möss och kycklingar
Vi utförde LD50-analyser för att kvantifiera effekten av att radera micC på S. Enteritidis virulens hos möss och kycklingar. Efter att ha infekterat 6-8 veckor gamla Balb / c-möss med 103 CFU av var och en av de tre stammarna observerade vi att de flesta möss infekterade av 50336ΔmicC visade trötthet, aptitlöshet eller diarré 48 timmar efter infektion och tycktes dö i följd 96 timmar efter infektion. Medan mössen infekterade av WT-stam och 50336ΔmicC / pmicC uppvisade ovanstående symtom 72 timmar efter infektion och var döda 120 timmar efter infektion. LD50s beräknades 7 d efter infektion. Resultaten visade att LD50 av WT-stammen 50336, 50336ΔmicC och 50336ΔmicC / pmicC för möss var 12.59, 5.01 respektive 19.95 CFU. Det indikerade att virulensen hos mutanten 50336ΔmicC ökade 2,5 gånger jämfört med WT hos möss (tabell 3). Efter att ha infekterat 1 dag gamla kycklingar med 109 CFU av var och en av de tre stammarna, visade de flesta kycklingar tarmhyperemi och diarré 10 h efter infektion. Vid infektion med 108 CFU visade kycklingarna infekterade med 50336ΔmicC högre dödlighet jämfört med WT-stam och 50336ΔmicC/pmicC. LD50s beräknades för 14 d efter infektion. Resultaten visade att LD 50 av WT-stammen 50336, 50336ΔmicC och 50336ΔmicC/pmicC för kycklingar var 1,13×109, 1,55×10 8 respektive2,54×10 8 CFU. Det indikerade att radering av micC också förbättrade virulensen hos S. Enteritidis hos kycklingar. Alla tre stammar av S. enteritidis återfanns från levern, mjälten, och caecum av de infekterade kycklingarna.
Figur 1: PCR-verifiering av 50336ΔmicC-mutanterna med primrar vmicC-F och vmicC-R. En 280 bp PCR-produkt erhölls när vildtypen 50336 genom som mall (körfält 1). När CM-kassettgenen sattes in i genomet av S. Enteritidis, denförsta rekombinanta 50336Δmic::cat verifierades med PCR och en 1100 bp PCR-produkt erhölls (bana 2). CM-kassettgenen för 50336Δmic::cat skars ut genom att introducera FLP-rekombinasuttryckande vektorn pCP20 och denandra rekombinanta 50336Δ-mikrofonen erhölls och verifierades med PCR (bana 3). M: molekylär massmarkör. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Veckförändringar av mRNA-nivån hos ompA-, ompC- och ompD-generna bestämdes i den muterade 50336 Δ-mikrofonen och kompletterade stammen 50336Δmic/p-mikrofonen med kvantitativ RT-PCR jämfört med vildtypsstammen. Analyser utfördes i tre exemplar. 2-ΔΔCT-metoden användes för kvantifiering av data. *Indikerar statistiskt signifikant skillnad jämfört med vildtypsstammen (p<0.05) Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Stammar/plasmider | Karakteristika | Referenser |
| Stammar | ||
| CMCC(B)50336 | Salmonella enterica serovar Enteritidis vildtyp | NICPBP, Kina |
| 50336ΔmicC | micC-bristfällig mutant | Denna studie |
| 50336ΔmicC/pmicC | 50336Δ micC som bär pBR-micC (Ampr) | Denna studie |
| Plasmider: | ||
| pKD3 | Cmr; Cm kassett teplate | [13] |
| pKD46 | Ampr, λRött rekombinasuttryck | [13] |
| pCP20 | Amp r, Cmr; Flp rekombinasiskt uttryck | [13] |
| pBR-micC | pBR322 som bär hela micC-genen (Ampr) | Denna studie |
| pGEM-T Lätt | kloningsvektor, Ampr | Takara |
| pMD19 T-enkel | kloningsvektor, Ampr | Takara |
Tabell 1. Bakteriestammar och plasmider som används i denna studie.
| Abc-bok | Sekvens (5'-3') | Produktens storlek (bp) | ||||||
| micC-F | TGTCAGGAAAGACCTAAAAAGAGATGTTACCGTTTAATTCAATAATTAATTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG | 1114 | ||||||
| micC -R | TGGAAATAAAAAAAGCCCGAACATCCGTTCGGGCTTGTCAATTTATACCATATGAATATCCTCCTTAG | |||||||
| vmicC -F | AGCGAGTTGACGTTAAAACGTTAT | 279/140 | ||||||
| vmicC -R | TTCGTTCGGGCTTGTCAATTTATA | |||||||
| pBR-micC-F | CAGGCTAGCCACTTTATGTACAATGACATACGTCAC | 434 | ||||||
| pBR-micC-R | CAGGTCGACAAATATTCTAAGGATTAACCTGGAAAC | |||||||
| ompA-F | ACTGAACGCCCTGAGCTTTA | 177 | ||||||
| ompA-R | ACACCGGCTTCATTCACAAT | |||||||
| ompC-F | AAAGTTCTGCGCTTTGTGTTGG | 187 | ||||||
| ompC-R | CGCTGACGAACACCTGTATG | |||||||
| ompD-F | ACGGTCAGACTTCGCATAGG | 184 | ||||||
| ompD-R | TGTTGCCACCTACCGTAACA | |||||||
| gyrA-F | GCATGACTTCGTCAGAACCA | 278 | ||||||
| gyrA-R | GGTCTATCAGTTGCCGGAAG | |||||||
Tabell 2. Primers som används i denna studie
| Stammar | LD50 för möss (CFU) | Förbättring av vikning | LD50 för kycklingar (CFU) | Förbättring av vikning |
| S. Enteritidis 50336 | 12.59 | 1 | 1.13×109 | 1 |
| 50336ΔmicC | 5.01 | 2.51 | 1.55×108 | 7.29 |
| 50336Δ micC/pmicC | 19.95 | 0.63 | 2.54×108 | 4.45 |
| Negativ kontroll | 0 | / | 0 | / |
Tabell 3. Virulensegenskaper hos S. Enteritidis 50336 stammar hos möss och kycklingar
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
S. Enteritidis är en viktig fakultativ intracellulär patogen som kan infektera unga kycklingar och ger symtom från enterit till systemisk infektion och död17,18. Dessutom orsakar S. Enteritidis latenta infektioner hos vuxna kycklingar och kroniska bärare förorenar fjäderfäprodukter, vilket resulterar i livsmedelsburna infektioner hos människor19. Den patogena mekanismen för S. enteritidis återstår att undersökas ytterligare. Hittills har vissa sRNA som IsrJ, SroA och IsrM visat sig påverka Salmonella virulens20,21,22,23. Den icke-kodande lilla RNA micC-genen identifierades i många enterobakterier såsom Escherichia coli, Salmonella Typhimurium, Salmonella Bongori och Shigella flexneri 6,7,24. Här fann vi att sekvensen av micC i S. Enteritidis 50336 var densamma som i S. Typhimurium. Det indikerar att MicC är ett konservativt sRNA i enterobakterier.
Att undersöka om MicC förmedlar virulens i S. Enteritidis för djur och identifiera MicC-mål, konstruerade vi deletionsmutanten 50336ΔmicC och den kompletterade mutanten 50336ΔmicC / p micC som uttrycker micC framgångsrikt. Resultaten av qRT-PCR indikerade att micC kunde undertrycka uttrycket av ompA och ompC. OmpA är förmodligen ett potentiellt nytt mål för MicC. RNA RybB kunde undertrycka syntesen av OmpA genom basparning med de 5'-otolkade regionerna (5' UTR) av mål-ompA-mRNA 25. MicA-sRNA underlättar också snabbt sönderfall av ompA-mRNA genom antisensparning på samma sätt som RybB25,26. Huruvida MicC använder liknande regleringsmekanism för att reglera ompA är inte känt och återstår att studera inom en snar framtid. I E. coli ökade deletionen av MicC uttrycket av ompC 1,5- till 2-faldigt. Ytterligare studier visade att MicC visade sig hämma ribosombindning till ompC mRNA 5'-ledaren6. Dessutom fann Pfeiffer att OmpC var huvudmålet för MicC7. Det antas att MicC reglerar ompC i en liknande mekanism i S. Enteritidis med det i E. coli och S. Typhimurium. Förutom OmpA och OmpC kan MicC också undertrycka uttrycket av OmpD. Resultatet visade att transkriptionen av ompD i 50336ΔmicC ökade något (1,3-faldigt) än i vildtypsstam. Baserat på ovanstående resultat visade det att MicC kunde undertrycka transkriptionen av flera mål-mRNA (ompA, ompC och ompD) i S. Enteritidis. MicC är inte det enda sRNA som kan reglera flera mål. Vissa sRNA som RybB, DsrA, GcvB, RNAIII och RyhB verkar också på flera mål 25,27,28,29,30,31. Eftersom sRNA reglerar mål genom basparningsmekanism för att uppnå sRNA-målinteraktioner32, är det möjligt att bevarade delregioner eller domäner av sRNA kan binda till olika mål.
Det yttre membranet hos gramnegativa bakterier är ett viktigt gränssnitt i värd-patogeninteraktioner. OmpA, OmpC och OmpD är alla viktiga och rikliga yttre membranproteiner. OmpC spelar en viktig roll i avskyvärd miljö som i tarmen6. OmpD är involverat i vidhäftning till humana makrofager och tarmepitelceller12. Man trodde att förändringen av OMP-uttryck orsakad av MicC-radering kunde påverka virulensen hos S. Enteritidis och MicC ackumulerade i stationära fasceller och särskilt under tillväxtförhållanden inducerade Salmonella SPI-1 och SPI-2 virulensgener7. Man tror att MicC är relaterat till virulens i Salmonella, medan djurinfektionsexperiment utfördes för att detektera virulens av MicC. Resultaten visade att LD50 av mutanterna 50336ΔmicC för 1 dag gamla kycklingar och 6 veckor gamla Balb/c-möss båda minskade tydligt jämfört med vildtypsstammen. Det indikerade att radering av micC förbättrade virulensen hos S. Enteritidis hos möss och kycklingar. Det antas att ökningen av OmpA, OmpC och OmpD-uttryck, som orsakas av MicC-deletion, leder till virulensförbättring i S. Enteritidis.
MicC reglerar S negativt. Enteritidis virulens hos möss och kycklingar, troligen genom nedreglering av uttrycket av de viktigaste yttre membranproteinerna OmpA och OmpC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av bidrag från Chinese National Science Foundation (nr 31972651 och 31101826), Jiangsu High Education Science Foundation (No.14KJB230002), State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology (No.SKLVBF201509), Nature Science Foundation Grant of Yangzhou (No.YZ2014019), ett projekt finansierat av Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| dextrose | Sangon Biotech | A610219 | for broth preparation |
| DNA purification kit | TIANGEN | DP214 | for DNA purification |
| Ex Taq | TaKaRa | RR01A | PCR |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017608 | for broth preparation |
| K2HPO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 20032116 | for broth preparation |
| L-Arabinose | Sangon Biotech | A610071 | λ-Red recombination |
| Mini Plasmid Kit | TIANGEN | DP106 | plasmid extraction |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | for broth preparation |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10002917 | for broth preparation |
| PrimeScriptRRT reagent Kit with gDNA Eraser | TaKaRa | RR047 | qRT-PCR |
| SYBRR Premix Ex Taq II | TaKaRa | RR820 | qRT-PCR |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202 | Ligation |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | RNA isolation |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | for broth preparation |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | for broth preparation |
| centrifuge | Eppendorf | 5418 | centrifugation |
| Electrophoresis apparatus | Bio-Rad | 164-5050 | Electrophoresis |
| Electroporation System | Bio-Rad | 165-2100 | for bacterial transformation |
| Spectrophotometer | BioTek | Epoch | Absorbance detection |
| Real-Time PCR system | Applied Biosystems | 7500 system | qRT-PCR |
References
- Jørgensen, M. G., Pettersen, J. S., Kallipolitis, B. H. sRNA-mediated control in bacteria: An increasing diversity of regulatory mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta-Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (5), 194504 (2020).
- Wagner, E. G. H., Romby, P. Small RNAs in bacteria and archaea: who they are, what they do, and how they do it. Advances In Genetics. 90, 133-208 (2015).
- Vogel, J. A rough guide to the non-coding RNA world of Salmonella. Molecular Microbiology. 71 (1), 1-11 (2009).
- Dutta, T., Srivastava, S. Small RNA-mediated regulation in bacteria: A growing palette of diverse mechanisms. Gene. 656, 60-72 (2018).
- Waters, L. S., Storz, G.
- Chen, S., Zhang, A., Blyn, L. B., Storz, G. MicC, a second small-RNA regulator of Omp protein expression in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 186 (20), 6689-6697 (2004).
- Pfeiffer, V., Papenfort, K., Lucchini, S., Hinton, J. C., Vogel, J. Coding sequence targeting by MicC RNA reveals bacterial mRNA silencing downstream of translational initiation. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (8), 840-846 (2009).
- Dam, S., Pagès, J. M., Masi, M. Dual Regulation of the Small RNA MicC and the Quiescent Porin OmpN in Response to Antibiotic Stress in Escherichia coli. Antibiotics (Basel). 6 (4), 33 (2017).
- Hao, M., et al. Porin Deficiency in Carbapenem-Resistant Enterobacter aerogenes Strains. Microbial Drug Resistance. 24 (9), 1277-1283 (2018).
- Wroblewska, Z., Olejniczak, M. Hfq assists small RNAs in binding to the coding sequence of ompD mRNA and in rearranging its structure. RNA. 22 (7), 979-994 (2016).
- Santiviago, C. A., Toro, C. S., Hidalgo, A. A., Youderian, P., Mora, G. C. Global regulation of the Salmonella enterica serovar typhimurium major porin, OmpD. Journal of Bacteriology. 185 (19), 5901-5905 (2003).
- Hara-Kaonga, B., Pistole, T. G. OmpD but not OmpC is involved in adherence of Salmonella enterica serovar typhimurium to human cells. Canadian Journal of Microbiology. 50 (9), 719-727 (2004).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).
- Meng, X., et al. The RNA chaperone Hfq regulates expression of fimbrial-related genes and virulence of Salmonella enterica serovar Enteritidis. FEMS Microbiology Letters. 346 (2), 90-96 (2013).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Vander Velden, A. W., Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Heffron, F. Multiple fimbrial adhesins are required for full virulence of Salmonella typhimurium in mice. Infection and Immunity. 66 (6), 2803-2808 (1998).
- Prescott, J. F. Salmonella enterica serovar enteritidis in humans and animals: Epidemiology, pathogenesis, and control. Canadian Veterinary Journal La Revue Veterinaire Canadienne. 40 (10), 736 (1999).
- Balasubramanian, R., et al. The global burden and epidemiology of invasive non-typhoidal. Hum Vaccin Immunother. 15 (6), 1421-1426 (2019).
- De Buck, J., Van Immerseel, F., Haesebrouck, F., Ducatelle, R. Colonization of the chicken reproductive tract and egg contamination by Salmonella. Journal of General and Applied Microbiology. 97 (2), 233-245 (2004).
- Padalon-Brauch, G., et al. Small RNAs encoded within genetic islands of Salmonella typhimurium show host-induced expression and role in virulence. Nucleic Acids Research. 36 (6), 1913-1927 (2008).
- Santiviago, C. A., et al. Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice. PLoS Pathogens. 5 (7), 1000477 (2009).
- Gong, H., et al. A Salmonella small non-coding RNA facilitates bacterial invasion and intracellular replication by modulating the expression of virulence factors. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002120 (2011).
- Hébrard, M., et al. sRNAs and the virulence of Salmonella enterica serovar Typhimurium. RNA Biology. 9 (4), 437-445 (2012).
- Vogel, J., Papenfort, K. Small non-coding RNAs and the bacterial outer membrane. Current Opinion in Microbiology. 9 (6), 605-611 (2006).
- Papenfort, K., et al. SigmaE-dependent small RNAs of Salmonella respond to membrane stress by accelerating global omp mRNA decay. Molecular Microbiology. 62 (6), 1674-1688 (2006).
- Udekwu, K. I., et al. Hfq-dependent regulation of OmpA synthesis is mediated by an antisense RNA. Genes and Development. 19 (19), 2355-2366 (2005).
- Papenfort, K., Vogel, J. Multiple target regulation by small noncoding RNAs rewires gene expression at the post-transcriptional level. Research in Microbiology. 160 (4), 278-287 (2009).
- Lease, R. A., Cusick, M. E., Belfort, M. Riboregulation in Escherichia coli: DsrA RNA acts by RNA:RNA interactions at multiple loci. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (21), 12456-12461 (1998).
- Sharma, C. M., Darfeuille, F., Plantinga, T. H., Vogel, J. A small RNA regulates multiple ABC transporter mRNAs by targeting C/A-rich elements inside and upstream of ribosome-binding sites. Genes and Development. 21 (21), 2804-2817 (2007).
- Boisset, S., et al. Staphylococcus aureus RNAIII coordinately represses the synthesis of virulence factors and the transcription regulator Rot by an antisense mechanism. Genes and Development. 21 (11), 1353-1366 (2007).
- Massé, E., Vanderpool, C. K., Gottesman, S. Effect of RyhB small RNA on global iron use in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 187 (20), 6962-6971 (2005).
- Papenfort, K., Vogel, J.
