Summary
Et λ-rødmedieret rekombinationssystem blev brugt til at skabe en deletionsmutant af en lille ikke-kodende RNA-micC.
Abstract
Et ikke-kodende lille RNA (sRNA) er en ny faktor til regulering af genekspression på posttranskriptionelt niveau. En slags sRNA MicC, kendt i Escherichia coli og Salmonella Typhimurium, kunne undertrykke ekspressionen af ydre membranproteiner. For yderligere at undersøge reguleringsfunktionen af micC i Salmonella Enteritidis klonede vi micC-genet i Salmonella Enteritidis-stammen 50336 og konstruerede derefter mutanten 50336Δ micC af λ Red-baseret rekombinationssystem og den komplementerede mutant 50336Δ micC/p micC, der bærer rekombinant plasmid pBR322, der udtrykker micC. qRT-PCR-resultater viste, at transkription af ompD i 50336Δ micC var 1,3 gange højere end i vildtypestammen, mens transkriptionen af ompA og ompC i 50336ΔmicC var 2,2 gange højere end dem i vildtypestammen. Disse indikerede, at micC undertrykker ekspressionen af ompA og ompC. I den følgende undersøgelse blev patogeniciteten af 50336ΔmicC påvist af både inficerende 6 uger gamle Balb / c-mus og 1 dag gamle kyllinger. Resultatet viste, at LD 50 af vildtypestammen 50336, mutanterne 50336Δ micC og 50336Δ micC/pmicC for 6 uger gamle Balb/c mus var henholdsvis 12,59 CFU, 5,01 CFU og 19,95 CFU. LD50 af stammerne til 1 dag gamle kyllinger var henholdsvis 1,13 x 109 CFU, 1,55 x 10 8 CFU og 2,54 x 108 CFU. Det indikerede, at sletning af micC øgede virulensen af S. Enteritidis hos mus og kyllinger ved at regulere ekspression af ydre membranproteiner.
Introduction
Ikke-kodende små RNA'er (sRNA'er) er 40-400 nukleotider lange, som generelt ikke koder for proteiner, men kan transkriberes uafhængigt i bakteriekromosomer 1,2,3. De fleste sRNA'er er kodet i de intergene regioner (IGR'er) mellem genkodende regioner og interagerer med mål-mRNA'er gennem baseparringshandlinger og regulerer målgenekspression på posttranskriptionsniveau 4,5. De spiller vigtige reguleringsroller i stofmetabolisme, proteinsyntese i ydre membran, quorum sensing og virulens genekspression5.
MicC er et 109-nukleotid lille RNA-transkript til stede i Escherichia coli og Salmonella enterica serovar Typhimurium, som kunne regulere flere ydre membranproteinekspressioner såsom OmpC, OmpD, OmpN, Omp35 og Omp36 6,7,8,9. MicC regulerer ekspressionen af OmpC ved at hæmme ribosombinding til ompC mRNA-lederen in vitro, og det kræver Hfq RNA-chaperon for dets funktion i Escherichia coli6. I Salmonella Typhimurium tavsgør MicC ompD mRNA via en ≤12-bp RNA duplex inden for kodningssekvensen (kodoner 23-26) og destabiliserer derefter endonukleolytisk mRNA7. Denne reguleringsproces assisteres af chaperonprotein Hfq10. OmpC er et rigeligt ydre membranprotein, der blev anset for at være vigtigt i miljøer, hvor næringsstof- og toksinkoncentrationer var høje, såsom i tarmen6. OmpD porin er det mest rigelige ydre membranprotein i Salmonella Typhimurium og repræsenterer ca. 1% af det samlede celleprotein11. OmpD er involveret i overholdelse af humane makrofager og intestinale epitelceller12. MicC undertrykker også udtrykket af både OmpC og OmpD poriner. Det menes, at MicC kan regulere virulens. For at udforske nye målgener reguleret af MicC og studere virulensreguleringsfunktionen af micC, klonede vi micC-genet i Salmonella Enteritidis (SE) stammen 50336 og konstruerede derefter mutanten 50336ΔmicC og den komplementerede mutant 50336ΔmicC / p micC. Nye målgener blev screenet af qRT-PCR. Virulensen af 50336ΔmicC blev påvist af mus og kyllingeinfektioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøgene blev udført i overensstemmelse med Det Nationale Forskningsråds vejledning for pleje og brug af forsøgsdyr. Dyrepleje- og brugsudvalget ved Yangzhou University godkendte alle forsøg og procedurer, der blev anvendt på dyrene (SYXK2016-0020).
1. Bakteriestammer, plasmider og kulturbetingelser
- Brug de bakterier og plasmider, der er anført i tabel 1.
- Kulturbakterier i LB-bouillon eller på LB-agarplader ved 37 °C under tilstedeværelse af 50 μg/ml ampicillin (Amp), når det er relevant.
- Kulturstammer indeholdende temperaturfølsomme plasmider anvendes til deletion mutant konstruktion ved 30 °C.
2. Klon micC gen af S. Enteritidis stamme 50336
- Baseret på opstrøms og nedstrøms sekvens af micC gen af S. Typhimurium stamme SL1344, design primere vmicC-F og vmicC-R til at amplificere et fragment indeholdende micC gen ved PCR ved hjælp af SE50336 genomisk DNA som skabelon.
- Bland 5 μL 10x PCR-reaktionsbuffer, 2 μL dNTP-blanding (2,5 mM), 1 μL henholdsvis vmicC-F- og vmicC-R-primere, 5 μL skabelon, 1 μL Taq DNA-polymerase og 35 μL ddH2O sammen til PCR.
- Brug følgende PCR-reaktionsbetingelser:prædenaturering ved 94 °C i 4 minutter; 94 °C i 30 sekunder, 53 °C i 1 min, 72 °C i 1 min i 25 cyklusser og forlængelse ved 72 °C i 10 min.
- PCR-produktet sekventeres for at opnå micC-gensekvensen .
3. Konstruktion af micC-deletionsmutanten
BEMÆRK: Den micC-negative mutant af Salmonella Enteritidis stamme 50336 blev konstrueret ved hjælp af λ-rødmedieret rekombination som beskrevet tidligere13,14. De anvendte primere er anført i tabel 2.
- Forstærk chloramphenicolkassette indeholdende homologifragmenter af micC-genet .
- Design micC-F og micC-R-primere til at forstærke chloramphenicol (Cm) kassetten fra plasmidet pKD3, herunder 50 bp homologiforlængelser fra 5' og 3' af micC-genet .
- Uddrag pKD3-plasmidet som PCR-skabelon.
- Bland 5 μL 10x PCR-reaktionsbuffer, 2 μL dNTP-blanding (2,5 mM), 1 μL micC-F- og micC-R-primere, henholdsvis 5 μL skabelon, 1 μL Taq DNA-polymerase og 35 μL ddH2O sammen som PCR-reaktionsblanding
- Cm-kassetten forstærkes med følgende PCR-reaktionsbetingelser: prædenaturering ved 94 °C i 4 min; 94 °C i 1 min, 52 °C i 1 min, 72 °C i 1 min i 10 cyklusser; 94 °C i 1 min, 63 °C i 1 min, 72 °C i 1 min i 25 cyklusser og forlængelse ved 72 °C i 10 min.
- Detekter størrelsen af PCR-produktet ved agarosegelelektroforese. Oprens og genvind PCR-produkt med DNA-gelgendannelsessæt, og bestem koncentrationen af DNA ved spektrofotometer.
FORSIGTIG: PCR skal udføres to gange. Det første PCR-produkt blev fortyndet i forholdet 1:200 og anvendt som skabelon for den sekundære PCR for at eliminere interferensen af yderligere rekombination med pKD3-plasmid.
- Konstruere 1. rekombinant stamme 50336ΔmicC::cat
- Bland 100 μL SE50336 kompetente celler med 5 μL pKD46 plasmid ensartet og inkuber på is i 30 min. Varmechok ovennævnte blanding ved 42 °C i 90 sekunder, og overfør hurtigt blandingen til is i 2 minutter for at omdanne pKD46-plasmidet til SE50336. Screene positive kolonier ved dyrkning natten over ved 30 °C på en Amp-resistent plade (50 μg/ml).
- Der tilsættes 30 mM L-arabinose til SE50336/pKD46 flydende kultur, og der induceres rekombinaseekspression ved en rystekultur på 30 °C i 1 time. Forbered derefter kompetente celler.
- Bland 100 ng renset PCR-produkt (trin 3.1) og 40 μL SE50336/pKD46 kompetente celler i en elektrisk stødkop (f.eks. Bio-Rad). Udfør elektrisk stødtransformation med parametrene spænding 1,8 kV, puls 25 μF og modstand 200 Ω.
- Efter elektrotransformation overføres blandingen til 1 ml SOC-medium og en rystekultur ved 150 rpm og 30 °C i 1 time. Smør derefter blandingen på en Cm (34 μg/ml) resistent LB-plade og kultur ved 37 °C natten over for at screene positiv koloni.
- Ovennævnte positive koloni dyrkes ved 42 °C i 2 timer. Skærm kolonien, der er følsom over for Amp (50 μg/ml), men modstandsdygtig over for Cm (34 μg/ml) ved 37 °C natten over for at opnå den 1. rekombinante stamme uden pKD46.
- Identificer den 1. rekombinante stamme 50336ΔmicC::Cat.
- Uddrag 50336ΔmicC::Cat genomisk DNA som PCR-skabelon. Brug de samme PCR-reaktionskomponenter som i trin 2.1. PCR-reaktionen udføres under samme betingelser som i trin 2.1.
- Detekter størrelsen af PCR-produktet ved agarosegelelektroforese og sekventer PCR-produktet.
- Konstruer deletion mutant 50336ΔmicC.
- Elektroporat 100 ng plasmid pCP20 i 40 μL 50336ΔmicC::Cat kompetente celler med parametrene spænding 1,8 kV, puls 25 μF og modstand 200 Ω, skærm positive transformanter på både Amp (50 μg / ml) og Cm (34 μg / ml) resistent plade ved 30 ° C.
- Over positive transformanter overføres til ikke-resistent LB og kultureres natten over ved 42 °C, og derefter isoleres enkeltkolonier på en LB-plade ved 37 °C. Vælg den koloni, der er følsom over for både Amp og Cm. Denne mutant er micC-deletionsmutanten SE50336ΔmicC.
- Bekræft 50336ΔmicC ved PCR.
- Uddrag 50336ΔmicC genomisk DNA som PCR-skabelon. Bland 5 μL 10x PCR-reaktionsbuffer, 2 μL dNTP-blanding (2,5 mM), 1 μL primer vmicC-F, 1 μL primer vmicC-R, 5 μL skabelon, 1 μL Taq DNA-polymerase og 35 μL ddH2O sammen til PCR.
- Brug følgende PCR-reaktionsbetingelser:prædenaturering ved 94 °C i 4 minutter; 94 °C i 30 sekunder, 53 °C i 1 min, 72 °C i 1 minut i 25 cyklusser og forlængelse ved 72 °C i 10 minutter.
4. Konstruktion af micC suppleret belastning
- Design primere pBR-micC-F og pBR-micC-R med NheI- og SalI-begrænsningssteder.
- Forstærk micC-genet i fuld længde med flankesekvenser ved hjælp af PCR-reaktionsblanding, der indeholder 5 μL SE50336 genomisk DNA som skabelon, primere 1 μL pBR-micC-F og 1 μL pBR-micC-R som primere, 5 μL 10x PCR-reaktionsbuffer, 2 μL dNTP-blanding (2,5 mM), 2 μL dNTP-blanding (2,5 mM ) og 35 μL ddH2O.
- Brug følgende PCR-reaktionsbetingelser: prædenaturering ved 94 °C i 4 min; 94 °C i 30 s, 52 °C i 50 s, 72 °C i 1 min i 25 cyklusser og forlængelse ved 72 °C i 10 minutter. Rens og gendan PCR-produkt.
- Digest henholdsvis PCR-produktet og plasmidet pBR322 ved hjælp af restriktionsenzymet NheI og SalI, og ligér dem ved hjælp af T4-ligase ved 16 °C natten over for at opnå plasmidet pBR322-micC.
- Omdan pBR322-micC til SE50336ΔmicC-kompetente celler, og screene positivt transformermiddel for at opnå den komplementerede stamme SE50336ΔmicC/pmicC. Uddrag plasmidet pBR322-micC fra suppleret stamme og kontroller det ved at begrænse enzymfordøjelsen og sekventeringen.
5. RNA-isolering og kvantitativ PCR i realtid
- Kultur SE50336, 50336ΔmicC og 50336ΔmicC/pmicC i LB-medium natten over ved 24 °C med 180 omdr./min. rystekultivering til OD600 på 2,0. Bakteriekulturen opsamles ved centrifugering ved 13000 omdr./min. i 2 min.
- Uddrag total RNA ved anvendelse af TRIzol reagens. Inkuber 50 μL isoleret RNA med 2 μL DNaseI og 6 μL 10x buffer ved 37 °C i 30 minutter for at fjerne DNA. Bestem RNA-mængden ved at pipettere 1 μL RNA-prøve til et mikrospektrofotometer.
- Syntese af cDNA
- Brug 1 μg total RNA til cDNA-syntese i 20 μL revers transkriptionsreaktionssystem (4 μL 5x buffer, 1 μL RT-enzymblanding, 1 μL RT-primerblanding, 10 μL total RNA og 4 μL ddH2O). Der inkuberes over reaktionssystemet ved 37 °C i 15 minutter og derefter ved 85 °C i 5 s.
- Design primere baseret på sekvensen af målgener ompA, ompC og ompD. Udfør omvendt transkription-PCR ved hjælp af et RT-reagenssæt. PCR-reaktionskomponenterne indeholder 2,5 μL 10x PCR-reaktionsbuffer, 1 μL dNTP-blanding (2,5 mM), 1 μL målgenprimere (ompA, ompC eller ompD), 2,5 μL skabelon, 0,5 μL Taq DNA-polymerase og 17,5 μL ddH2O.
- Brug følgende PCR-reaktionsbetingelser:prædenaturering ved 94 °C i 4 minutter; 94 °C i 30 sekunder, 60 °C i 1 min, 72 °C i 1 minut i 25 cyklusser og forlængelse ved 72 °C i 10 minutter.
- Udfør PCR i realtid ved hjælp af SYBR grønt RT-PCR-sæt i et RT-PCT-instrument i tre eksemplarer.
- Brug følgende PCR-reaktionskomponenter: 10 μL 2x SYBR-buffer, 0,4 μLof henholdsvis fremadgående primer og omvendt primer, 0,4 μL RoxDye II, 2 μL cDNA og 6,8 μL RNasefri H2O.
- Brug følgende PCR-reaktionsbetingelser:prædenaturering ved 95 °C i 1 min i en cyklus; 95 °C i 5 sek., 60 °C i 34 s i 40 cyklusser.
- Normaliser alle data til det endogene referencegen gyrA. Brug 2-Δ Δ CT-metoden til datakvantificering15.
6. Virulens-assays
- Dyrkning SE50336, 50336ΔmicC og 50336ΔmicC/pmicC i LB medium til tidlig stationær fase (OD600 af 2-3) ved 24 °C, høstes ved centrifugering og fortyndes til passende CFU ml-1 i steril PBS.
- Ved museinfektioner fortyndes de dyrkede stammer til 10 CFU/200 μL, 102 CFU/200 μL og 103 CFU/200 μL gradientresuspensioner. Inficere grupper på fem 6-8 uger gamle Balb/c-mus pr. stamme ved subkutan injektion. Injicer kontrolgruppen med 200 μL fysiologisk saltvand.
- Ved kyllingeinfektioner fortyndes over tre stammer til 107 CFU/200 μL, 108 CFU/200 μL og 109 CFU/200 μL gradientresuspensioner. Inficere grupper på tyve 1 dage gamle kyllinger pr. Stamme ved subkutan injektion.
- Overvåg tegn på sygdom og død hos forsøgsdyr dagligt. LD50 (median lethal dose) beregnes 14 d efter infektion som beskrevet tidligere16. Behandl dataene ved hjælp af dataanalysesoftware.
- I infektionsgrupper skal du samle hjerte, lever, milt, lunge og nyre af frisk døde kyllinger. Væg 0,5 g af ovennævnte væv separat og slip dem med steril drift. Fortynd formalingsprøverne gradvist, fordel dem på LB-plade og kultur i 8-10 timer ved 37 °C. Optag mængden af salmonellastammer koloniseret i kyllingevæv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Konstruktion af den mutante 50336Δ micC og suppleret stamme 50336Δ micC /pmicC
MicC-genklonresultatet indikerede, at dette gen var sammensat af 109 bp, der viste 100% identitet med S. Typhimurium. Baseret på sekvensdataene blev deletionsmutanten 50336ΔmicC og den komplementerede mutant 50336ΔmicC/pmicC konstrueret med succes. I detaljer viste sekventeringsresultater, at en 1,1 kb cm modstandskassette blev forstærket og brugt til konstruktion af 1. rekombinant. Den 1. rekombinante 50336ΔmicC::cat blev valideret ved PCR ved hjælp af primere vmicC-F og vmicC-R med en forventet båndstørrelse på ca. 1200 bp PCR-produkter med Cm-indsættelse sammenlignet med 279 bp PCR-produkter i vildtypestamme (figur 1). I den anden rekombination blev Cm-kassette elimineret af pCP20. PCR-resultaterne kombineret med sekventering bekræftede, at den isogene micC-mutant blev konstrueret med succes og navngivet som 50336ΔmicC (figur 1).
MicC regulerer ompA, ompC og ompD genekspression
For at bestemme målene for MicC blev ekspressionen af ompA-, ompC- og ompD-gener i SE-stammer 50336, 50336ΔmicC og 50336ΔmicC / pmicC analyseret ved kvantitativ PCR i realtid ved hjælp af gyrA som den normaliserende interne standard. Resultaterne viste, at transkriptionen af ompA og ompC i 50336ΔmicC steg ca. 2,2 gange og 3 gange end dem i vildtypestammen, mens ompD i 50336ΔmicC blev øget lidt (1,3 gange) end i vildtypestamme (figur 2). Det indikerede, at micC kunne undertrykke udtrykket af ompA, ompC og ompD. OmpA var sandsynligvis et potentielt nyt målgen reguleret direkte af micC.
Sletning af micC forbedrer S. Enteritidisvirulens hos mus og kyllinger
Vi udførte LD50-assays for at kvantificere virkningen af sletning af micC på S. Enteritidis virulens hos mus og kyllinger. Efter at have inficeret 6-8 uger gamle Balb / c-mus med 103 CFU af hver af de tre stammer, observerede vi, at de fleste mus inficeret med 50336ΔmicC viste slaphed, appetitløshed eller diarré 48 timer efter infektion og syntes at dø i rækkefølge 96 timer efter infektion. Mens musene inficeret med WT-stamme og 50336ΔmicC / pmicC viste ovenstående symptomer 72 timer efter infektion og var døde 120 timer efter infektion. LD50s blev beregnet 7 d efter infektion. Resultaterne viste, at LD50 af WT-stammen 50336, 50336ΔmicC og 50336ΔmicC/pmicC for mus var henholdsvis 12,59, 5,01 og 19,95 CFU. Det indikerede, at virulensen af mutanten 50336ΔmicC steg 2,5 gange sammenlignet med WT hos mus (tabel 3). Efter infektion af 1 dag gamle kyllinger med 109 CFU af hver af de tre stammer viste de fleste kyllinger tarmhyperæmi og diarré 10 timer efter infektion. Ved infektion med 108 CFU viste kyllingerne inficeret med 50336ΔmicC højere dødelighed sammenlignet med WT-stamme og 50336ΔmicC/pmicC. LD50s blev beregnet for 14 d efter infektion. Resultaterne viste, at LD 50 af WT-stammen 50336, 50336ΔmicC og 50336ΔmicC/pmicC for kyllinger var henholdsvis 1,13×109, 1,55×10 8 og2,54×10 8 CFU. Det indikerede, at sletning af micC også øgede virulensen af S. Enteritidis hos kyllinger. Alle tre stammer af S. Enteritidis blev genvundet fra leveren, milten og caecum af de inficerede kyllinger.
Figur 1: PCR-verifikation af 50336ΔmicC-mutanter med primere vmicC-F og vmicC-R. Et 280 bp PCR-produkt blev opnået, når vildtype 50336-genomet som skabelon (bane 1). Når CM-kassettegenet blev indsat i genomet af S. Enteritidis, den 1. rekombinante 50336Δmikrofon::cat blev verificeret af PCR, og der blev opnået et 1100 bp PCR-produkt (bane 2). Cm-kassettegenet fra 50336Δ-mikrofon::cat blev udskåret ved at indføre FLP-rekombinase-ekspressionsvektoren pCP20, og den 2. rekombinante 50336Δ-mikrofon blev opnået og verificeret ved PCR (bane 3). M: molekylær massemarkør. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Foldændringer af ompA-, ompC- og ompD-gener mRNA-niveau blev bestemt i den mutante 50336 Δ-mikrofon og supplerede stamme 50336Δ-mikrofon/p-mikrofon ved kvantitativ RT-PCR sammenlignet med vildtypestammen. Assays blev udført i tre eksemplarer. 2-ΔΔCT-metoden blev anvendt til datakvantificering. *Angiver statistisk signifikant forskel sammenlignet med vildtypestammen (p<0,05) Klik her for at se en større version af denne figur.
| Stammer/plasmider | Karakteristika | Referencer |
| Stammer | ||
| CMCC(B)50336 | Salmonella enterica serovar Enteritidis vildtype | NICPBP, Kina |
| 50336Δmikrofon | micC mangelfuld mutant | Denne undersøgelse |
| 50336ΔmikrofonC/pmicC | 50336Δ micC bærer pBR-micC (ampr) | Denne undersøgelse |
| Plasmider: | ||
| pKD3 | Cmr; Cm kassette teplate | [13] |
| pKD46 | Ampr, λRød rekombinaseekspression | [13] |
| pCP20 | Amp r, Cmr; Flp rekombinaseekspression | [13] |
| pBR-micC | pBR322, der bærer det fulde micC-gen (Ampr) | Denne undersøgelse |
| pGEM-T nemt | kloning vektor, Ampr | Takara |
| pMD19 T-simpelt | kloning vektor, Ampr | Takara |
Tabel 1. Bakteriestammer og plasmider anvendt i denne undersøgelse.
| Primer | Sekvens (5'-3') | Produktstørrelse (bp) | ||||||
| mikrofonC-F | TGTCAGGAAAGACCTAAAAAGAGATGTTACCGTTTAATTCAATAATTAATTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG | 1114 | ||||||
| mikrofonC -R | TGGAAATAAAAAAAAAGCCCGAACATCCGTTCGGGCTTGTCAATTTATACCATATGAATATCCTCCTTAG | |||||||
| vmicC -F | AGCGAGTTGACGTTAAAACGTTAT | 279/140 | ||||||
| vmicC -R | TTCGTTCGGGCTTGTCAATTTATA | |||||||
| pBR-micC-F | CAGGCTAGCCACTTTATGTACAATGACATACGTCAC | 434 | ||||||
| pBR-micC-R | CAGGTCGACAAATATTCTAAGGATTAACCTGGAAAC | |||||||
| ompA-F | ACTGAACGCCCTGAGCTTTA | 177 | ||||||
| ompA-R | ACACCGGCTTCATTCACAAT | |||||||
| ompC-F | AAAGTTCTGCGCTTTGTTGG | 187 | ||||||
| ompC-R | CGCTGACGAACACCTGTATG | |||||||
| ompD-F | ACGGTCAGACTTCGCATAGG | 184 | ||||||
| ompD-R | TGTTGCCACCTACCGTAACA | |||||||
| gyrA-F | GCATGACTTCGTCAGAACCA | 278 | ||||||
| gyrA-R | GGTCTATCAGTTGCCGGAAG | |||||||
Tabel 2. Primere anvendt i denne undersøgelse
| Stammer | LD50 til mus (CFU) | Fold forbedring | LD50 til kyllinger (CFU) | Fold forbedring |
| S. Enteritidis 50336 | 12.59 | 1 | 1.13×109 | 1 |
| 50336Δmikrofon | 5.01 | 2.51 | 1.55×108 | 7.29 |
| 50336Δ mikrofonC/pmikrofonC | 19.95 | 0.63 | 2.54×108 | 4.45 |
| Negativ kontrol | 0 | / | 0 | / |
Tabel 3. Virulens egenskaber af S. Enteritidis 50336 stammer hos mus og kyllinger
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
S. Enteritidis er et vigtigt fakultativt intracellulært patogen, der kan inficere unge kyllinger og producerer symptomer fra enteritis til systemisk infektion og død17,18. Derudover forårsager S. Enteritidis latente infektioner hos voksne kyllinger, og kroniske bærere forurener fjerkræprodukter, hvilket resulterer i fødevarebårne infektioner hos mennesker19. Den patogene mekanisme af S. Enteritidis skal undersøges yderligere. Til dato har nogle sRNA'er såsom IsrJ, SroA og IsrM vist sig at påvirke Salmonella virulens20,21,22,23. Det ikke-kodende lille RNA micC-gen blev identificeret i mange enterobakterier såsom Escherichia coli, Salmonella Typhimurium, Salmonella Bongori og Shigella flexneri 6,7,24. Her fandt vi, at sekvensen af micC i S. Enteritidis 50336 var den samme som i S. Typhimurium. Det indikerer, at MicC er et konservativt sRNA i enterobakterier.
At undersøge om MicC medierer virulens i S. Enteritidis til dyr og identificere MicC-mål, konstruerede vi deletionsmutanten 50336ΔmicC og den komplementerede mutant 50336ΔmicC / p micC, der udtrykkermicC med succes. Resultaterne af qRT-PCR indikerede, at micC kunne undertrykke ekspressionen af ompA og ompC. OmpA er sandsynligvis et potentielt nyt mål for MicC. SRNA'et RybB kunne undertrykke syntesen af OmpA ved baseparring med de 5' uoversatte regioner (5' UTR'er) af målet ompA mRNA25. MicA sRNA letter også hurtig henfald af ompA mRNA ved antisenseparring på samme måde som RybB25,26. Hvorvidt MicC bruger den lignende reguleringsmekanisme til at regulere ompA vides ikke og skal undersøges i den nærmeste fremtid. I E. coli øgede sletningen af MicC ekspressionen af ompC 1,5 til 2 gange. Yderligere undersøgelse viste, at MicC viste sig at hæmme ribosombinding til ompC mRNA 5' leder6. Derudover fandt Pfeiffer, at OmpC var hovedmålene for MicC7. Det antages, at MicC regulerer ompC i en lignende mekanisme i S. Enteritidis med det i E. coli og S. Typhimurium. Udover OmpA og OmpC kunne MicC også undertrykke udtrykket af OmpD. Resultatet viste, at transkriptionen af ompD i 50336ΔmicC blev øget lidt (1,3 gange) end i vildtypestamme. Baseret på ovenstående resultater viste det, at MicC kunne undertrykke transkriptionen af flere mål-mRNA'er (ompA, ompC og ompD) i S. Enteritidis. MicC er ikke det eneste sRNA, der kan regulere flere mål. Nogle sRNA'er såsom RybB, DsrA, GcvB, RNAIII og RyhB virker også på flere mål 25,27,28,29,30,31. Fordi sRNA'er regulerer mål ved hjælp af baseparringsmekanisme for at opnå sRNA-målinteraktioner32, er det muligt, at bevarede underregioner eller domæner af sRNA'er kan binde til forskellige mål.
Den ydre membran af gramnegative bakterier er en nøglegrænseflade i værtspatogeninteraktioner. OmpA, OmpC og OmpD er alle vigtige og rigelige ydre membranproteiner. OmpC spiller en vigtig rolle i afskyelige omgivelser som i tarmen6. OmpD er involveret i overholdelse af humane makrofager og intestinale epitelceller12. Det blev antaget, at ændringen af OMP's udtryk forårsaget af MicC-sletning kunne påvirke virulensen af S. Enteritidis og MicC akkumuleret i stationære faseceller og især under vækstbetingelser inducerede Salmonella SPI-1 og SPI-2 virulensgenerne7. Det menes, at MicC er relateret til virulens i Salmonella, mens dyreinfektionsforsøg blev udført for at påvise virulens af MicC. Resultaterne viste, at LD50 af mutanterne 50336ΔmicC til 1 dag gamle kyllinger og 6 uger gamle Balb/c-mus begge blev afvist klart sammenlignet med vildtypestammen. Det indikerede, at sletningen af micC øgede virulensen af S. Enteritidis hos mus og kyllinger. Det antages, at stigningen i OmpA-, OmpC- og OmpD-ekspression, som skyldes MicC-sletning, fører til virulensforbedring i S. Enteritidis.
MicC regulerer S negativt. Enteritidis virulens hos mus og kyllinger, sandsynligvis ved nedregulering af de vigtigste ydre membranproteiner OmpA og OmpC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra Chinese National Science Foundation (nr. 31972651 og 31101826), Jiangsu High Education Science Foundation (nr. 14KJB230002), State Key Laboratory of Veterinary Biotechnology (nr. SKLVBF201509), Nature Science Foundation Grant of Yangzhou (nr. YZ2014019), et projekt finansieret af det prioriterede akademiske program udvikling af Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| dextrose | Sangon Biotech | A610219 | for broth preparation |
| DNA purification kit | TIANGEN | DP214 | for DNA purification |
| Ex Taq | TaKaRa | RR01A | PCR |
| KH2PO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10017608 | for broth preparation |
| K2HPO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 20032116 | for broth preparation |
| L-Arabinose | Sangon Biotech | A610071 | λ-Red recombination |
| Mini Plasmid Kit | TIANGEN | DP106 | plasmid extraction |
| NaCl | Sinopharm Chemical Reagent | 10019308 | for broth preparation |
| (NH4)2SO4 | Sinopharm Chemical Reagent | 10002917 | for broth preparation |
| PrimeScriptRRT reagent Kit with gDNA Eraser | TaKaRa | RR047 | qRT-PCR |
| SYBRR Premix Ex Taq II | TaKaRa | RR820 | qRT-PCR |
| T4 DNA Ligase | NEB | M0202 | Ligation |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | RNA isolation |
| Tryptone | Oxoid | LP0042 | for broth preparation |
| Yeast extract | Oxoid | LP0021 | for broth preparation |
| centrifuge | Eppendorf | 5418 | centrifugation |
| Electrophoresis apparatus | Bio-Rad | 164-5050 | Electrophoresis |
| Electroporation System | Bio-Rad | 165-2100 | for bacterial transformation |
| Spectrophotometer | BioTek | Epoch | Absorbance detection |
| Real-Time PCR system | Applied Biosystems | 7500 system | qRT-PCR |
References
- Jørgensen, M. G., Pettersen, J. S., Kallipolitis, B. H. sRNA-mediated control in bacteria: An increasing diversity of regulatory mechanisms. Biochimica et Biophysica Acta-Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (5), 194504 (2020).
- Wagner, E. G. H., Romby, P. Small RNAs in bacteria and archaea: who they are, what they do, and how they do it. Advances In Genetics. 90, 133-208 (2015).
- Vogel, J. A rough guide to the non-coding RNA world of Salmonella. Molecular Microbiology. 71 (1), 1-11 (2009).
- Dutta, T., Srivastava, S. Small RNA-mediated regulation in bacteria: A growing palette of diverse mechanisms. Gene. 656, 60-72 (2018).
- Waters, L. S., Storz, G.
- Chen, S., Zhang, A., Blyn, L. B., Storz, G. MicC, a second small-RNA regulator of Omp protein expression in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 186 (20), 6689-6697 (2004).
- Pfeiffer, V., Papenfort, K., Lucchini, S., Hinton, J. C., Vogel, J. Coding sequence targeting by MicC RNA reveals bacterial mRNA silencing downstream of translational initiation. Nature Structural & Molecular Biology. 16 (8), 840-846 (2009).
- Dam, S., Pagès, J. M., Masi, M. Dual Regulation of the Small RNA MicC and the Quiescent Porin OmpN in Response to Antibiotic Stress in Escherichia coli. Antibiotics (Basel). 6 (4), 33 (2017).
- Hao, M., et al. Porin Deficiency in Carbapenem-Resistant Enterobacter aerogenes Strains. Microbial Drug Resistance. 24 (9), 1277-1283 (2018).
- Wroblewska, Z., Olejniczak, M. Hfq assists small RNAs in binding to the coding sequence of ompD mRNA and in rearranging its structure. RNA. 22 (7), 979-994 (2016).
- Santiviago, C. A., Toro, C. S., Hidalgo, A. A., Youderian, P., Mora, G. C. Global regulation of the Salmonella enterica serovar typhimurium major porin, OmpD. Journal of Bacteriology. 185 (19), 5901-5905 (2003).
- Hara-Kaonga, B., Pistole, T. G. OmpD but not OmpC is involved in adherence of Salmonella enterica serovar typhimurium to human cells. Canadian Journal of Microbiology. 50 (9), 719-727 (2004).
- Datsenko, K. A., Wanner, B. L. One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (12), 6640-6645 (2000).
- Meng, X., et al. The RNA chaperone Hfq regulates expression of fimbrial-related genes and virulence of Salmonella enterica serovar Enteritidis. FEMS Microbiology Letters. 346 (2), 90-96 (2013).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Vander Velden, A. W., Bäumler, A. J., Tsolis, R. M., Heffron, F. Multiple fimbrial adhesins are required for full virulence of Salmonella typhimurium in mice. Infection and Immunity. 66 (6), 2803-2808 (1998).
- Prescott, J. F. Salmonella enterica serovar enteritidis in humans and animals: Epidemiology, pathogenesis, and control. Canadian Veterinary Journal La Revue Veterinaire Canadienne. 40 (10), 736 (1999).
- Balasubramanian, R., et al. The global burden and epidemiology of invasive non-typhoidal. Hum Vaccin Immunother. 15 (6), 1421-1426 (2019).
- De Buck, J., Van Immerseel, F., Haesebrouck, F., Ducatelle, R. Colonization of the chicken reproductive tract and egg contamination by Salmonella. Journal of General and Applied Microbiology. 97 (2), 233-245 (2004).
- Padalon-Brauch, G., et al. Small RNAs encoded within genetic islands of Salmonella typhimurium show host-induced expression and role in virulence. Nucleic Acids Research. 36 (6), 1913-1927 (2008).
- Santiviago, C. A., et al. Analysis of pools of targeted Salmonella deletion mutants identifies novel genes affecting fitness during competitive infection in mice. PLoS Pathogens. 5 (7), 1000477 (2009).
- Gong, H., et al. A Salmonella small non-coding RNA facilitates bacterial invasion and intracellular replication by modulating the expression of virulence factors. PLoS Pathogens. 7 (9), 1002120 (2011).
- Hébrard, M., et al. sRNAs and the virulence of Salmonella enterica serovar Typhimurium. RNA Biology. 9 (4), 437-445 (2012).
- Vogel, J., Papenfort, K. Small non-coding RNAs and the bacterial outer membrane. Current Opinion in Microbiology. 9 (6), 605-611 (2006).
- Papenfort, K., et al. SigmaE-dependent small RNAs of Salmonella respond to membrane stress by accelerating global omp mRNA decay. Molecular Microbiology. 62 (6), 1674-1688 (2006).
- Udekwu, K. I., et al. Hfq-dependent regulation of OmpA synthesis is mediated by an antisense RNA. Genes and Development. 19 (19), 2355-2366 (2005).
- Papenfort, K., Vogel, J. Multiple target regulation by small noncoding RNAs rewires gene expression at the post-transcriptional level. Research in Microbiology. 160 (4), 278-287 (2009).
- Lease, R. A., Cusick, M. E., Belfort, M. Riboregulation in Escherichia coli: DsrA RNA acts by RNA:RNA interactions at multiple loci. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (21), 12456-12461 (1998).
- Sharma, C. M., Darfeuille, F., Plantinga, T. H., Vogel, J. A small RNA regulates multiple ABC transporter mRNAs by targeting C/A-rich elements inside and upstream of ribosome-binding sites. Genes and Development. 21 (21), 2804-2817 (2007).
- Boisset, S., et al. Staphylococcus aureus RNAIII coordinately represses the synthesis of virulence factors and the transcription regulator Rot by an antisense mechanism. Genes and Development. 21 (11), 1353-1366 (2007).
- Massé, E., Vanderpool, C. K., Gottesman, S. Effect of RyhB small RNA on global iron use in Escherichia coli. Journal of Bacteriology. 187 (20), 6962-6971 (2005).
- Papenfort, K., Vogel, J.
