आंतों विली एपिथेलियम से ऑर्गेनॉइड की 3डी कल्टिंग डिफरेंटेशन से गुजर रही है
Summary
प्रक्रिया माउस आंतों के एपिथेलियम से विली के अलगाव का वर्णन करती है जो उनके ऑर्गेनॉइड बनाने की क्षमता निर्धारित करने के लिए डिफाइनेशन से गुजर रही है।
Abstract
आंतों के एपिथेलियम से ऑर्गेनॉइड की क्लोनोजेनिकिटी को उसमें स्टेम कोशिकाओं की उपस्थिति के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है। माउस छोटे आंतों के एपिथेलियम को क्रिप्ट्स और विली में विभाजित किया जाता है: स्टेम और प्रसार कोशिकाएं क्रिप्ट तक सीमित होती हैं, जबकि विली एपिथेलियम में केवल विभेदित कोशिकाएं होती हैं। इसलिए, सामान्य आंतों के क्रिप्ट, लेकिन विली नहीं, 3 डी संस्कृतियों में ऑर्गेनॉइड को जन्म दे सकते हैं। यहां वर्णित प्रक्रिया केवल विल्लस एपिथेलियम पर लागू होती है जो विवर्तन के दौर से गुजर रही है जिससे स्टेमनेस होती है। वर्णित विधि Smad4-हानि-समारोह का उपयोग करती है: β-catenin लाभ-समारोह (Smad4KO:β-cateninGOF)सशर्त उत्परिवर्ती माउस । उत्परिवर्तन आंतों विली को डिफरेंट करने और विली में स्टेम सेल उत्पन्न करने का कारण बनता है। आंतों के विली को कांच की स्लाइड का उपयोग करके आंत से स्क्रैप किया जाता है, 70 माइक्रोन छलनी में रखा जाता है और बीएमई-आर 1 मैट्रिक्स में चढ़ाना से पहले किसी भी ढीली कोशिकाओं या क्रिप्ट्स को फ़िल्टर करने के लिए कई बार धोया जाता है ताकि उनके ऑर्गेनॉइड-बनाने की क्षमता निर्धारित की जा सके। यह सुनिश्चित करने के लिए दो मुख्य मानदंडों का उपयोग किया गया था कि परिणामी ऑर्गेनॉइड को डिफरेंट विलस डिब्बे से विकसित किया गया था न कि क्रिप्ट्स से: 1) 3डी मैट्रिक्स में प्लेटिंग से पहले और बाद में किसी भी सीमित तहखाने की अनुपस्थिति सुनिश्चित करने के लिए अलग विली का मूल्यांकन करना, और 2) विली से ऑर्गेनॉइड विकास के समय की निगरानी करना। विली से ऑर्गेनॉइड दीक्षा चढ़ाना के दो से पांच दिन बाद ही होती है और अनियमित रूप से आकार दिखाई देती है, जबकि एक ही आंतों के एपिथेलियम से क्रिप्टो-व्युत्पन्न ऑर्गेनॉइड चढ़ाना के सोलह घंटे के भीतर स्पष्ट होते हैं और गोलाकार दिखाई देते हैं। हालांकि, विधि की सीमा यह है कि ऑर्गेनॉइड की संख्या बनती है, और विली से ऑर्गेनॉइड दीक्षा के लिए आवश्यक समय डिफरेंटेशन की डिग्री के आधार पर भिन्न होता है। इसलिए, उत्परिवर्तन की विशिष्टता या अपमान के आधार पर, जिस पर विली को उनके ऑर्गेनॉइड बनाने की क्षमता को परखने के लिए काटा जा सकता है, अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए।
Introduction
आंतों के क्रिप्ट लेकिन विली नहीं, मैट्रिगेल या बीएमई-आर 1 मैट्रिक्स में सुसंस्कृत होने पर ऑर्गेनॉइड बनाते हैं। ये ऑर्गेनॉइड स्वयं-आयोजन संरचनाएं हैं, जिसे अक्सर वीवोमें आंतों के एपिथेलियम में मौजूद विभिन्न विभेदित वंश, जनक और स्टेम कोशिकाओं की उपस्थिति के कारण “मिनी-पेट” के रूप में जाना जाता है। क्रिप्ट्स से ऑर्गेनॉइड बनाने की क्षमता का कारण स्टेम सेल की उपस्थिति होती है1. दूसरी ओर आंतों की विली में केवल विभेदित कोशिकाएं शामिल होती हैं, और इसलिए ऑर्गेनॉइड नहीं बन सकते हैं। हालांकि, म्यूटेशन2 या शर्तें जो विलीस एपिथेलियम के विवर्तन की अनुमति देतीहैं,विल्ली2,3में स्टेम सेल का कारण बन सकती हैं। विली एपिथेलियम में स्टेमनेस के परिणामस्वरूप इस भाग्य परिवर्तन की पुष्टि 3 डी मैट्रिक्स में डिफिडेंटिंग विलीनस एपिथेलियम को चढ़ाना द्वारा पुष्टि की जा सकती है ताकि वे विल्लस एपिथेलियम में डी-नोवो स्टेमनेस के संकेतक के रूप में अपने ऑर्गेनॉइड बनाने की क्षमता का निर्धारण कर सकें। इसलिए, इस प्रक्रिया का महत्वपूर्ण पहलू क्रिप्टो संदूषण की अनुपस्थिति सुनिश्चित करना है।
Smad4KO:β-cateninGOF सशर्त उत्परिवर्तन विली में प्रसार और स्टेम सेल मार्कर की अभिव्यक्ति द्वारा चिह्नित आंतों के एपिथेलियम में अलग-अलग कारण बनता है, और अंततः वायली में तहखाना जैसी संरचनाओं का गठन जिसे एक्टोपिक क्रिप्ट्स के रूप में जाना जाता है, स्टेम सेल की उपस्थिति इन अलग विली को एक्टोपिक क्रिप्ट्स(वीवो में) मेंस्टेम सेल मार्कर की अभिव्यक्ति और उत्परिवर्ती विली की क्षमता ऑर्गेनॉइड बनाने की क्षमता द्वारा निर्धारित की गई थी। एन प्लेटेड मैट्रिगेल3. नीचे उल्लिखित प्रक्रिया Smad4KOमें डिफिंग आंतों के एपिथेलियम के स्टेमनेस की पुष्टि करने के लिए उपयोग की जाने वाली पद्धति को विस्तृत करती है: β-cateninGOF उत्परिवर्ती चूहों। विली को अलग-थलग करने के लिए इस पद्धति की एक प्रमुख विशेषता EDTA चेलेशन विधि4के विपरीत आंतों के ल्यूमेन के स्क्रैपिंग का उपयोग था। EDTA चेलेशन विधि के विपरीत, स्क्रैपिंग द्वारा विली अलगाव अंतर्निहित मेसेनचिम के बहुमत को बरकरार रखता है और सीमित क्रिप्ट के बिना विली उपज के लिए स्क्रैपिंग के दबाव को समायोजित करने की अनुमति देता है। स्क्रैपिंग का दबाव ऑपरेटर के लिए व्यक्तिपरक है, इसलिए, क्रिप्ट्स के बिना विली उपज के लिए इष्टतम दबाव ऑपरेटर द्वारा अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाना चाहिए। इस प्रक्रिया का महत्वपूर्ण पहलू बीएमई-आर 1 मैट्रिक्स में चढ़ाना से पहले और बाद में विली की सूक्ष्म परीक्षा द्वारा तहखाना संदूषण की अनुपस्थिति सुनिश्चित करना है।
आंतों विली को ग्लास स्लाइड के साथ आंतों के ल्यूमेन को स्क्रैप किया जाता है और 70 माइक्रोन फिल्टर में रखा जाता है और ढीली कोशिकाओं या क्रिप्ट्स से छुटकारा पाने के लिए पीबीएस के साथ धोया जाता है, यदि कोई हो, तो बीएमई-आर 1 मैट्रिक्स में चढ़ाना से पहले। विधि तहखाना संदूषण से बचने के लिए निम्नलिखित मानदंडों पर जोर देती है: ए) विली फसल को डुओडेनम के समीपस्थ आधे हिस्से तक सीमित करना जहां विली सबसे लंबे समय तक हैं, ख) विली-उपज वाले स्क्रैप की संख्या को कम करना, सी) छह-अच्छी डिश में पीबीएस की एक श्रृंखला के माध्यम से विली युक्त फिल्टर को धोना, और डी) बीएमई-आर 1 मैट्रिक्स में चढ़ाना से पहले और बाद में सूक्ष्म परीक्षा द्वारा तहखाना संदूषण की अनुपस्थिति की पुष्टि करता है। ईडीटीए चेलेशन के बजाय स्क्रैपिंग द्वारा विली अलगाव, अंतर्निहित मेसेनचिम के पूर्ण नुकसान को रोकता है जो विलस एपिथेलियम से ऑर्गेनॉइड दीक्षा के लिए आला संकेत5,6,7,8, यदिआवश्यक हो तो प्रदान कर सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह विधि वीवो में स्टेम सेल मार्कर प्राप्त करने वाले विली एपिथेलियम को अलग करने की आत्म-नवीकरण क्षमता की पुष्टि कर सकती है। सामान्य आंतों के एपिथेलियम तहखाने से ऑर्गेनॉइड को जन्म दे सकते हैं, लेकिन ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस प्रकाशन को एनआईएच नेशनल कैंसर इंस्टीट्यूट से पुरस्कार संख्या K22 CA218462-03 द्वारा समर्थित किया गया था । HEK293-T आर-Spondin1 व्यक्त कोशिकाओं डॉ माइकल पी Verzi से एक उदार उपहार था ।
Materials
| Advanced DMEM F-12 media | Gibco | 12634010 | |
| 3,3-diaminobenzidine | Vector Labs | SK-4105 | |
| 96 well U-bottom plate | Fisher Scientific | FB012932 | |
| ABC kit | Vector Labs | PK4001 | |
| Angled scissor | Fisher Scientific | 11-999 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9703100 | |
| CD44 antibody | BioLegend | 1030001 | |
| Cdx2 antibody | Cell Signaling | 12306 | |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | |
| Corning 70-micron cell strainer | Life Sciences | 431751 | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type R1 | R&D | 3433-005-R1 | |
| Dissection scissors | Fisher Scientific | 22-079-747 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 17-456-209 | |
| Glutamax (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| HEK 293-T cells expressing RSPO-1 | Gift from Dr. Michael Verzi | ||
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Histogel | Thermoscientific | HG-4000-012 | |
| Mesh filter | Fisher Scientific | 07-201-431 | |
| Micrscope glass slide | VWR | 89218-844 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| p200 Blunt tips | VWR | 46620-642 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Primocin (50mg/mL) | Invivogen | ant-pm-1 | |
| Quality Biological Inc PBS (10X) | Fisher Scientific | 50-146-770 | |
| Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| Signal diluent | Cell Signaling | 8112L | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | |
| 6-well tissue culture plate | Fisher Scientific | 50-146-770 |
Referências
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