Culture 3D d’organoïdes de l’épithélium intestinal des villosités en cours de dédifférenciation
Summary
La procédure décrit l’isolement des villosités de l’épithélium intestinal de la souris subissant une dédifférenciation afin de déterminer leur potentiel de formation organoïde.
Abstract
La clonogénicité des organoïdes de l’épithélium intestinal est attribuée à la présence de cellules souches dans celui-ci. L’épithélium de l’intestin grêle de la souris est compartimenté en cryptes et villosités : la tige et les cellules proliférantes sont confinées dans les cryptes, tandis que l’épithélium des villosités ne contient que des cellules différenciées. Par conséquent, les cryptes intestinales normales, mais pas les villosités, peuvent donner naissance à des organoïdes dans les cultures 3D. La procédure décrite ici ne s’applique qu’à l’épithélium des villosités subissant une dédifférenciation conduisant à la tige. La méthode décrite utilise la souris mutante conditionnelle Smad4-loss-of-function:β-caténine gain-of-function (Smad4KO:β-caténineGOF). La mutation provoque la dédifférenciation des villosités intestinales et la génération de cellules souches dans les villosités. Les villosités intestinales subissant une dédifférenciation sont grattées de l’intestin à l’aide de lames de verre, placées dans une passoire de 70 μm et lavées plusieurs fois pour filtrer les cellules lâches ou les cryptes avant le placage dans la matrice BME-R1 afin de déterminer leur potentiel de formation organoïde. Deux critères principaux ont été utilisés pour s’assurer que les organoïdes résultants ont été développés à partir du compartiment des villosités dédifférenciantes et non à partir des cryptes: 1) évaluer au microscope les villosités isolées pour s’assurer de l’absence de cryptes attachées, avant et après le placage dans la matrice 3D, et 2) surveiller le déroulement du développement organoïde à partir des villosités. L’initiation organoïde à partir des villosités ne se produit que deux à cinq jours après le placage et semble de forme irrégulière, tandis que les organoïdes dérivés de la crypte du même épithélium intestinal sont apparents dans les seize heures suivant le placage et semblent sphériques. La limite de la méthode, cependant, est que le nombre d’organoïdes formés et le temps nécessaire à l’initiation organoïde à partir des villosités varient en fonction du degré de dédifférenciation. Par conséquent, en fonction de la spécificité de la mutation ou de l’insulte à l’origine de la dédifférenciation, le stade optimal auquel les villosités peuvent être prélevées pour déterminer leur potentiel de formation organoïde doit être déterminé empiriquement.
Introduction
Les cryptes intestinales, mais pas les villosités, forment des organoïdes lorsqu’elles sont cultivées dans une matrice de Matrigel ou de BME-R1. Ces organoïdes sont des structures auto-organisatrices, souvent appelées « mini-intestin » en raison de la présence des différentes lignées différenciées, progéniteurs et cellules souches présents dans l’épithélium intestinal in vivo. Le potentiel de formation d’organoïdes à partir de cryptes est attribué à la présence de cellules souches1. Les villosités intestinales, d’autre part, ne sont constituées que de cellules différenciées et ne peuvent donc pas former d’organoïdes. Cependant, les mutations2 ou les conditions qui permettent la dédifférenciation de l’épithélium des villosités peuvent conduire à des cellules souches dans lesvillosités 2,3. Ce changement de destin entraînant une tige dans l’épithélium des villosités peut être confirmé en plaquant l’épithélium villositédifférenciant dans une matrice 3D afin de déterminer leur potentiel de formation d’organoïdes comme indicateur de la tige de novo dans l’épithélium villus. Par conséquent, l’aspect critique de cette procédure est d’assurer l’absence de contamination de la crypte.
La mutation conditionnelle Smad4KO:β-caténineGOF provoque une dédifférenciation dans l’épithélium intestinal marquée par l’expression de marqueurs de prolifération et de cellules souches dans les villosités, et finalement la formation de structures de type crypte dans les villosités appelées cryptes ectopiques La présence de cellules souches ces villosités dédifférenciées a été déterminée par l’expression de marqueurs de cellules souches dans les cryptes ectopiques(in vivo)et la capacité des villosités mutantes à former des organoïdes wh en plaqué Matrigel3. La procédure mentionnée ci-dessous élabore la méthodologie utilisée pour confirmer la tige de l’épithélium intestinal dédifférenciant chez les souris mutantes Smad4KO:β-caténineGOF. Une caractéristique clé de cette méthodologie pour isoler les villosités était l’utilisation du grattage de la lumière intestinale, par opposition à la méthode de chélation EDTA4. Contrairement à la méthode de chélation EDTA, l’isolement des villosités par grattage conserve la majorité du mésenchyme sous-jacent et permet d’ajuster la pression de grattage pour produire des villosités sans cryptes attachées. La pression de raclage est subjective pour l’opérateur, par conséquent, la pression optimale pour produire des villosités sans cryptes attachées doit être déterminée empiriquement par l’opérateur. L’aspect critique de cette procédure est d’assurer l’absence de contamination de la crypte par un examen microscopique des villosités avant et après le placage dans la matrice BME-R1.
Les villosités intestinales sont grattées de la lumière intestinale avec des lames de verre et placées dans un filtre de 70 μm et lavées avec du PBS pour se débarrasser des cellules lâches ou des cryptes, le cas échéant, avant le placage dans la matrice BME-R1. La méthode met l’accent sur les critères suivants pour éviter la contamination des tésiers : a) confiner la récolte des villosités dans la moitié proximale du duodénum où les villosités sont les plus longues, b) minimiser le nombre d’éraflures produisant des villosités, c) laver le filtre contenant les villosités à travers une série de PBS dans une boîte à six puits, et d) confirmer l’absence de contamination des cryptes par un examen microscopique avant et après le placage dans la matrice BME-R1. L’isolement de Villosité par grattage, plutôt que par chélation EDTA, empêche la perte complète du mésenchyme sous-jacent qui peut fournir les signaux de niche5,6,7,8, si nécessaire, pour l’initiation organoïde de l’épithélium villus.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette méthode peut confirmer la capacité d’auto-renouvellement de l’épithélium des villosités dédifférenciantes qui acquièrent des marqueurs de cellules souches in vivo. L’épithélium intestinal normal peut donner naissance à des organoïdes de la crypte mais pas du compartiment des villosités, lorsqu’il est cultivé en 3D en raison de la présence de cellules souches dans les cryptes1. Ainsi, la formation d’organoïdes à partir de l’épithélium des villosités d?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette publication a été soutenue par le numéro de prix K22 CA218462-03 du NIH National Cancer Institute. Les cellules HEK293-T exprimant R-Spondin1 ont été un don généreux du Dr Michael P. Verzi.
Materials
| Advanced DMEM F-12 media | Gibco | 12634010 | |
| 3,3-diaminobenzidine | Vector Labs | SK-4105 | |
| 96 well U-bottom plate | Fisher Scientific | FB012932 | |
| ABC kit | Vector Labs | PK4001 | |
| Angled scissor | Fisher Scientific | 11-999 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9703100 | |
| CD44 antibody | BioLegend | 1030001 | |
| Cdx2 antibody | Cell Signaling | 12306 | |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | |
| Corning 70-micron cell strainer | Life Sciences | 431751 | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type R1 | R&D | 3433-005-R1 | |
| Dissection scissors | Fisher Scientific | 22-079-747 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 17-456-209 | |
| Glutamax (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| HEK 293-T cells expressing RSPO-1 | Gift from Dr. Michael Verzi | ||
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Histogel | Thermoscientific | HG-4000-012 | |
| Mesh filter | Fisher Scientific | 07-201-431 | |
| Micrscope glass slide | VWR | 89218-844 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| p200 Blunt tips | VWR | 46620-642 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Primocin (50mg/mL) | Invivogen | ant-pm-1 | |
| Quality Biological Inc PBS (10X) | Fisher Scientific | 50-146-770 | |
| Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| Signal diluent | Cell Signaling | 8112L | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | |
| 6-well tissue culture plate | Fisher Scientific | 50-146-770 |
Referências
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