3D زراعة الأجهزة العضوية من ظهارة سيلي المعوية التي تخضع للتمايز
Summary
يصف الإجراء عزل الزغب من ظهارة الفأر المعوية التي تخضع للتمايز لتحديد إمكانات تكوين الأعضاء.
Abstract
ويعزى كلونوجينيتي من organoids من ظهارة الأمعاء إلى وجود الخلايا الجذعية فيه. يتم تقسيم ظهارة الفأر المعوية الصغيرة إلى سرداب وزغب: تقتصر الخلايا الجذعية والمتكاثرة على السرداب ، في حين أن ظهارة الزغب تحتوي على خلايا مختلفة فقط. وبالتالي ، فإن سرداب الأمعاء العادية ، ولكن ليس الزغب ، يمكن أن تؤدي إلى الأجهزة العضوية في الثقافات ثلاثية الأبعاد. الإجراء الموصوف هنا ينطبق فقط على ظهارة villus التي تخضع للتمايز مما يؤدي إلى الجذعية. يستخدم الأسلوب الموصوف Smad4-loss-of-function:β-catenin كسب من وظيفة (Smad4 KO:β-cateninGOF) الماوس متحولة مشروطة. الطفرة يسبب الزغب المعوية لdedifferentiate وتوليد الخلايا الجذعية في الزغب. يتم كشط الزغب المعوي الذي يخضع للتمايز من الأمعاء باستخدام الشرائح الزجاجية ، ووضعها في مصفاة 70 ميكرومتر وغسلها عدة مرات لتصفية أي خلايا فضفاضة أو سرداب قبل الطلاء في مصفوفة BME-R1 لتحديد إمكاناتها لتشكيل الجهاز. تم استخدام معيارين رئيسيين لضمان تطوير الأجهزة العضوية الناتجة من مقصورة villus المتمايزة وليس من السراديب: 1) تقييم الزغب المعزول بشكل مجهري لضمان عدم وجود أي سرداب مربوطة ، قبل وبعد الطلاء في المصفوفة ثلاثية الأبعاد ، و 2) مراقبة المسار الزمني لتطور الجهازية من villi. بدء العضوية من الزغب يحدث بعد يومين إلى خمسة أيام فقط من الطلاء ويبدو على شكل غير منتظم، في حين أن organoids المستمدة من سرداب من ظهارة الأمعاء نفسها واضحة في غضون ستة عشر ساعة من الطلاء وتظهر كروية. الحد من هذه الطريقة، ومع ذلك، هو أن عدد organoids شكلت، والوقت اللازم لبدء organoid من الزغب تختلف تبعا لدرجة dedifferentiation. وبالتالي ، اعتمادا على خصوصية الطفرة أو الإهانة التي تسبب التمايز ، يجب تحديد المرحلة المثلى التي يمكن فيها حصاد الزغب لتقصي إمكانات تشكيل الأعضاء الخاصة بهم ، تجريبيا.
Introduction
السراديب المعوية ولكن ليس زغب، تشكل organoids عندما مثقف في مصفوفة Matrigel أو BME-R1. هذه organoids هي هياكل التنظيم الذاتي، وغالبا ما يشار إليها باسم “الأمعاء المصغرة” بسبب وجود مختلف الأنساب المختلفة، السلف، والخلايا الجذعية الموجودة في ظهارة الأمعاء في الجسم الحي. ويعزى احتمال تشكيل organoids من سرداب إلى وجود الخلايا الجذعية1. الزغب المعوي من ناحية أخرى تتكون فقط من خلايا مختلفة، وبالتالي لا يمكن تشكيل organoids. ومع ذلك، قد تؤدي الطفرات2 أو الشروط التي تسمح dedifferentiation من ظهارة villus إلى الخلايا الجذعية في زغب2،3. يمكن تأكيد هذا التغيير المصيري الناتج عن الجذعية في ظهارة السيلي عن طريق طلاء ظهارة villus المتمايزة في مصفوفة ثلاثية الأبعاد لتحديد إمكاناتها لتشكيل الجهاز كمؤشر على النبع من الدي نوفو في ظهارة villus. وبالتالي ، فإن الجانب الحاسم من هذا الإجراء هو ضمان عدم وجود تلوث سرداب.
وSmad4KO:β-cateninGOF الطفرة الشرطية يسبب dedifferentiation في ظهارة الأمعاء تميزت التعبير عن الانتشار وعلامات الخلايا الجذعية في الزغب, وفي نهاية المطاف تشكيل هياكل مثل سرداب في زغب يشار إليها باسم سرداب خارج الرحم تم تحديد وجود هذه الخلايا الجذعية هذه villi dedifferentiated من خلال التعبير عن علامات الخلايا الجذعية في سرداب خارج الرحم(في الجسم الحي)وقدرة الزغب متحولة لتشكيل organoids wh en مطلي ماتريجل3. الإجراء المذكور أدناه يوضح المنهجية المستخدمة لتأكيد الجذعية من ظهارة الأمعاء المتمايزة في Smad4 KO:β-cateninGOF الفئران المتحولة. كانت إحدى السمات الرئيسية لهذه المنهجية لعزل الزغب هي استخدام كشط التجويف المعوي ، بدلا منطريقةEDTA 4. على عكس طريقة إزالة EDTA ، تحتفظ عزلة الزغب عن طريق كشط غالبية mesenchyme الأساسي وتسمح بضبط ضغط الكشط لتسفر عن زغب بدون سرداب مربوطة. ضغط كشط ذاتية للمشغل، وبالتالي، يجب تحديد الضغط الأمثل لتسفر عن زغب دون سرداب المربوطة تجريبيا من قبل المشغل. الجانب الحاسم من هذا الإجراء هو ضمان عدم وجود تلوث سرداب عن طريق الفحص المجهري للزغب قبل وبعد الطلاء في مصفوفة BME-R1.
يتم كشط زغب الأمعاء قبالة التجويف المعوي مع الشرائح الزجاجية ووضعها في مرشح 70 ميكرومتر وغسلها مع برنامج تلفزيوني للتخلص من الخلايا فضفاضة أو سرداب، إن وجدت، قبل الطلاء في مصفوفة BME-R1. وتشدد هذه الطريقة على المعايير التالية لتجنب التلوث سرداب: أ) حصر حصاد الزغب النصف القريب من الاثني عشر حيث الزغب هي الأطول، ب) التقليل من عدد الخدوش ذات العائد الزغب، ج) غسل المرشح الذي يحتوي على الزغب من خلال سلسلة من برنامج تلفزيوني في طبق من ستة آبار، و د) مما يؤكد عدم وجود تلوث سرداب عن طريق الفحص المجهري قبل وبعد الطلاء في مصفوفة BME-R1. عزل سيلي عن طريق كشط، بدلا من EDTA chelation، يمنع فقدان كامل من mesenchyme الكامنة التي قد توفر إشارات المتخصصة5،6،7،8، إذا لزم الأمر، لبدء organoid من ظهارة villus.
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن أن تؤكد هذه الطريقة قدرة التجديد الذاتي لظهارة السيلي المتمايزة التي تكتسب علامات الخلايا الجذعية في الجسم الحي. يمكن أن تؤدي ظهارة الأمعاء العادية إلى ظهور أعضاء من سرداب ولكن ليس مقصورة الزغب ، عندما تكون مثقفة في 3D بسبب وجود خلايا جذعية في سرداب1. وهكذا، فإن تكوين…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا المنشور من قبل جائزة رقم K22 CA218462-03 من المعهد الوطني للسرطان NIH. كانت خلايا HEK293-T التي تعبر عن R-Spondin1 هدية سخية من الدكتور مايكل ب. فيرزي.
Materials
| Advanced DMEM F-12 media | Gibco | 12634010 | |
| 3,3-diaminobenzidine | Vector Labs | SK-4105 | |
| 96 well U-bottom plate | Fisher Scientific | FB012932 | |
| ABC kit | Vector Labs | PK4001 | |
| Angled scissor | Fisher Scientific | 11-999 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9703100 | |
| CD44 antibody | BioLegend | 1030001 | |
| Cdx2 antibody | Cell Signaling | 12306 | |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | |
| Corning 70-micron cell strainer | Life Sciences | 431751 | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type R1 | R&D | 3433-005-R1 | |
| Dissection scissors | Fisher Scientific | 22-079-747 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 17-456-209 | |
| Glutamax (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| HEK 293-T cells expressing RSPO-1 | Gift from Dr. Michael Verzi | ||
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Histogel | Thermoscientific | HG-4000-012 | |
| Mesh filter | Fisher Scientific | 07-201-431 | |
| Micrscope glass slide | VWR | 89218-844 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| p200 Blunt tips | VWR | 46620-642 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Primocin (50mg/mL) | Invivogen | ant-pm-1 | |
| Quality Biological Inc PBS (10X) | Fisher Scientific | 50-146-770 | |
| Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| Signal diluent | Cell Signaling | 8112L | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | |
| 6-well tissue culture plate | Fisher Scientific | 50-146-770 |
Referências
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Schwitalla, S., et al. Intestinal tumorigenesis initiated by dedifferentiation and acquisition of stem-cell-like properties. Cell. 152 (1-2), 25-38 (2013).
- Perekatt, A. O., et al. SMAD4 Suppresses WNT-Driven Dedifferentiation and Oncogenesis in the Differentiated Gut Epithelium. Pesquisa do Câncer. 78 (17), 4878-4890 (2018).
- Roche, J. K. Isolation of a purified epithelial cell population from human colon. Methods in Molecular Medicine. 50, 15-20 (2001).
- Aoki, R., et al. Foxl1-expressing mesenchymal cells constitute the intestinal stem cell niche. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (2), 175-188 (2016).
- Seiler, K. M., et al. Tissue underlying the intestinal epithelium elicits proliferation of intestinal stem cells following cytotoxic damage. Cell and Tissue Research. 361 (2), 427-438 (2015).
- Stzepourginski, I., et al. CD34+ mesenchymal cells are a major component of the intestinal stem cells niche at homeostasis and after injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (4), 506-513 (2017).
- Roulis, M., et al. Paracrine orchestration of intestinal tumorigenesis by a mesenchymal niche. Nature. 580 (7804), 524-529 (2020).
- Haramis, A. P., et al. De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine. Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).
- Madison, B. B., et al. Epithelial hedgehog signals pattern the intestinal crypt-villus axis. Development. 132 (2), 279-289 (2005).
- van Es, J. H., et al. Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage. Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).
- Tetteh, P. W., et al. Replacement of Lost Lgr5-Positive Stem Cells through Plasticity of Their Enterocyte-Lineage Daughters. Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).
- Baulies, A., et al. The Transcription Co-Repressors MTG8 and MTG16 Regulate Exit of Intestinal Stem Cells From Their Niche and Differentiation Into Enterocyte vs Secretory Lineages. Gastroenterology. 159 (4), 1328-1341 (2020).
- Zeilstra, J., et al. Stem cell CD44v isoforms promote intestinal cancer formation in Apc(min) mice downstream of Wnt signaling. Oncogene. 33 (5), 665-670 (2014).
- Gracz, A. D., et al. Brief report: CD24 and CD44 mark human intestinal epithelial cell populations with characteristics of active and facultative stem cells. Stem Cells. 31 (9), 2024-2030 (2013).
- Gao, N., White, P., Kaestner, K. H. Establishment of intestinal identity and epithelial-mesenchymal signaling by Cdx2. Developmental Cell. 16 (4), 588-599 (2009).
- Verzi, M. P., Shin, H., Ho, L. L., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. Essential and redundant functions of caudal family proteins in activating adult intestinal genes. Molecular and Cellular Biology. 31 (10), 2026-2039 (2011).
- Verzi, M. P., Shin, H., San Roman, A. K., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. Intestinal master transcription factor CDX2 controls chromatin access for partner transcription factor binding. Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 281-292 (2013).
- Grainger, S., Hryniuk, A., Lohnes, D. Cdx1 and Cdx2 exhibit transcriptional specificity in the intestine. PLoS One. 8 (1), 54757 (2013).
- Stringer, E. J., et al. Cdx2 determines the fate of postnatal intestinal endoderm. Development. 139 (3), 465-474 (2012).
