3D Культивирование органоидов из эпителия ворсинок кишечника, подвергающихся дедифференциации
Summary
Процедура описывает выделение ворсинок из кишечного эпителия мыши, подвергающегося дедифференциации для определения их органообразующего потенциала.
Abstract
Клоногенность органоидов из кишечного эпителия объясняют наличием в нем стволовых клеток. Эпителий тонкого кишечника мыши разделен на крипты и ворсинки: стволовые и пролиферантные клетки ограничены криптами, тогда как эпителий ворсинок содержит только дифференцированные клетки. Следовательно, нормальные кишечные крипты, но не ворсинки, могут давать начало органоидам в 3D-культурах. Процедура, описанная здесь, применима только к эпителию ворсий, подвергающихся дедифференциации, приводящей к стволовости. Описанный метод использует Smad4-loss-of-function:β-catenin gain-of-function (Smad4 KO:β-cateninGOF)условной мутантной мыши. Мутация заставляет кишечные ворсинки дедифференцироваться и генерировать стволовые клетки в ворсинах. Кишечные ворсинки, подвергающиеся дедифференциации, соскребаются с кишечника с помощью стеклянных слайдов, помещаются в ситечко 70 мкм и промываются несколько раз, чтобы отфильтровать любые рыхлые клетки или крипты перед покрытием в матрице BME-R1 для определения их органоидообразующего потенциала. Два основных критерия были использованы для обеспечения того, чтобы полученные органоиды были разработаны из дедифференцирующего ворсиночного отсека, а не из крипт: 1) микроскопическая оценка изолированных ворсинок для обеспечения отсутствия каких-либо привязанных крипт, как до, так и после покрытия в 3D-матрице, и 2) мониторинг временного хода развития органоидов из ворсинок. Органоидное инициация из ворсинок происходит только через два-пять дней после покрытия и выглядит неправильной формы, тогда как органоиды, полученные из того же кишечного эпителия, проявляются в течение шестнадцати часов после покрытия и кажутся сферическими. Ограничение метода, однако, заключается в том, что количество органоидов, образующихся, и время, необходимое для инициации органоидов из ворсинок, варьируются в зависимости от степени дедифференциации. Следовательно, в зависимости от специфики мутации или оскорбления, вызывающего дедифференциацию, оптимальная стадия, на которой ворсинки могут быть извлечены для анализа их органоидообразующего потенциала, должна быть определена эмпирически.
Introduction
Кишечные крипты, но не ворсинки, образуют органоиды при культивировании в матрице Matrigel или BME-R1. Эти органоиды являются самоорганизующимися структурами, часто называемыми «мини-кишечником» из-за наличия различных дифференцированных линий, прародителя и стволовых клеток, присутствующих в кишечном эпителии in vivo. Потенциал образования органоидов из крипт объясняется наличием стволовых клеток1. Кишечные ворсинки, с другой стороны, состоят только из дифференцированных клеток и, следовательно, не могут образовывать органоиды. Однако мутации2 или условия, допускающих дедифференцировку эпителия ворсинок, могут привести к стволовым клеткам в ворсинках2,3. Это изменение судьбы, приводящее к стволу в эпителии ворсинок, может быть подтверждено путем покрытия дедифференцирующего эпителия ворсинок в 3D-матрице для определения их органоидообразующего потенциала в качестве индикатора de-novo ствола в эпителии ворсинок. Следовательно, критическим аспектом этой процедуры является обеспечение отсутствия загрязнения крипты.
Условнаямутация Smad4 KO:β-катенинGOF вызывает дедифференциацию в кишечном эпителии, отмеченную экспрессией пролиферации и маркеров стволовых клеток в ворсинках, и в конечном итоге образованием криптоподобных структур в ворсинках, называемых эктопическими криптами Наличие стволовых клеток этих дедифференцированных ворсинок определялось экспрессией маркеров стволовых клеток в эктопических криптах(in vivo)и способностью мутантных ворсинок образовывать органоиды, в которых en покрыт Матригель3. Нижеупомянутая процедура разрабатывает методологию, используемую для подтверждения стволовости дедифференцирующего кишечного эпителия у мутантных мышей Smad4KO:β-катенинGOF. Ключевой особенностью данной методики выделения ворсинок стало использование соскоба просвета кишечника, в отличие от метода хелатирования ЭДТА4. В отличие от метода хелатирования ЭДТА, выделение ворсинок скребком сохраняет большую часть лежащей в основе мезенхимы и позволяет регулировать давление соскоба для получения ворсинок без привязанных крипт. Давление соскоба субъективно для оператора, следовательно, оптимальное давление для получения ворсинок без привязанных крипт должно быть определено оператором эмпирически. Критическим аспектом данной процедуры является обеспечение отсутствия криптоконта при микроскопическом исследовании ворсинок как до, так и после нанесения покрытия в матрицу BME-R1.
Кишечные ворсинки соскребаются с кишечного просвета стеклянными слайдами и помещаются в фильтр 70 мкм и промываются PBS, чтобы избавиться от рыхлых клеток или крипт, если таковые имеются, перед покрытием в матрице BME-R1. Метод подчеркивает следующие критерии, чтобы избежать загрязнения крипты: а) ограничение ворсинок в ближайшей половине двенадцатиперстной кишки, где ворсинки являются самыми длинными, б) минимизация количества ворсинчатых царапин, в) промывка фильтра, содержащего ворсинки, через серию PBS в шестискважинной посуде и г) подтверждение отсутствия загрязнения крипты микроскопическим исследованием до и после покрытия в матрице BME-R1. Выделение ворсинок путем соскоба, а не хелатирования ЭДТА, предотвращает полную потерю основного мезенхима, который может обеспечить нишевые сигналы5,6,7,8,если это необходимо, для органоидного инициирования из эпителия ворсинок.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот метод может подтвердить способность к самообновлению дедифференцирующего эпителия ворсинок, которые приобретают маркеры стволовых клеток in vivo. Нормальный кишечный эпителий может давать начало органоидам из крипты, но не из ворсинчатого отсека, при культивировании в 3D из-за …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта публикация была поддержана наградой No K22 CA218462-03 от Национального института рака NIH. HEK293-Т-клетки, экспрессивающие R-Spondin1, были щедрым подарком от доктора Майкла. Верци.
Materials
| Advanced DMEM F-12 media | Gibco | 12634010 | |
| 3,3-diaminobenzidine | Vector Labs | SK-4105 | |
| 96 well U-bottom plate | Fisher Scientific | FB012932 | |
| ABC kit | Vector Labs | PK4001 | |
| Angled scissor | Fisher Scientific | 11-999 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9703100 | |
| CD44 antibody | BioLegend | 1030001 | |
| Cdx2 antibody | Cell Signaling | 12306 | |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | |
| Corning 70-micron cell strainer | Life Sciences | 431751 | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type R1 | R&D | 3433-005-R1 | |
| Dissection scissors | Fisher Scientific | 22-079-747 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 17-456-209 | |
| Glutamax (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| HEK 293-T cells expressing RSPO-1 | Gift from Dr. Michael Verzi | ||
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Histogel | Thermoscientific | HG-4000-012 | |
| Mesh filter | Fisher Scientific | 07-201-431 | |
| Micrscope glass slide | VWR | 89218-844 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| p200 Blunt tips | VWR | 46620-642 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Primocin (50mg/mL) | Invivogen | ant-pm-1 | |
| Quality Biological Inc PBS (10X) | Fisher Scientific | 50-146-770 | |
| Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| Signal diluent | Cell Signaling | 8112L | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | |
| 6-well tissue culture plate | Fisher Scientific | 50-146-770 |
Referências
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Schwitalla, S., et al. Intestinal tumorigenesis initiated by dedifferentiation and acquisition of stem-cell-like properties. Cell. 152 (1-2), 25-38 (2013).
- Perekatt, A. O., et al. SMAD4 Suppresses WNT-Driven Dedifferentiation and Oncogenesis in the Differentiated Gut Epithelium. Pesquisa do Câncer. 78 (17), 4878-4890 (2018).
- Roche, J. K. Isolation of a purified epithelial cell population from human colon. Methods in Molecular Medicine. 50, 15-20 (2001).
- Aoki, R., et al. Foxl1-expressing mesenchymal cells constitute the intestinal stem cell niche. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (2), 175-188 (2016).
- Seiler, K. M., et al. Tissue underlying the intestinal epithelium elicits proliferation of intestinal stem cells following cytotoxic damage. Cell and Tissue Research. 361 (2), 427-438 (2015).
- Stzepourginski, I., et al. CD34+ mesenchymal cells are a major component of the intestinal stem cells niche at homeostasis and after injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (4), 506-513 (2017).
- Roulis, M., et al. Paracrine orchestration of intestinal tumorigenesis by a mesenchymal niche. Nature. 580 (7804), 524-529 (2020).
- Haramis, A. P., et al. De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine. Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).
- Madison, B. B., et al. Epithelial hedgehog signals pattern the intestinal crypt-villus axis. Development. 132 (2), 279-289 (2005).
- van Es, J. H., et al. Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage. Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).
- Tetteh, P. W., et al. Replacement of Lost Lgr5-Positive Stem Cells through Plasticity of Their Enterocyte-Lineage Daughters. Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).
- Baulies, A., et al. The Transcription Co-Repressors MTG8 and MTG16 Regulate Exit of Intestinal Stem Cells From Their Niche and Differentiation Into Enterocyte vs Secretory Lineages. Gastroenterology. 159 (4), 1328-1341 (2020).
- Zeilstra, J., et al. Stem cell CD44v isoforms promote intestinal cancer formation in Apc(min) mice downstream of Wnt signaling. Oncogene. 33 (5), 665-670 (2014).
- Gracz, A. D., et al. Brief report: CD24 and CD44 mark human intestinal epithelial cell populations with characteristics of active and facultative stem cells. Stem Cells. 31 (9), 2024-2030 (2013).
- Gao, N., White, P., Kaestner, K. H. Establishment of intestinal identity and epithelial-mesenchymal signaling by Cdx2. Developmental Cell. 16 (4), 588-599 (2009).
- Verzi, M. P., Shin, H., Ho, L. L., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. Essential and redundant functions of caudal family proteins in activating adult intestinal genes. Molecular and Cellular Biology. 31 (10), 2026-2039 (2011).
- Verzi, M. P., Shin, H., San Roman, A. K., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. Intestinal master transcription factor CDX2 controls chromatin access for partner transcription factor binding. Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 281-292 (2013).
- Grainger, S., Hryniuk, A., Lohnes, D. Cdx1 and Cdx2 exhibit transcriptional specificity in the intestine. PLoS One. 8 (1), 54757 (2013).
- Stringer, E. J., et al. Cdx2 determines the fate of postnatal intestinal endoderm. Development. 139 (3), 465-474 (2012).
