Cultivo 3D de organoides del epitelio de las vellosidades intestinales sometidos a desdiferenciación
Summary
El procedimiento describe el aislamiento de las vellosidades del epitelio intestinal del ratón sometido a desdiferenciación para determinar su potencial de formación de organoides.
Abstract
La clonogenicidad de los organoides del epitelio intestinal se atribuye a la presencia de células madre en el mismo. El epitelio del intestino delgado del ratón está compartimentado en criptas y vellosidades: las células madre y proliferantes están confinadas a las criptas, mientras que el epitelio de las vellosidades contiene solo células diferenciadas. Por lo tanto, las criptas intestinales normales, pero no las vellosidades, pueden dar lugar a organoides en cultivos 3D. El procedimiento descrito aquí es aplicable solo a las vellosidades epiteliales sometidas a desdiferenciación que conduce a la esteronía. El método descrito utiliza el ratón mutante condicional Smad4-pérdida-de-función:β-catenina ganancia-de-función (Smad4 KO:β-cateninaGOF). La mutación hace que las vellosidades intestinales se desdiferencian y generen células madre en las vellosidades. Las vellosidades intestinales sometidas a desdiferenciación se raspan del intestino utilizando portaobjetos de vidrio, se colocan en un colador de 70 μm y se lavan varias veces para filtrar cualquier célula suelta o criptas antes del recubrimiento en la matriz BME-R1 para determinar su potencial de formación de organoides. Se utilizaron dos criterios principales para garantizar que los organoides resultantes se desarrollaran a partir del compartimento de vellosidades desdiferenciantes y no de las criptas: 1) evaluar microscópicamente las vellosidades aisladas para garantizar la ausencia de criptas atadas, tanto antes como después del revestimiento en la matriz 3D, y 2) monitorear el curso temporal del desarrollo de organoides desde las vellosidades. La iniciación organoidea de las vellosidades ocurre solo de dos a cinco días después del recubrimiento y aparece con forma irregular, mientras que los organoides derivados de la cripta del mismo epitelio intestinal son evidentes dentro de las dieciséis horas posteriores al recubrimiento y parecen esféricos. La limitación del método, sin embargo, es que el número de organoides formados y el tiempo requerido para la iniciación organoide de las vellosidades varían según el grado de desdiferenciación. Por lo tanto, dependiendo de la especificidad de la mutación o el insulto que causa la desdiferenciación, la etapa óptima en la que se pueden cosechar vellosidades para evaluar su potencial de formación de organoides debe determinarse empíricamente.
Introduction
Las criptas intestinales, pero no las vellosidades, forman organoides cuando se cultivan en matriz Matrigel o BME-R1. Estos organoides son estructuras autoorganizadas, a menudo denominadas “mini-intestino” debido a la presencia de los diversos linajes diferenciados, progenitores y células madre presentes en el epitelio intestinal in vivo. El potencial para formar organoides a partir de criptas se atribuye a la presencia de células madre1. Las vellosidades intestinales, por otro lado, consisten solo en células diferenciadas y, por lo tanto, no pueden formar organoides. Sin embargo, las mutaciones2 o condiciones que permiten la desdiferenciación del epitelio de las vellosidades pueden conducir a células madre en las vellosidades2,3. Este cambio de destino que resulta en el tallo en el epitelio de las vellosidades se puede confirmar mediante el recubrimiento del epitelio de vellosidad desdiferenciante en la matriz 3D para determinar su potencial de formación de organoides como un indicador de la virola de novo en el epitelio de las vellosidades. Por lo tanto, el aspecto crítico de este procedimiento es garantizar la ausencia de contaminación por criptas.
La mutación condicional Smad4KO:β-cateninaGOF causa desdiferenciación en el epitelio intestinal marcada por la expresión de la proliferación y los marcadores de células madre en las vellosidades, y eventualmente la formación de estructuras similares a criptas en las vellosidades conocidas como criptas ectópicas La presencia de células madre estas vellosidades desdiferenciadas fue determinada por la expresión de marcadores de células madre en las criptas ectópicas(in vivo)y la capacidad de las vellosidades mutantes para formar organoides wh en chapado Matrigel3. El procedimiento mencionado a continuación elabora la metodología utilizada para confirmar el tallo del epiteliointestinal indiferenciante en los ratones mutantes Smad4 KO:β-cateninaGOF. Una característica clave de esta metodología para aislar las vellosidades fue el uso del raspado de la luz intestinal, a diferencia del método de quelación con EDTA4. A diferencia del método de quelación EDTA, el aislamiento de vellosidades por raspado retiene la mayoría del mesénquima subyacente y permite ajustar la presión del raspado para producir vellosidades sin criptas atadas. La presión de raspado es subjetiva para el operador, por lo tanto, la presión óptima para producir vellosidades sin criptas atadas debe ser determinada empíricamente por el operador. El aspecto crítico de este procedimiento es garantizar la ausencia de contaminación por cripta mediante el examen microscópico de las vellosidades tanto antes como después del recubrimiento en la matriz BME-R1.
Las vellosidades intestinales se raspan de la luz intestinal con portaobjetos de vidrio y se colocan en un filtro de 70 μm y se lavan con PBS para deshacerse de las células sueltas o criptas, si las hay, antes del recubrimiento en la matriz BME-R1. El método hace hincapié en los siguientes criterios para evitar la contaminación de la cripta: a) confinar las vellosidades de la mitad proximal del duodeno donde las vellosidades son las más largas, b) minimizar el número de rasguños que producen vellosidades, c) lavar el filtro que contiene las vellosidades a través de una serie de PBS en un plato de seis pozos, y d) confirmar la ausencia de contaminación de la cripta mediante un examen microscópico antes y después del recubrimiento en la matriz BME-R1. El aislamiento de vellosidades por raspado, en lugar de por quelación con EDTA, evita la pérdida completa del mesénquima subyacente que puede proporcionar las señales de nicho5,6,7,8,si es necesario, para la iniciación organoidea desde el epitelio de vellosidades.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este método puede confirmar la capacidad de autorrenovación de las vellosidades desdiferenciadoras del epitelio que adquieren marcadores de células madre in vivo. El epitelio intestinal normal puede dar lugar a organoides de la cripta pero no del compartimento de vellosidades, cuando se cultiva en 3D debido a la presencia de células madre en las criptas1. Por lo tanto, la formación de organoides a partir del epitelio de vellosidades desdiferenciadas cultivadas en cultivos 3D confirma…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta publicación fue apoyada por el Premio Número K22 CA218462-03 del Instituto Nacional del Cáncer de los NIH. Las células HEK293-T que expresan R-Spondin1 fueron un generoso regalo del Dr. Michael P. Verzi.
Materials
| Advanced DMEM F-12 media | Gibco | 12634010 | |
| 3,3-diaminobenzidine | Vector Labs | SK-4105 | |
| 96 well U-bottom plate | Fisher Scientific | FB012932 | |
| ABC kit | Vector Labs | PK4001 | |
| Angled scissor | Fisher Scientific | 11-999 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9703100 | |
| CD44 antibody | BioLegend | 1030001 | |
| Cdx2 antibody | Cell Signaling | 12306 | |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | |
| Corning 70-micron cell strainer | Life Sciences | 431751 | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type R1 | R&D | 3433-005-R1 | |
| Dissection scissors | Fisher Scientific | 22-079-747 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 17-456-209 | |
| Glutamax (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| HEK 293-T cells expressing RSPO-1 | Gift from Dr. Michael Verzi | ||
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Histogel | Thermoscientific | HG-4000-012 | |
| Mesh filter | Fisher Scientific | 07-201-431 | |
| Micrscope glass slide | VWR | 89218-844 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| p200 Blunt tips | VWR | 46620-642 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Primocin (50mg/mL) | Invivogen | ant-pm-1 | |
| Quality Biological Inc PBS (10X) | Fisher Scientific | 50-146-770 | |
| Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| Signal diluent | Cell Signaling | 8112L | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | |
| 6-well tissue culture plate | Fisher Scientific | 50-146-770 |
Referências
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