פולחן תלת מימדי של אורגנוידים מאפיתל וילי במעיים העוברים דיפרנציה
Summary
ההליך מתאר בידוד של villi מן אפיתל מעי העכבר עובר דיפרנטיציה כדי לקבוע את פוטנציאל יצירת האורגנויד שלהם.
Abstract
קלוגוגניות של organoids מן האפיתל המעי מיוחסת לנוכחות של תאי גזע בו. האפיתל המעי הקטן של העכבר ממודר לתוך קריפטות ו villi: הגבעול ותאי המתרבים מוגבלים הקריפטות, ואילו אפיתל villi מכיל רק תאים מובחנים. לפיכך, קריפטות מעיים נורמליות, אבל לא villi, יכול להוליד organoids בתרבויות 3D. ההליך המתואר כאן חל רק על אפיתל villus העובר דיפרנציה המובילה לגבעול. השיטה המתוארת משתמשת Smad4-אובדן-פונקציה:β-catenin רווח של פונקציה (Smad4KO:β-cateninGOF) עכבר מוטציה מותנה. המוטציה גורמת לוילי המעיים להשפריץ וליצור תאי גזע בוילי. villi מעיים עוברים דיפרנציה הם גירד את המעי באמצעות שקופיות זכוכית, להציב מסננת 70 מיקרומטר ונשטף מספר פעמים כדי לסנן את כל תאים רופפים או קריפטות לפני ציפוי במטריצה BME-R1 כדי לקבוע את הפוטנציאל שלהם ליצירת organoid. שני קריטריונים עיקריים שימשו כדי להבטיח כי organoids וכתוצאה מכך פותחו מתא villus dedifferentiating ולא מן הקריפטות: 1) הערכה מיקרוסקופית villi מבודד כדי להבטיח היעדר כל קריפטות קשורות, הן לפני ואחרי ציפוי במטריצה 3D, ו 2) ניטור מסלול הזמן של התפתחות organoid מן villi. חניכת אורגנויד מן villi מתרחשת רק יומיים עד חמישה ימים לאחר ציפוי ונראה בצורה לא סדירה, ואילו organoids נגזר קריפטה מאותו אפיתל מעיים נראים בתוך שש עשרה שעות של ציפוי ונראה כדורי. המגבלה של השיטה, עם זאת, היא כי מספר organoids נוצר, ואת הזמן הנדרש עבור חניכה organoid מן villi להשתנות בהתאם למידת הדיפרנציה. לפיכך, בהתאם לייחודיות המוטציה או העלבון הגורם להשתמטות, יש לקבוע אמפירית את השלב האופטימלי שבו ניתן לקצור את villi כדי לבחון את פוטנציאל יצירת האורגנויד שלהם.
Introduction
קריפטות מעיים אבל לא villi, ליצור organoids כאשר תרבית מטריצת מטריגת מטריגת מטריגת BME-R1. אורגנוידים אלה הם מבנים המארגנים את עצמם, המכונים לעתים קרובות “מיני מעיים” בשל נוכחותם של שושלות שונות, אבות ותאי גזע הנמצאים אפיתל המעי ב vivo. הפוטנציאל ליצור organoids מ קריפטות מיוחס לנוכחות של תאי גזע1. villi המעיים לעומת זאת מורכב רק תאים מובחנים, ולכן לא יכול ליצור organoids. עם זאת, מוטציות 2 אותנאים המאפשרים דיפרנטיציה של אפיתל villus עלול להוביל לתאי גזע villi2,3. שינוי גורל זה וכתוצאה מכך גזענות אפיתל villi יכול להיות מאושר על ידי ציפוי אפיתל villus dedederentiating במטריצה 3D כדי לקבוע את הפוטנציאל שלהם יצירת organoid כאינדיקטור של גזעיות דה נובו אפיתל villus. לפיכך, ההיבט הקריטי של הליך זה הוא להבטיח היעדר זיהום קריפטה.
Smad4KO: מוטציה מותנית β-קטניןGOF גורמת להפיכת האפיתל במעיים המסומנים על ידי ביטוי של סמני התפשטות ותאי גזע בוילי, ובסופו של דבר היווצרות מבנים דמויי קריפטה בוילי המכונה קריפטות חוץ רחמיות נוכחותם של תאי גזע אלה וילי מפוזרים נקבעה על ידי ביטוי של סמני תאי גזע בקריפטות ה חוץ רחמיות (בוויוו) והיכולת של הווילי המוטנטי ליצור אורנואידים wh en plated Matrigel3. הנוהל המוזכר להלן מפרט את המתודולוגיה המשמשת לאישור הגבעול של אפיתל המעיים המשתמט ב- Smad4KO: β עכברי מוטציה מסוג Smad4-cateninGOF. מאפיין מרכזי של מתודולוגיה זו לבידוד villi היה השימוש של גירוד של לומן המעי, בניגוד לשיטת כלציה EDTA4. שלא כמו בשיטת EDTA chelation, בידוד villi על ידי גירוד שומר על רוב mesenchyme הבסיסי ומאפשר להתאים את הלחץ של גירוד כדי להניב villi ללא קריפטות קשורות. הלחץ של גירוד הוא סובייקטיבי למפעיל, ומכאן, הלחץ האופטימלי להניב villi ללא קריפטות קשורות חייב להיקבע אמפירית על ידי המפעיל. ההיבט הקריטי של הליך זה הוא להבטיח את היעדר זיהום הקריפטה על ידי בדיקה מיקרוסקופית של villi הן לפני ואחרי ציפוי במטריצה BME-R1.
villi מעיים הם גירד את לומן המעי עם שקופיות זכוכית להציב מסנן 70 מיקרומטר ונשטף עם PBS כדי להיפטר תאים רופפים או קריפטות, אם בכלל, לפני ציפוי במטריצה BME-R1. השיטה מדגישה את הקריטריונים הבאים כדי למנוע זיהום קריפטה: א) ממזג את הקציר villi החצי הפרוקסימלי של התריסריון שבו villi הם הארוכים ביותר, ב) מזעור מספר שריטות מניב villi, ג) שטיפת המסנן המכיל את villi באמצעות סדרה של PBS בצלחת שש באר, ו- d) המאשר את היעדר זיהום קריפטה על ידי בדיקה מיקרוסקופית לפני ואחרי ציפוי מטריצת BME-R1. בידוד Villi על ידי גירוד, ולא על ידי EDTA chelation, מונע אובדן מוחלט של mesenchyme הבסיסי שעשוי לספק את אותות הנישה5,6,7,8, במידת הצורך, עבור חניכה organoid מן אפיתל villus.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטה זו יכולה לאשר את יכולת ההתחדשות העצמית של אפיתל villi dedifferentiating שרוכשים סמני תאי גזע ב vivo. אפיתל המעיים הרגיל יכול להוליד אורגנוידים מהקריפטה אך לא את תא villi, כאשר תרבית בתלת ממד בגלל נוכחותם של תאי גזע בקריפטות1. לכן, היווצרות organoid מן אפיתל villi מפוזר בתרבית תרביתות 3D מאשר…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
פרסום זה נתמך על ידי פרס מספר K22 CA218462-03 מהמכון הלאומי לסרטן NIH. תאי HEK293-T המבטאים R-Spondin1 היו מתנה נדיבה מד”ר מייקל פ Verzi.
Materials
| Advanced DMEM F-12 media | Gibco | 12634010 | |
| 3,3-diaminobenzidine | Vector Labs | SK-4105 | |
| 96 well U-bottom plate | Fisher Scientific | FB012932 | |
| ABC kit | Vector Labs | PK4001 | |
| Angled scissor | Fisher Scientific | 11-999 | |
| Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) Protease-free Powder | Fisher Scientific | BP9703100 | |
| CD44 antibody | BioLegend | 1030001 | |
| Cdx2 antibody | Cell Signaling | 12306 | |
| Corn oil | Sigma-Aldrich | C8267-500ML | |
| Corning 70-micron cell strainer | Life Sciences | 431751 | |
| Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type R1 | R&D | 3433-005-R1 | |
| Dissection scissors | Fisher Scientific | 22-079-747 | |
| Forceps | Fisher Scientific | 17-456-209 | |
| Glutamax (100X) | Gibco | 35050-061 | |
| HEK 293-T cells expressing RSPO-1 | Gift from Dr. Michael Verzi | ||
| HEPES (1M) | Gibco | 15630-080 | |
| Histogel | Thermoscientific | HG-4000-012 | |
| Mesh filter | Fisher Scientific | 07-201-431 | |
| Micrscope glass slide | VWR | 89218-844 | |
| N-2 Supplement (100X) | Gibco | 17502048 | |
| N-acetyl cysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| p200 Blunt tips | VWR | 46620-642 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | |
| Primocin (50mg/mL) | Invivogen | ant-pm-1 | |
| Quality Biological Inc PBS (10X) | Fisher Scientific | 50-146-770 | |
| Recombinant Murine Noggin | Peprotech | 250-38 | |
| Signal diluent | Cell Signaling | 8112L | |
| Tamoxifen | Sigma-Aldrich | T5648-1G | |
| 6-well tissue culture plate | Fisher Scientific | 50-146-770 |
Referências
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Schwitalla, S., et al. Intestinal tumorigenesis initiated by dedifferentiation and acquisition of stem-cell-like properties. Cell. 152 (1-2), 25-38 (2013).
- Perekatt, A. O., et al. SMAD4 Suppresses WNT-Driven Dedifferentiation and Oncogenesis in the Differentiated Gut Epithelium. Pesquisa do Câncer. 78 (17), 4878-4890 (2018).
- Roche, J. K. Isolation of a purified epithelial cell population from human colon. Methods in Molecular Medicine. 50, 15-20 (2001).
- Aoki, R., et al. Foxl1-expressing mesenchymal cells constitute the intestinal stem cell niche. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 2 (2), 175-188 (2016).
- Seiler, K. M., et al. Tissue underlying the intestinal epithelium elicits proliferation of intestinal stem cells following cytotoxic damage. Cell and Tissue Research. 361 (2), 427-438 (2015).
- Stzepourginski, I., et al. CD34+ mesenchymal cells are a major component of the intestinal stem cells niche at homeostasis and after injury. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (4), 506-513 (2017).
- Roulis, M., et al. Paracrine orchestration of intestinal tumorigenesis by a mesenchymal niche. Nature. 580 (7804), 524-529 (2020).
- Haramis, A. P., et al. De novo crypt formation and juvenile polyposis on BMP inhibition in mouse intestine. Science. 303 (5664), 1684-1686 (2004).
- Madison, B. B., et al. Epithelial hedgehog signals pattern the intestinal crypt-villus axis. Development. 132 (2), 279-289 (2005).
- van Es, J. H., et al. Dll1+ secretory progenitor cells revert to stem cells upon crypt damage. Nature Cell Biology. 14 (10), 1099-1104 (2012).
- Tetteh, P. W., et al. Replacement of Lost Lgr5-Positive Stem Cells through Plasticity of Their Enterocyte-Lineage Daughters. Cell Stem Cell. 18 (2), 203-213 (2016).
- Baulies, A., et al. The Transcription Co-Repressors MTG8 and MTG16 Regulate Exit of Intestinal Stem Cells From Their Niche and Differentiation Into Enterocyte vs Secretory Lineages. Gastroenterology. 159 (4), 1328-1341 (2020).
- Zeilstra, J., et al. Stem cell CD44v isoforms promote intestinal cancer formation in Apc(min) mice downstream of Wnt signaling. Oncogene. 33 (5), 665-670 (2014).
- Gracz, A. D., et al. Brief report: CD24 and CD44 mark human intestinal epithelial cell populations with characteristics of active and facultative stem cells. Stem Cells. 31 (9), 2024-2030 (2013).
- Gao, N., White, P., Kaestner, K. H. Establishment of intestinal identity and epithelial-mesenchymal signaling by Cdx2. Developmental Cell. 16 (4), 588-599 (2009).
- Verzi, M. P., Shin, H., Ho, L. L., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. Essential and redundant functions of caudal family proteins in activating adult intestinal genes. Molecular and Cellular Biology. 31 (10), 2026-2039 (2011).
- Verzi, M. P., Shin, H., San Roman, A. K., Liu, X. S., Shivdasani, R. A. Intestinal master transcription factor CDX2 controls chromatin access for partner transcription factor binding. Molecular and Cellular Biology. 33 (2), 281-292 (2013).
- Grainger, S., Hryniuk, A., Lohnes, D. Cdx1 and Cdx2 exhibit transcriptional specificity in the intestine. PLoS One. 8 (1), 54757 (2013).
- Stringer, E. J., et al. Cdx2 determines the fate of postnatal intestinal endoderm. Development. 139 (3), 465-474 (2012).
