Summary
जेब्राफिश भ्रूण/लार्वा बाहरी रूप से विकसित होते हैं और ऑप्टिकल रूप से पारदर्शी होते हैं । प्रारंभिक जीवन के चरणों में मछली में माइक्रोप्लास्टिक के जैव संचय को फ्लोरोसेंटली लेबल वाले माइक्रोमोतियों के साथ आसानी से मूल्यांकन किया जाता है।
Abstract
पर्यावरण प्रदूषक के एक नए प्रकार के रूप में, जलीय पर्यावरण में माइक्रोप्लास्टिक व्यापक रूप से पाया गया है और जलीय जीवों के लिए एक उच्च खतरा बन गया है । माइक्रोप्लास्टिक का बायोएकमुलेशन उनके जहरीले प्रभावों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है; हालांकि, एक कण के रूप में, उनके बायोएक्सुलेशन कई अन्य प्रदूषकों से अलग हैं। यहां वर्णित फ्लोरोसेंट माइक्रोप्लास्टिक का उपयोग करके जेब्राफिश भ्रूण या लार्वा में माइक्रोप्लास्टिक के संचय और वितरण को नेत्रहीन रूप से निर्धारित करने के लिए एक व्यवहार्य तरीका है। भ्रूण 120 घंटे के लिए 500 एनएम के व्यास के साथ फ्लोरोसेंट माइक्रोप्लास्टिक के विभिन्न सांद्रता (0.1, 1, और 10 मिलीग्राम/एल) के संपर्क में हैं। यह परिणामों में दिखाया गया है कि माइक्रोप्लास्टिक जेब्राफिश भ्रूण/लार्वा में एकाग्रता पर निर्भर तरीके से बायोएकुमेट कर सकते हैं । हैचिंग से पहले, भ्रूण के चारों ओर मजबूत फ्लोरेसेंस पाया जाता है; जबकि जेब्राफिश लार्वा में, जर्दी थैली, पेरिकार्डियम और गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट माइक्रोप्लास्टिक की मुख्य संचित साइटें हैं। परिणाम प्रारंभिक जीवन चरणों में जेब्राफिश में माइक्रोप्लास्टिक के तेज और आंतरिककरण को प्रदर्शित करते हैं, जो जलीय जंतुओं पर माइक्रोप्लास्टिक के प्रभाव को बेहतर तरह समझने के लिए आधार प्रदान करेगा ।
Introduction
1 9 00 के दशक में पहली बार संश्लेषित होने के बाद, प्लास्टिक का व्यापक रूप से विभिन्न क्षेत्रों में उपयोग किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप वैश्विक उत्पादन 1 का तेजी से विकासहोताहै। 2018 में, दुनिया भर में लगभग 360 मिलियन टन प्लास्टिक का उत्पादन किया गयाथा 2। प्राकृतिक वातावरण में प्लास्टिक रासायनिक, भौतिक या जैविक प्रक्रियाओं के कारण ठीक कणों को नीचा होगा3। आम तौर पर, आकार में 5 मिमी < 5 मिमी के महीन प्लास्टिक कणों को माइक्रोप्लास्टिक 4 के रूप में परिभाषित कियाजाताहै। माइक्रोप्लास्टिक भी विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए इंजीनियर हैं, जैसे कॉस्मेटिक उत्पादों से माइक्रोमोतियों5। लगभग स्थायी संदूषकों के रूप में, पर्यावरण में माइक्रोप्लास्टिक जमा होते हैं, और वैज्ञानिकों, नीति निर्माताओं और जनता1,6से बढ़ते ध्यान को आकर्षित किया है। पिछले अध्ययनों में यह प्रलेखित किया गया था कि माइक्रोप्लास्टिक मछली में प्रतिकूल प्रभाव पैदा कर सकता है, जैसे गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल क्षति7,न्यूरोटॉक्सीसिटी8,एंडोक्राइन व्यवधान9,ऑक्सीडेटिव तनाव10 और डीएनए क्षति11। हालांकि, माइक्रोप्लास्टिक की विषाक्तता अब तक पूरी तरह से उजागर नहीं हुई है12,13.
ज़ेब्राफ़िश भ्रूण छोटे आकार, बाहरी निषेचन, ऑप्टिकल पारदर्शिता और बड़े चंगुल सहित बहुत सारे प्रयोगात्मक लाभ प्रदान करते हैं, और प्रारंभिक जीवन चरणों में मछली पर प्रदूषकों के प्रभावों का अध्ययन करने वाले वीवो में एक आदर्श मॉडल जीव के रूप में माना जाता है। इसके अलावा, जैविक प्रतिक्रियाओं के मूल्यांकन के लिए केवल सीमित मात्रा में परीक्षण पदार्थों की आवश्यकता होती है। यहां, जेब्राफिश भ्रूण 5 दिनों के लिए माइक्रोप्लास्टिक (0.1, 1, 10 मिलीग्राम/एल) की विभिन्न सांद्रता के संपर्क में हैं, और जेब्राफिश भ्रूण/लार्वा में माइक्रोप्लास्टिक के बायोएकुमेशन और वितरण का मूल्यांकन किया जाता है। यह परिणाम मछली के लिए माइक्रोप्लास्टिक की विषाक्तता के बारे में हमारी समझ को आगे बढ़ाएगा, और यहां वर्णित विधि को जेब्राफिश के प्रारंभिक जीवन चरणों में अन्य प्रकार की फ्लोरोसेंट सामग्रियों के संचय और वितरण को निर्धारित करने के लिए संभावित रूप से सामान्यीकृत किया जा सकता है।
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Protocol
वयस्क जेब्राफिश की उत्पत्ति चाइना जेब्राफिश रिसोर्स सेंटर (वुहान, चीन) से हुई है। यह प्रयोग राष्ट्रीय गाइड "पशु कल्याण की नैतिक समीक्षा के लिए प्रयोगशाला पशु दिशानिर्देश (GB/T35892-2018) के अनुपालन में आयोजित किए गए थे ।
1. भ्रूण संग्रह
- 14:10 घंटे प्रकाश के फोटोसीरियोड पर लगातार तापमान (28 ± 0.5 डिग्री सेल्सियस) पर चारकोल-फ़िल्टर किए गए नल जल प्रणाली (पीएच 7.0 ± 0.2) के साथ 20 एल ग्लास टैंकों में मछली बनाए रखें।
- आर्टेमिया नॉपलीके साथ रोजाना दो बार मछली खिलाएं । यह सिफारिश की जाती है कि भोजन अधिकतम 3% मछली का वजन प्रति दिन दिया जाता है और हर बार14मिनट के भीतर खाया जाना चाहिए।
- प्रजनन से पहले रात को दो महिलाओं के लिए एक पुरुष के अनुपात में स्पॉनिंग टैंक में अच्छी तरह से विकसित वयस्क जेब्राफिश (3-4 सेमी की शरीर की लंबाई के साथ) स्थानांतरित करें।
नोट: अगले सुबह, मछली प्रकाश चक्र की शुरुआत के बाद अंडे शुरू करते हैं । - एक पाश्चर पिपेट का उपयोग करके अंडे लीजिए। कई बार 10% हैंक के समाधान के साथ कुल्ला, और फिर एक माइक्रोस्कोप का उपयोग कर निषेचन के लिए जांच करें। निषेचित अंडे लगभग 2 घंटे के बाद निषेचन (एचपीएफ) के बाद दरार अवधि से गुजरते हैं और स्पष्ट रूप से15की पहचान की जा सकती है।
- 28 डिग्री सेल्सियस पर कीटाणुशोधन के लिए 1% मेथिलीन नीले रंग के साथ 10% हैंक के समाधान के 200 मिलीएल युक्त 500 मिलील बीकर में उर्वरित भ्रूण को इनक्यूबेट करें। 1 भ्रूण/2 एमएल समाधान की लोडिंग दर से अधिक न करें।
नोट: 10% हैंक का समाधान 137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 0.25 mM Na2HPO4,0.44 m M KH2PO4,1.3 m M CaCl2,1.0 m MMg MGSO4 और 4.2 m M NaHCO3.
2. माइक्रोप्लास्टिक निलंबन की तैयारी
- 10 मिनट के लिए 500 एनएम (उत्तेजन/उत्सर्जन: 460/500 एनएम) के नाममात्र व्यास के साथ हरे फ्लोरोसेंटी लेबल पॉलीस्टीरिन मोतियों (10 मिलीग्राम/एमएल) के स्टॉक समाधान को सोनिकेट करें।
- वांछित एक्सपोजर समाधान (0.1, 1, और 10 मिलीग्राम/एल) का उत्पादन करने के लिए 10% हैंक के समाधान के साथ स्टॉक समाधान को पतला करें।
- एक्सपोजर से पहले हमेशा माइक्रोप्लास्टिक के एक्सपोजर सॉल्यूशंस तैयार करें।
नोट: माइक्रोप्लास्टिक के जहरीले प्रभावों का आकलन करते समय सावधानी बरती जानी चाहिए, क्योंकि वाणिज्यिक कण योगों में सोडियम एजाइड जैसे परिरक्षकों की उपस्थिति विभिन्न जीवों के लिए विषाक्त हो सकती है 16। इसलिए, विषाक्तता प्रयोग करने से पहले इन एडिटिव्स को हटा दिया जाना चाहिए या नियंत्रण में हिसाब देना चाहिए।
3. माइक्रोप्लास्टिक एक्सपोजर
- बेतरतीब ढंग से 6 नए निषेचित भ्रूण (4 एचपीएफ) का चयन करें, और फिर विभिन्न सांद्रता के साथ माइक्रोप्लास्टिक समाधान के 5 एमएल युक्त 6-अच्छी तरह से प्लेट के प्रत्येक कुएं में स्थानांतरित करें। 10% हैंक के समाधान वाले नियंत्रण समूहों को शामिल करें।
- प्रत्येक उपचार के लिए ट्रिपलीकेट कुओं (कुल 18 भ्रूण के साथ) का उपयोग करें।
- एक ही प्रकाश के तहत भ्रूण को इनक्यूबेट करें: वयस्कों के रूप में अंधेरे चक्र और तापमान (1.2 देखें) और हर 12 घंटे का निरीक्षण करें। मृत को तुरंत हटा दें।
- माइक्रोप्लास्टिक समाधान 90% हर 24 घंटे नवीनीकृत करें। एक्सपोजर अवधि के दौरान, मछली को नहीं खिलाया जाता है।
नोट: आम तौर पर, भ्रूण की हैचिंग 48 एचपीएफ से शुरू होती है और लगभग 72 एचपीएफ पर पूरी होती है।
4. माइक्रोप्लास्टिक वितरण का आकलन
- 24, 48, 72, 96, और 120 घंटे के बाद निषेचन, बेतरतीब ढंग से भ्रूण का चयन/
- लार्वा को पेट्री डिश में स्थानांतरित करें और संज्ञाहरण के लिए 0.016% ट्राइकेन का पर्दाफाश करें।
- ट्राइकेन का स्टॉक समाधान तैयार करें: 4 मिलीग्राम ट्राइकेन पाउडर डबल डिस्टिल्ड पानी के 100 एमएल में भंग हो जाता है, और पीएच को ट्राइज़-एचसीएल (पीएच 9.0) के साथ 7.0 तक समायोजित करता है। स्टॉक समाधान को फ्रीजर में स्टोर करें।
- कामकाजी समाधान तैयार करें। वांछित एकाग्रता के लिए शेयर समाधान को पतला करें (0.016%) कमरे के तापमान 14 पर10%हैंक समाधान के साथ .
- भ्रूण/लार्वा की व्यवस्था करें और अवलोकन के लिए तैयार करें।
- इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप और इमेज के साथ मछली का निरीक्षण करें।
- इमेजजे के साथ मछली में फ्लोरेसेंस तीव्रता की मात्रा निर्धारित करें।
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Representative Results
फ्लोरोसेंट माइक्रोप्लास्टिक का वितरण और संचय चित्र 1 और तालिका 1में दिखाया गया है। अनएक्सपोज्ड समूह (नियंत्रण) में कोई दृश्यमान फ्लोरेसेंस नहीं देखा जाता है। हालांकि, माइक्रोप्लास्टिक (24 एचपीएफ) की विभिन्न सांद्रता के संपर्क में आने के बाद फ्लोरेसेंस का संचय कोरियोन के आसपास पाया जाता है। लार्वा में ग्रीन फ्लोरेसेंस का भी पता लगाया जाता है, और फ्लोरेसेंस का स्तर एकाग्रता और समय पर निर्भर तरीके से बढ़ता दिखाई देता है। जर्दी थैली, पेरिकार्डियम, और गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल ट्रैक्ट माइक्रोप्लास्टिक(चित्रा 2)की मुख्य संचित साइटें हैं।
चित्रा 1:जेब्राफिश (40× के भ्रूण/लार्वा में फ्लोरोसेंट पॉलीस्टीरिन माइक्रोप्लास्टिक का वितरण। मछली नियंत्रण समूह से नमूना हैं, या ०.१, 1 और 10 मिलीग्राम/एल स्केल बार १०० माइक्रोनम पर ५००-एनएम माइक्रोप्लास्टिक के संपर्क में समूहों कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्र 2:जेब्राफिश लार्वा (40×) में माइक्रोप्लास्टिक संचय की साइटें। इस लार्वा का नमूना 120 घंटे के लिए 10 मिलीग्राम/एल पर 500-एनएम माइक्रोप्लास्टिक के संपर्क में आने वाले समूह से लिया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
| एकाग्रता | भ्रूण | डिंभक | ||||
| (मिलीग्राम/एल) | 24 एचपीएफ | 48 एचपीएफ ए | 48 एचपीएफ बी | 72 एचपीएफ | 96 एचपीएफ | 120 एचपीएफ |
| सतंत। | 1.2±0.1 | 2.6±0.3 | 2.2 | 3.0±0.2 | 2.6±0.7 | 3.3±0.3 |
| 1 | 1.2±0.2 | 5.0±0.1 | 5.3 | 7.5±0.5 | 8.7±0.5 | 10.0±1.9 |
| 0.1 | 7.0±0.9 | 26.1±2.9 | 8.9 | 18.4±0.7 | 16.3±2.8 | 25.7±2.7 |
| 10 | 9.1±1.1 | 82.3±5.3 | 30.4 | 32.7±3.2 | 41.6±0.4 | 44.1±0.9 |
| क:केवल दो भ्रूण का मूल्यांकन किया गया; ख:केवल एक लार्वा का आकलन किया गया था। | ||||||
तालिका 1: फ्लोरोसेंट माइक्रोप्लास्टिक (एन = 3) के संपर्क में आने के बाद जेब्राफिश में फ्लोरेसेंस स्तर का परिवर्तन। फ्लोरोसेंट माइक्रोप्लास्टिक के अवशोषण पर कोरियन के प्रभाव के कारण, डेटा को दो भागों में विभाजित किया जाता है, जो भ्रूण (हैचिंग से पहले) और लार्वा (हैचिंग के बाद) होता है।
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Discussion
यूरोपीय संघ के निर्देश 2010/63/ईयू जैसे वैज्ञानिक प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले जानवरों की सुरक्षा पर दिशानिर्देश के अनुसार, पशु नैतिकता की अनुमति एक प्रयोग के लिए अनिवार्य नहीं है, जब तक कि स्वतंत्र भोजन (5 दिन बाद निषेचन)17में सक्षम होने का चरण नहीं है । हालांकि, जेब्राफिश के उपयोग को अनुकूलित करने के लिए सर्वोत्तम कल्याणकारी अभ्यास महत्वपूर्ण है, और उदाहरण के लिए, संज्ञाहरण और इच्छामृत्यु के मानवीय तरीके चिंता का विषय होना चाहिए । एथिल 3-अमीनोबेन्जोएट मीथेनसल्फेट (एमएस-222, या ट्राइकेन), सबसे प्रयोगशालाओं में नियमित रूप से उपयोग किए जाने वाले एजेंट, संज्ञाहरण और इच्छामृत्यु के लिए यहां कार्यरत हैं।
माइक्रोस्कोप के तहत अवलोकन से पहले, भ्रूण और लार्वा को धोया जाना चाहिए क्योंकि बाहरी सतह पर माइक्रोप्लास्टिक एसकॉर्डेड परिणामों में हस्तक्षेप कर सकते हैं। इसके अलावा, भ्रूण/लार्वा में ऑटोफ्लोरेसेंस, विशेष रूप से जर्दी थैली के आसपास, जो कभी-कभार सूचित किया गया है, समस्याग्रस्त हो सकता है । कई बायोमैक्रोमोलेक्यूलिस की उपस्थिति, जैसे फ्लेविन्स, निकोटिनामाइड-एडेनाइन डाइन्यूक्लियोटाइड (एनएडी), सुगंधित अमीनो एसिड, लिपोफुस्सिन, उन्नत ग्लाइसेशन एंड उत्पाद और कोलाज, उचित तरंगदैर्ध्य पर उत्साहित होने पर प्रकाश उत्सर्जित करेंगे।
यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि, कण प्रदूषक के रूप में, माइक्रोप्लास्टिक के आकार को जैव उपलब्धता के निर्धारक कारकों में से एक माना जाता है, और विषाक्तता18। यहां उपयोग किए जाने वाले माइक्रोप्लास्टिक का नाममात्र व्यास 500 एनएम है, जो भ्रूण कोरियोन के पोर आकार (300 एनएम से 1 माइक्रोन की सीमा के भीतर)19से तुलनात्मक है। इसलिए, इन माइक्रोप्लास्टिक को आसानी से जेब्राफिश कोरियोन से गुजरने की उम्मीद नहीं है। लगातार, हैचिंग(चित्रा 1)से पहले भ्रूण में थोड़ा फ्लोरेसेंस दिखाई देता है। चूंकि कोरियोन बड़े आकार वाले कणों के खिलाफ एक प्रभावी बाधा के रूप में कार्य करेगा, इसलिए एक्सपोजर से पहले डिकेरेशन प्रक्रिया की आवश्यकता हो सकती है। Chorion आसानी से संदंश का उपयोग कर हटाया जा सकता है, लेकिन pronase के साथ एंजाइमेटिक dechorionation पसंद किया जाता है जब भ्रूण थोक में संभाला जाता है । हालांकि, हालांकि dechorionation जैव उपलब्धता में वृद्धि होगी और पदार्थों की विषाक्तता के लिए उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग की सुविधा, कोरियोन बरकरार के साथ भ्रूण अधिक प्रदूषकों की पारिस्थितिकी का आकलन करने की सिफारिश की है जब "असली" दुनिया में जोखिम की स्थिति पर विचार ।
हालांकि काफी प्रयास मछली पर माइक्रोप्लास्टिक के प्रतिकूल प्रभावों की जांच करने के लिए समर्पित किया गया है, जैव संचय सहित वर्तमान ज्ञान, सीमित या यहां तक कि परस्पर विरोधी रहते हैं । इन-अध्ययन विसंगतियों को मुख्य रूप से आकार, घनत्व और सतह विशेषताओं (उदाहरण के लिए, सतह प्रभारी) सहित कणों के गुणों के मतभेदों के लिए जिम्मेदार ठहराया जाता है। समाधान में माइक्रोप्लास्टिक का व्यवहार जैव उपलब्धता के लिए भी महत्वपूर्ण है। माइक्रोप्लास्टिक की भौतिक रसायन विशेषताओं को एक्सपोजर अवधि में ट्रैक किया जाना चाहिए, और एकत्रीकरण घटना जो हो सकती है उसे दर्ज किया जाना चाहिए। वास्तव में, उन एक्सपोजर के लिए जिन्हें माइक्रोप्लास्टिक को विस्तारित अवधि के लिए निलंबित करने की आवश्यकता होती है, एक चुंबकीय बार के साथ सोनीशन या सरगर्मी की सिफारिश की जाती है।
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Disclosures
लेखक कोई प्रतिस्पर्धा या वित्तीय हितों की घोषणा करता है ।
Acknowledgments
इस काम को नेशनल नेचुरल साइंस फाउंडेशन ऑफ चाइना (21777145, 22076170) और यूनिवर्सिटी (IRT_17R97) में चांगजियांग स्कॉलर्स एंड इनोवेटिव रिसर्च टीम के लिए प्रोग्राम द्वारा वित्त पोषित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent microscope | Nikon, Japan | Eclipse Ti-S | |
| Green fluorescently labeled polystyrene beads | Phosphorex, USA | 2103A | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich, USA | A5040 |
References
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