Summary
Os embriões/larvas de zebrafish desenvolvem-se externamente e são opticamente transparentes. A bioacúscula de microplásticos em peixes em estágios iniciais da vida é prontamente avaliada com microesferas fluorescentes rotuladas.
Abstract
Como um novo tipo de poluente ambiental, o microplástico tem sido amplamente encontrado no ambiente aquático e representa uma alta ameaça aos organismos aquáticos. A bioacúsculação de microplásticos desempenha um papel fundamental em seus efeitos tóxicos; no entanto, como uma particulada, suas bioacúsculas são diferentes de muitos outros poluentes. Descrito aqui é um método viável para determinar visualmente o acúmulo e distribuição de microplásticos em embriões de zebrafish ou larvas usando microplásticos fluorescentes. Os embriões são expostos a diferentes concentrações (0,1, 1 e 10 mg/L) de microplásticos fluorescentes com diâmetro de 500 nm para 120 h. É mostrado nos resultados que os microplásticos podem bioacúsolar em embriões/larvas de zebrafish de forma dependente da concentração. Antes de eclodir, a fluorescência forte é encontrada ao redor do acorde embrionário; enquanto em larvas de zebrafish, o saco de gema, pericárdio e trato gastrointestinal são os principais locais acumulados de microplásticos. Os resultados demonstram a absorção e internalização de microplásticos em zebrafish em estágios iniciais da vida, o que fornecerá base para uma melhor compreensão do impacto dos microplásticos nos animais aquáticos.
Introduction
Desde a primeira sintetização na década de 1900, os plásticos são amplamente utilizados em diversos campos, resultando em rápido crescimento da produção global1. Em 2018, aproximadamente 360 milhões de toneladas de plásticos foram produzidas em todo o mundo2. Os plásticos no ambiente natural se degradarão a partículas finas devido aos processos químicos, físicos ou biológicos3. Geralmente, partículas plásticas finas <5 mm de tamanho são definidas como microplásticos4. Os microplásticos também são projetados para aplicações específicas, como microesferas de produtos cosméticos5. Como contaminantes quase permanentes, os microplásticos são acumulados no meio ambiente, e têm atraído cada vez mais atenção de cientistas, formuladores de políticas e público1,6. Estudos anteriores documentaram que microplásticos podem causar efeitos adversos em peixes, como danos gastrointestinais7,neurotoxicidade8,interrupção endócrina9,estresse oxidativo10 e dano de DNA11. No entanto, a toxicidade dos microplásticos não foi totalmente revelada até agora12,13.
Os embriões de zebrafish oferecem uma série de vantagens experimentais, incluindo pequeno tamanho, fertilização externa, transparência óptica e grandes embreagens, e é considerado como um organismo modelo ideal para in vivo estudar os efeitos de poluentes em peixes em estágios iniciais da vida. Além disso, apenas quantidades limitadas de substâncias de teste são necessárias para a avaliação de respostas biológicas. Aqui, os embriões de zebrafish são expostos a diferentes concentrações de microplásticos (0,1, 1, 10 mg/L) durante 5 dias, e a bioacúscula e distribuição de microplásticos em embriões/larvas de zebrafish são avaliadas. Este resultado avançará nossa compreensão sobre a toxicidade dos microplásticos aos peixes, e o método descrito aqui pode potencialmente ser generalizado para determinar o acúmulo e distribuição de outros tipos de materiais fluorescentes nos estágios iniciais da vida dos zebrafish.
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Protocol
Os zebrafish adultos são originários do Centro de Recursos de Zebrafish da China (Wuhan, China). Os experimentos foram realizados em conformidade com o guia nacional "Guia Animal Laboratorial para Revisão Ética do Bem-Estar Animal (GB/T35892-2018).
1. Coleção de embriões
- Mantenha os peixes em tanques de vidro de 20 L com sistema de água da torneira filtrado por carvão (pH 7.0 ± 0,2) a uma temperatura constante (28 ± 0,5 °C) em um fotoperperióduodo de 14:10 h de luz: escuro.
- Alimente os peixes duas vezes por dia com Artemia nauplii. Recomenda-se que o alimento seja dado no máximo 3% de peso de peixe por dia e deve ser comido dentro de 5 min cadavez 14.
- Transfira zebrafish adulto bem desenvolvido (com comprimento corporal de 3-4 cm) para o tanque de desova em uma proporção de um macho para duas fêmeas na noite anterior à reprodução.
NOTA: Na manhã seguinte, os peixes começam a desovar após o início do ciclo de luz. - Colete ovos usando uma pipeta Pasteur. Enxágüe com 10% da solução de Hank várias vezes, e depois verifique se há fertilização usando um microscópio. Os óvulos fertilizados passam pelo período de decote após aproximadamente 2h de fertilização pós-fertilização (hpf) e podem ser claramente identificados15.
- Incubar os embriões fertilizados em um béquer de 500 mL contendo 200 mL de solução de 10% hank com 1% de azul metileno para desinfecção a 28 °C. Não exceda uma taxa de carregamento de 1 solução embrionária/2 mL.
NOTA: 10% A solução da Hank é composta por 137 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,25 mM Na2HPO4, 0,44 mM KH2PO4, 1,3 mM CaCl2, 1,0 mM MgSO4 e 4,2 mM NaHCO3.
2. Preparação de suspensões microplásticas
- Sonicate a solução de estoque de contas de poliestireno rotulados fluorescente verde (10 mg/mL) com diâmetro nominal de 500 nm (excitação/emissão: 460/500 nm) por 10 minutos.
- Diluir a solução de estoque com 10% da solução da Hank para produzir as soluções de exposição desejadas (0,1, 1 e 10 mg/L).
- Prepare sempre as soluções de exposição de microplásticos antes da exposição.
NOTA: Deve-se ter cuidado ao avaliar os efeitos tóxicos dos microplásticos, pois a presença de conservantes, como o azida de sódio, nas formulações de partículas comerciais, pode ser tóxica para diferentes organismos 16. Portanto, esses aditivos devem ser removidos ou contabilizados nos controles antes de realizar o experimento de toxicidade.
3. Exposição microplástica
- Selecione aleatoriamente 6 embriões recém-fertilizados (4 hpf), e depois transfira para cada poço de placa de 6 poços contendo 5 mL de soluções microplásticas com diferentes concentrações. Inclua os grupos de controle contendo 10% da solução de Hank.
- Use poços triplicados (com um total de 18 embriões) para cada tratamento.
- Incubar os embriões sob a mesma luz: ciclo escuro e temperatura que os adultos (ver 1,2) e observar a cada 12 horas. Remova os mortos imediatamente.
- Renovar as soluções microplásticas 90% a cada 24 h. Durante o período de exposição, os peixes não são alimentados.
NOTA: Geralmente, a eclosão do embrião começa em 48 cvf e é completa em cerca de 72 cvf.
4. Avaliação da distribuição microplástica
- Aos 24, 48, 72, 96 e 120 h pós fertilização, selecione aleatoriamente os embriões/larvas (um de cada uma das três réplicas) e enxágue com 10% da solução de Hank.
- Transfira as larvas para uma placa de Petri e exponha a 0,016% de tricaine para anestesia.
- Prepare a solução de estoque de tricaine: 4 mg de pó de tricaine é dissolvido em 100 mL de água dupla destilada, e ajuste o pH para 7.0 com Tris-HCl (pH 9.0). Guarde a solução de estoque no congelador.
- Prepare a solução de trabalho. Diluir a solução de estoque para a concentração desejada (0,016%) com solução de 10% Hank à temperatura ambiente14.
- Organize os embriões/larvas e prepare-se para observação.
- Observe o peixe com um microscópio de fluorescência e imagem com software de imagem.
- Quantifique a intensidade da fluorescência em peixes com ImageJ.
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Representative Results
A distribuição e o acúmulo de microplásticos fluorescentes são mostrados na Figura 1 e Tabela 1. Nenhuma fluorescência visível é observada no grupo não exposto (controle). No entanto, um acúmulo de fluorescência é encontrado em torno do chorão após exposição a diferentes concentrações de microplásticos (24 hpf). A fluorescência verde também é detectada em larvas, e os níveis de fluorescência parecem aumentar de forma dependente da concentração e do tempo. O saco de gema, o pericárdio e o trato gastrointestinal são os principais locais acumulados de microplásticos(Figura 2).
Figura 1: Distribuição de microplásticos de poliestireno fluorescente em embriões/larvas de zebrafish (40×). Os peixes são amostrados do grupo controle, ou os grupos expostos a microplásticos de 500 nm a 0,1, 1 e 10 mg/L. Barra de escala 100 μm Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Os locais de acúmulo de microplásticos em larvas de zebrafish (40×). Esta larva é amostrada do grupo exposto a microplásticos de 500 nm a 10 mg/L durante 120 horas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| concentração | embrião | larva | ||||
| (mg/L) | 24 cvf | 48 cvf a | 48 cvf b | 72 cvf | 96 cvf | 120 cvf |
| Cont. | 1.2±0.1 | 2.6±0.3 | 2.2 | 3.0±0.2 | 2.6±0.7 | 3.3±0.3 |
| 1 | 1.2±0.2 | 5.0±0.1 | 5.3 | 7.5±0.5 | 8.7±0.5 | 10.0±1.9 |
| 0.1 | 7.0±0.9 | 26.1±2.9 | 8.9 | 18.4±0.7 | 16.3±2.8 | 25,7±2,7 |
| 10 | 9.1±1.1 | 82.3±5.3 | 30.4 | 32,7±3.2 | 41,6±0.4 | 44.1±0.9 |
| a: apenas dois embriões foram avaliados; b: apenas uma larva foi avaliada. | ||||||
Tabela 1: A mudança do nível de fluorescência em zebrafish após a exposição a microplásticos fluorescentes (n=3). Devido à influência da corão na absorção de microplásticos fluorescentes, os dados são divididos em duas partes, a dos embriões (antes da eclosão) e larvas (após a eclosão).
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Discussion
De acordo com a diretriz sobre a proteção de animais utilizados para fins científicos, como a Diretiva da UE 2010/63/UE, a permissão de ética animal não é obrigatória para um experimento com estágios iniciais de zebrafish até o estágio de ser capaz de alimentação independente (5 dias após a fertilização)17. No entanto, a melhor prática de bem-estar é importante para otimizar o uso de zebrafish, e, por exemplo, os métodos humanos de anestesia e eutanásia devem ser preocupantes. O metanossefinato etílico de etila 3-aminobenzoato (MS-222, ou tricaine), o agente usado rotineiramente na maioria dos laboratórios, é empregado aqui para anestesia e eutanásia.
Antes da observação sob o microscópio, os embriões e larvas devem ser enxaguados, uma vez que os microplásticos adsorvidas na superfície externa podem interferir nos resultados. Além disso, a autofluorescência nos embriões/larvas, especialmente ao redor do saco de gema, que tem sido relatado ocasionalmente, pode ser problemática. A presença de muitas biomacromléculas, como flavinas, dinucleotídeos de nicotinamida-adenina (NAD), aminoácidos aromáticos, lipofuscinas, produtos finais de glicação avançada e colagem, emitirá luz quando excitada no comprimento de onda apropriado.
É importante notar que, como o poluente particulado, o tamanho do microplástico é considerado como um dos fatores determinantes da biodisponibilidade, e toxicidade18. O diâmetro nominal do microplástico utilizado aqui é de 500 nm, o que é comparativo ao tamanho dos poros do acorde de embrião (dentro da faixa de 300 nm a 1 μm)19. Portanto, esses microplásticos não devem passar facilmente pelo coro de zebrafish. Consistentemente, há pouca fluorescência visível nos embriões antes da eclosão(Figura 1). Uma vez que o acorde agirá como uma barreira eficaz contra as partículas de grande porte, o processo de descorção antes da exposição pode ser necessário. O chorão pode ser removido facilmente usando as fórceps, mas a descorção enzimática com pronase é preferida quando os embriões são manuseados a granel. No entanto, embora a descorionação aumente a biodisponibilidade e facilite a triagem de alto rendimento para a toxicidade das substâncias, o embrião com cori intacta é mais recomendado para avaliar a ecotoxicidade dos poluentes quando se considera a condição de exposição no mundo "real".
Embora esforços consideráveis tenham sido dedicados a investigar os efeitos adversos dos microplásticos sobre os peixes, o conhecimento atual, incluindo o da bioacumulação, permanece limitado ou mesmo conflitante. Essas inconsistências de todo o estudo são atribuídas principalmente às diferenças de propriedades das partículas, incluindo tamanho, densidade e características da superfície (por exemplo, carga superficial). O comportamento dos microplásticos na solução também é fundamental para a biodisponibilidade. As características físico-químicas dos microplásticos devem ser rastreadas ao longo da duração da exposição, e o fenômeno de agregação que pode ocorrer deve ser registrado. De fato, para as exposições que requerem que os microplásticos sejam suspensos por um longo período, recomenda-se a sonicação ou agitação com uma barra magnética.
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Disclosures
O autor declara não haver interesses concorrentes ou financeiros.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (21777145, 22076170), e pelo Programa de Estudiosos de Changjiang e Equipe de Pesquisa Inovadora na Universidade (IRT_17R97).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent microscope | Nikon, Japan | Eclipse Ti-S | |
| Green fluorescently labeled polystyrene beads | Phosphorex, USA | 2103A | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich, USA | A5040 |
References
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