Summary
Zebra balığı embriyoları/larvaları dışarıdan gelişir ve optik olarak şeffaftır. Erken yaşam aşamalarında balıklarda mikroplastiklerin biyoakümülasyonu floresan etiketli mikrobeadlarla kolayca değerlendirilir.
Abstract
Yeni bir çevresel kirletici türü olarak, mikroplastik su ortamında yaygın olarak bulunmuştur ve sucul organizmalar için yüksek bir tehdit oluşturmaktadır. Mikroplastiklerin biyoakümülasyonu toksik etkilerinde önemli bir rol oynar; bununla birlikte, bir partikül olarak, biyoakümülasyonları diğer birçok kirleticiden farklıdır. Burada açıklanan, floresan mikroplastikler kullanarak zebra balığı embriyolarında veya larvalarında mikroplastiklerin birikmesini ve dağılımını görsel olarak belirlemek için uygulanabilir bir yöntemdir. Embriyolar, 120 saat boyunca 500 nm çapında floresan mikroplastiklerin farklı konsantrasyonlarına (0.1, 1 ve 10 mg/L) maruz kalır. Sonuçlarda mikroplastiklerin zebra balığı embriyolarında/larvalarında konsantrasyona bağlı bir şekilde biyoakümülate haline gelebilir. Kuluçkadan önce, embriyonik koronun etrafında güçlü floresan bulunur; zebra balığı larvalarında, yumurta sarısı kesesi, perikard ve gastrointestinal sistem mikroplastiklerin ana birikmiş bölgeleridir. Sonuçlar, zebra balıklarındaki mikroplastiklerin erken yaşam aşamalarında alınmasını ve içselleştirilmesini göstermektedir, bu da mikroplastiklerin su hayvanları üzerindeki etkisini daha iyi anlamak için temel sağlayacaktır.
Introduction
İlk kez 1900'lerde sentezlenen plastikler, çeşitli alanlarda yaygın olarak kullanılmaktadır ve bu da küresel üretimin hızlı büyümesine neden1. 2018 yılında dünya çapında yaklaşık 360 milyon ton plastik üretildi2. Doğal ortamdaki plastikler kimyasal, fiziksel veya biyolojik işlemler nedeniyle ince parçacıklara kadar bozulur3. Genellikle, boyutu 5 mm < ince plastik parçacıklar mikroplastikler olarak tanımlanır4. Mikroplastikler ayrıca kozmetik ürünlerden mikrobeadlar gibi belirli uygulamalar için tasarlanmıştır5. Neredeyse kalıcı kirleticiler olarak, mikroplastikler çevrede birikir ve bilim adamları, politika yapıcılar ve halktan giderek daha fazla ilgi çekmiştir1,6. Önceki çalışmalar, mikroplastiklerin balıklarda gastrointestinal hasar7, nörotoksikite 8 , endokrin bozulma9, oksidatif stres10ve DNA hasarı11 gibi olumsuz etkilere neden olabileceğini belgeledi. Bununla birlikte, mikroplastiklerin toksisitesi şimdiye kadar tam olarak ortaya çıkarılmamıştır12,13.
Zebra balığı embriyoları, küçük boyut, dış gübreleme, optik şeffaflık ve büyük kavramalar dahil olmak üzere birçok deneysel avantaj sunar ve erken yaşam aşamalarında kirleticilerin balıklar üzerindeki etkilerini incelemek için in vivo için ideal bir model organizma olarak kabul edilir. Ek olarak, biyolojik yanıtların değerlendirilmesi için sadece sınırlı miktarda test maddesine ihtiyaç vardır. Burada zebra balığı embriyoları 5 gün boyunca farklı mikroplastik konsantrasyonlarına (0.1, 1, 10 mg/L) maruz kalmakta ve zebra balığı embriyolarında/larvalarında mikroplastiklerin biyoakümülasyonu ve dağılımı değerlendirilmektedir. Bu sonuç, mikroplastiklerin balıklara toksisitesi hakkındaki anlayışımızı ilerletecektir ve burada açıklanan yöntem, zebra balıklarının erken yaşam aşamalarında diğer floresan madde türlerinin birikmesini ve dağılımını belirlemek için potansiyel olarak genellenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Yetişkin zebra balıkları Çin Zebra Balığı Kaynak Merkezi'nden (Wuhan, Çin) kaynaklanmaktadır. Deneyler, "Hayvan Refahının Etik İncelemesi için Laboratuvar Hayvan Kılavuzu (GB/T35892-2018) ulusal kılavuzuna uygun olarak gerçekleştirildi.
1. Embriyo koleksiyonu
- Balıkları, 14:10 saat açık bir fotoperiyod üzerinde sabit bir sıcaklıkta (28 ± 0,5 °C) devridaim kömür filtreli musluk suyu sistemine (pH 7,0 ± 0,2) sahip 20 L cam tanklarda saklayın: karanlık.
- Artemia naupliiile günde iki kez balık besleyin. Yiyeceklerin günde en fazla% 3 balık ağırlığında verilmesi ve her seferinde 5 dakika içinde yenmesi önerilir14.
- İyi gelişmiş yetişkin zebra balıklarını (vücut uzunluğu 3-4 cm olan) üremeden bir gece önce bir erkek ila iki dişi oranında yumurtlama tankına aktarın.
NOT: Ertesi sabah, balık ışık döngüsünün başlangıcından sonra yumurtlamaya başlar. - Pasteur pipet kullanarak yumurta toplayın. Birkaç kez% 10 Hank çözeltisi ile durulayın ve ardından mikroskop kullanarak döllenme olup olmadığını kontrol edin. Döllenmiş yumurtalar yaklaşık 2 saat sonra bölünme süresi geçirir döllenme (hpf) ve açıkça tanımlanabilir15.
- Döllenmiş embriyoları% 10 Hank çözeltisinin 200 mL'sini içeren 500 mL'lik bir beherde, 28 ° C'de dezenfeksiyon için% 1 metilen mavisi ile kuluçkaya yatırın. 1 embriyo/2 mL çözelti yükleme oranını aşmayın.
NOT: %10 Hank'in çözümü 137 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 0,25 mM Na2HPO4,0,44 mM KH2PO4, 1,3 mM CaCl2, 1,0 mM MgSO4 ve 4,2 mM NaHCO3'denoluşur.
2. Mikroplastik süspansiyonların hazırlanması
- 10 dakika boyunca 500 nm nominal çapa (eksitasyon / emisyon: 460/500 nm) sahip yeşil floresan etiketli polistiren boncukların (10 mg / mL) stok çözeltisini sonicate edin.
- İstenilen maruz kalma çözümlerini (0,1, 1 ve 10 mg/L) üretmek için stok çözeltisini %10 Hank'in çözeltisiyle seyreltin.
- Maruz kalmadan önce her zaman mikroplastiklerin maruz kalma çözümlerini hazırlayın.
NOT: Mikroplastiklerin toksik etkilerini değerlendirirken dikkatli olunmalıdır, çünkü ticari parçacık formülasyonlarında sodyum azit gibi koruyucuların varlığı farklı organizmalar için toksik olabilir 16. Bu nedenle, bu katkı maddeleri toksisite deneyi yapmadan önce kontrollerde çıkarılmalıdır veya dikkate alınmalıdır.
3. Mikroplastik maruziyeti
- Rastgele 6 yeni döllenmiş embriyo (4 hpf) seçin ve ardından farklı konsantrasyonlarda 5 mL mikroplastik çözeltiler içeren 6 kuyulu plakanın her kuyusuna aktarın. %10 Hank'in çözümünü içeren kontrol gruplarını dahil edin.
- Her tedavi için triplikat kuyuları (toplam 18 embriyo ile) kullanın.
- Embriyoları aynı ışık altında kuluçkaya yatırın: yetişkinlerle karanlık döngü ve sıcaklık (bkz. 1.2) ve her 12 saatte bir gözlemleyin. Ölüleri hemen çıkarın.
- Mikroplastik çözeltileri her 24 saniyede bir %90 yenileyin. Maruz kalma süresi boyunca balıklar beslenmez.
NOT: Genellikle embriyonun kuluçkası 48 bgf'den başlar ve yaklaşık 72 bgf'de tamamlanır.
4. Mikroplastik dağılımının değerlendirilmesi
- Döllenme sonrası 24, 48, 72, 96 ve 120 saat sonra embriyoları/larvaları rastgele seçin (üç kopyanın her birinden biri) ve % 10 Hank'in çözeltisi ile durulayın.
- Larvaları bir Petri kabına aktarın ve anestezi için% 0.016 trikaine maruz koyun.
- Trikainin stok çözeltisini hazırlayın: 4 mg trikain tozu 100 mL çift damıtılmış suda çözülür ve pH'ı Tris-HCl (pH 9.0) ile 7.0'a ayarlayın. Stok çözeltisini dondurucuda saklayın.
- Çalışma çözümünü hazırlayın. Stok çözeltisini istenen konsantrasyona seyreltin (%0,016) oda sıcaklığında % 10 Hank çözümü ile14.
- Embriyoları / larvaları düzenleyin ve gözleme hazırlanın.
- Floresan mikroskop ve görüntüleme yazılımı ile görüntü ile balıkları gözlemleyin.
- ImageJ ile balıklardaki floresan yoğunluğunu ölçün.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Floresan mikroplastiklerin dağılımı ve birikimi Şekil 1 ve Tablo 1'degösterilmiştir. Pozlanmamış grupta (kontrol) gözle görülür bir floresan görülmez. Bununla birlikte, farklı mikroplastik konsantrasyonlarına maruz kalındıktan sonra koroni çevreleyen bir floresan birikimi bulunur (24 hpf). Larvalarda yeşil floresan da tespit edilir ve floresan seviyelerinin konsantrasyona ve zamana bağlı bir şekilde arttığı görülmektedir. Yumurta sarısı kesesi, perikard ve gastrointestinal sistem mikroplastiklerin ana birikmiş bölgeleridir (Şekil 2).
Şekil 1: Zebra balıklarının embriyolarında/larvalarında floresan polistiren mikroplastiklerin dağılımı (40×). Balıklar kontrol grubundan veya 0.1, 1 ve 10 mg/L'de 500-nm mikroplastiklere maruz kalan gruplardan örneklenir.
Şekil 2: Zebra balığı larvalarında mikroplastik birikimi alanları (40×). Bu larva, 120 saat boyunca 10 mg / L'de 500-nm mikroplastiklere maruz kalan gruptan örneklenmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
| konsantrasyon | embriyo | larva | ||||
| (mg/L) | 24 hpf | 48 hpf a | 48 hpf b | 72 hpf | 96 hpf | 120 hpf |
| Devam. | 1.2±0.1 | 2.6±0.3 | 2.2 | 3.0±0.2 | 2.6±0.7 | 3.3±0.3 |
| 1 | 1.2±0.2 | 5.0±0.1 | 5.3 | 7,5±0,5 | 8.7±0.5 | 10,0±1,9 |
| 0.1 | 7.0±0.9 | 26.1±2.9 | 8.9 | 18.4±0.7 | 16.3±2.8 | 25.7±2.7 |
| 10 | 9.1±1.1 | 82.3±5.3 | 30.4 | 32,7±3,2 | 41,6±0,4 | 44.1±0.9 |
| a: sadece iki embriyo değerlendirildi; b: sadece bir larva değerlendirildi. | ||||||
Tablo 1: Floresan mikroplastiklere maruziyetten sonra zebra balıklarında floresan seviyesinin değişmesi (n=3). Koronun floresan mikroplastiklerin emilimi üzerindeki etkisi nedeniyle, veriler embriyoların (kuluçkadan önce) ve larvaların (kuluçkadan sonra) olmak üzere iki bölüme ayrılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
AB Direktifi 2010/63/EU gibi bilimsel amaçlarla kullanılan hayvanların korunmasına ilişkin kılavuza göre, zebra balıklarının erken yaşam aşamalarını içeren bir deney için, bağımsız beslenme aşamasına kadar hayvan etiği izni zorunlu değildir (döllenmeden 5 gün sonra)17. Bununla birlikte, en iyi refah uygulaması zebra balığı kullanımını optimize etmek için önemlidir ve örneğin, insancıl anestezi ve ötenazi yöntemleri endişe verici olmalıdır. En çok laboratuvarda rutin olarak kullanılan ajan olan etil 3-aminobenzoat metansülfat (MS-222 veya trikain), burada anestezi ve ötanazi için kullanılır.
Mikroskop altında gözlemden önce, dış yüzeyde adsorbe edilen mikroplastikler sonuçlara müdahale edebileceğinden embriyolar ve larvalar durulanmalıdır. Ek olarak, embriyolarda / larvalarda, özellikle ara sıra bildirilen yumurta sarısı kesesinin etrafındaki otofluoresans sorunlu olabilir. Flavinler, nikotinamid-adenin dinükleotid (NAD), aromatik amino asitler, lipofuscinler, gelişmiş gligasyon uç ürünleri ve kolaj gibi birçok biyomacromolekülün varlığı, uygun dalga boyunda heyecanlandığında ışık yayacaktır.
Partikül kirletici olarak, mikroplastik boyutunun biyoyararlanım ve toksisitenin belirleyici faktörlerinden biri olarak kabul edilmesi önemlidir18. Burada kullanılan mikroplastiklerin nominal çapı 500 nm'dir, bu da embriyo koroyonunun gözenek büyüklüğü ile karşılaştırılır (300 nm ila 1 μm aralığında)19. Bu nedenle, bu mikroplastiklerin zebra balığı koroyondan kolayca geçmesi beklenmemektedir. Sürekli olarak, kuluçkadan önce embriyolarda çok az floresan görülür(Şekil 1). Koroyon, büyük boyutlu parçacıklara karşı etkili bir bariyer görevi görebileceğinden, maruz kalmadan önce azil işlemi gerekebilir. Korozyon, önseçimler kullanılarak kolayca çıkarılabilir, ancak embriyolar toplu olarak ele alındığında pronaz ile enzymatic dekonsiyon tercih edilir. Bununla birlikte, dezoforasyon biyoyararlanımı artıracak ve maddelerin toksisitesi için yüksek verimli taramayı kolaylaştıracak olsa da, korozyon bozulmamış embriyonun "gerçek" dünyada maruz kalma durumu göz önüne alındığında kirleticilerin ekotoksisitesini değerlendirmesi daha fazla önerilir.
Mikroplastiklerin balıklar üzerindeki olumsuz etkilerini araştırmaya önemli çabalar ayrılmış olsa da, biyoakümülasyon da dahil olmak üzere mevcut bilgi sınırlı ve hatta çelişkili olmaya devam etmektedir. Bu çalışma tutarsızlıkları esas olarak boyut, yoğunluk ve yüzey özellikleri (örneğin, yüzey yükü) dahil olmak üzere parçacıkların özelliklerinin farklılıklarına atfedilir. Mikroplastiklerin çözeltideki davranışı biyoyararlanm için de kritik öneme sahiptir. Mikroplastiklerin fizikokimyasal özellikleri maruz kalma süresi boyunca izlenmeli ve oluşabilecek toplama olgusu kayıt altına alınmalıdır. Aslında, mikroplastiklerin uzun bir süre askıya alınmasını gerektiren maruziyetler için sonication veya manyetik bir çubukla karıştırma önerilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazar hiçbir rekabet veya finansal çıkar beyan etmemektedir.
Acknowledgments
Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (21777145, 22076170) ve Üniversite Changjiang Akademisyenleri ve Yenilikçi Araştırma Ekibi Programı (IRT_17R97) tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent microscope | Nikon, Japan | Eclipse Ti-S | |
| Green fluorescently labeled polystyrene beads | Phosphorex, USA | 2103A | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich, USA | A5040 |
References
- SAPEA (Science Advice for Policy by European Academies). A Scientific Perspective on Microplastics in Nature and Society. , SAPEA. Berlin. (2019).
- Plastics Europe. Plastics-the facts 2019. , Plastics Europe. Brussels. (2019).
- Andrady, A. L.
- Arthur, C., Baker, J., Bamford, H. Proceedings of the International Research Workshop on the Occurrence, Effects and Fate of Microplastic Marine Debris. National Oceanic and Atmospheric Administration Technical Memorandum. , (2009).
- Ivleva, N. P., Wiesheu, A. C., Niessner, R.
- Lu, T., et al. Pollutant toxicology with respect to microalgae and cyanobacteria. Journal of Environmental Sciences. 99, 175-186 (2021).
- Huang, J. N., et al. Exposure to microplastics impairs digestive performance, stimulates immune response and induces microbiota dysbiosis in the gut of juvenile guppy (Poecilia reticulata). Science of the Total Environment. 733, 138929 (2020).
- Prüst, M., Meijer, J., Westerink, R. H. S. The plastic brain: neurotoxicity of micro- and nanoplastics. Particle and Fibre Toxicology. 17, 24 (2020).
- Jakubowska, M., et al. Effects of chronic exposure to microplastics of different polymer types on early life stages of sea trout Salmo trutta. Science of the Total Environment. 740, 139922 (2020).
- Qiang, L., Cheng, J. Exposure to polystyrene microplastics impairs gonads of zebrafish (Danio rerio). Chemosphere. 263, 128161 (2021).
- Hamed, M., Soliman, H. A. M., Osman, A. G. M., Sayed, A. E. H. Antioxidants and molecular damage in Nile Tilapia (Oreochromis niloticus) after exposure to microplastics. Environmental Science and Pollution Research. 27, 14581-14588 (2020).
- Burns, E. E., Boxall, A. B. A. Microplastics in the aquatic environment: Evidence for or against adverse impacts and major knowledge gaps. Environmental Toxicology and Chemistry. 37, 2776-2796 (2018).
- Ma, H., Pu, S., Liu, S., Bai, Y., Mandal, S., Xing, B. Microplastics in aquatic environments: Toxicity to trigger ecological consequences. Environmental Pollution. 261, 114089 (2020).
- Westerfield, M. The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio reio). 4th ed. , University of Oregon Press. Eugene. (2000).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
- Pikuda, O., Xu, E. G., Berk, D., Tufenkji, N. Toxicity assessments of micro- and nanoplastics can be confounded by preservatives in commercial formulations. Environmental Science & Technology Letters. 6, 21-25 (2019).
- Lidster, K., Readman, G. D., Prescott, M. J., Owen, S. F. International survey on the use and welfare of zebrafish Danio rerio in research. Journal of Fish Biology. 90, 1891-1905 (2017).
- Pitt, J. A., et al. Uptake, tissue distribution, and toxicity of polystyrene nanoparticles in developing zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 194, 185-194 (2018).
- Lin, S. J., Zhao, Y., Nel, A. E., Lin, S. Zebrafish: An in vivo model for nano EHS studies. Small. 9, 1608-1618 (2013).
