Summary
제브라피쉬 배아/애벌레는 외부적으로 발달하며 광학적으로 투명합니다. 초기 생활 단계에서 물고기에 있는 미세 플라스틱의 bio축적은 형광으로 표지된 microbeads로 쉽게 평가됩니다.
Abstract
새로운 유형의 환경 오염 물질인 미세 플라스틱은 수생 환경에서 널리 발견되었으며 수생 생물에 큰 위협이 됩니다. 미세 플라스틱의 생체 축적은 독성 효과에 중요한 역할을합니다. 그러나, 미립자로, 그들의 생체 축적은 많은 그밖 오염 물질과 다릅니다. 여기에 설명된 형광 미세 플라스틱을 사용하여 제브라피시 배아 또는 애벌레에서 미세 플라스틱의 축적 및 분포를 시각적으로 결정하는 실행 가능한 방법이다. 배아는 120h에 대해 직경 500 nm의 형광 미세 플라스틱의 다른 농도 (0.1, 1 및 10 mg/L)에 노출됩니다. 그것은 미세 플라스틱 농도 의존방식으로 제브라피시 배아 / 애벌레에서 생물 축적 할 수있는 결과에 표시됩니다. 부화하기 전에 배아 초리온 주변에서 강한 형광이 발견됩니다. 얼룩말 애벌레에있는 동안, 노른자 낭, 심낭, 위장관은 미세 플라스틱의 주요 축적 사이트입니다. 그 결과는 초기 생활 단계에서 제브라피시의 미세 플라스틱의 섭취와 내재화를 보여 주며, 이는 수생 동물에 대한 미세 플라스틱의 영향을 더 잘 이해할 수 있는 기반을 제공합니다.
Introduction
1900년대에 처음 합성된 이래, 플라스틱은 다양한 분야에서 널리 사용되어 글로벌 생산1의급속한 성장을 초래합니다. 2018년에는전세계적으로 약 3억 6천만 톤의 플라스틱이 생산되었습니다. 자연 환경의 플라스틱은 화학적, 물리적 또는 생물학적 공정으로 인해 미세 입자로 저하됩니다3. 일반적으로 미세 플라스틱 입자< 5mm 크기는 미세 플라스틱4로정의된다. 마이크로 플라스틱은 또한 화장품5의마이크로비드와 같은 특정 응용 분야에 대해 설계되었습니다. 거의 영구적인 오염 물질로, 미세 플라스틱은 환경에 축적되고, 과학자, 정책 입안자 및대중으로부터점점 더 많은 관심을 끌고있다1,6. 이전 연구는 미세 플라스틱이 위장 손상7,신경 독성8,내분비 장애9,산화 스트레스10 및 DNA 손상11과같은 물고기에 악영향을 일으킬 수 있음을 문서화했다. 그러나, 미세 플라스틱의 독성은 완전히 지금까지 밝혀지지 않았다12,13.
Zebrafish 배아는 작은 크기, 외부 수정, 광학 투명성 및 대형 클러치를 포함하여 많은 실험적 이점을 제공하며, 초기 수단계에서 물고기에 대한 오염 물질의 영향을 연구하는 생체 내 이상적인 모델 유기체로 간주됩니다. 또한 생물학적 반응평가를 위해서는 제한된 양의 시험 물질만 필요합니다. 여기서, 제브라피쉬 배아는 5일 동안 미세플라스틱(0.1, 1, 10 mg/L)의 상이한 농도에 노출되고, 제브라피시 배아/유충에서 미세플라스틱의 생체 축적 및 분포를 평가한다. 이 결과는 물고기에 미세 플라스틱의 독성에 대한 우리의 이해를 발전시키고, 여기에 설명 된 방법은 잠재적으로 제브라피시의 초기 생활 단계에서 형광 물질의 다른 유형의 축적 및 분포를 결정하기 위해 일반화 될 수있다.
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Protocol
성인 얼룩말 물고기는 중국 제브라피시 자원 센터 (우한, 중국)에서 유래. 이 실험은 국가 가이드 "동물 복지의 윤리적 검토를위한 실험실 동물 지침 (GB / T35892-2018)에 따라 수행되었습니다.
1. 배아 수집
- 14:10h 광전지에서 일정한 온도(28 ± 0.5°C)에서 숯여과 수돗물 시스템(pH 7.0 ± 0.2)을 재순환하는 20L 유리 탱크에서 물고기를 유지합니다.
- 아르테미아 나우플리이와함께 매일 두 번 생선을 먹이는다. 음식은 하루에 최대 3 % 생선 무게로 주어지며14시에 5 분 이내에 먹어야합니다.
- 잘 발달 된 성인 얼룩말 물고기 (3-4cm의 몸 길이)를 사육 전날 밤 1 명의 남성에서 2 명의 암컷의 비율로 산란 탱크로 옮긴다.
참고: 다음 날 아침, 물고기는 빛 주기가 시작된 후 생성되기 시작합니다. - 파스퇴르 파이펫을 사용하여 계란을 수집합니다. 행크의 용액을 여러 번 헹구고 현미경을 사용하여 수정을 확인하십시오. 수정란은 약 2시간 후 수정(hpf) 후 골짜기 기간을 거치며15를명확하게 식별할 수 있다.
- 28°C에서 소독을 위한 1% 메틸렌 블루로 10% 행크용용100mL의 200mL를 함유한 500mL 비커에서 수정된 배아를 배양한다. 1 배아/2 mL 용액의 적재 속도를 초과하지 마십시오.
참고 : 10 % 행크의 솔루션은 137 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 0.25 mM Na2HPO4,0.44 mM KH2PO4,1.3 mM CCl2,1.0 mM MgSO4 및 4.2 mM NaHCO3로구성됩니다.
2. 미세 플라스틱 현탁액 준비
- 공칭 직경 500nm(발아/방출: 460/500 nm)의 공칭 직경을 10분 동안 녹색 형광표지 폴리스티렌 구슬(10 mg/mL)의 스톡 용액을 초음파 처리합니다.
- 원하는 노출 솔루션(0.1, 1, 10 mg/L)을 생성하기 위해 10% 행크의 솔루션으로 스톡 솔루션을 희석합니다.
- 노출 전에 항상 미세 플라스틱의 노출 솔루션을 준비하십시오.
참고: 소플라스틱의 독성 효과를 평가할 때주의해야 하며, 상업용 입자 제형에서 아지드 나트륨과 같은 방부제가 존재하기 때문에 상이한 유기체(16)에독성이 있을 수 있다. 따라서 이러한 첨가제는 독성 실험을 수행하기 전에 컨트롤에서 제거하거나 고려해야 합니다.
3. 미세 플라스틱 노출
- 무작위로 6 새로 수정 된 배아 (4 hpf)를 선택한 다음 다른 농도를 가진 5 mL의 미세 플라스틱 용액을 포함하는 6 웰 플레이트의 각 우물로 옮김합니다. 행크의 솔루션 10%를 포함하는 제어 그룹을 포함합니다.
- 각 치료에 대해 트리플리케이트 우물(총 18개의 배아)을 사용하십시오.
- 같은 빛 아래 배아를 배양 : 성인으로 어두운 주기와 온도 (1.2 참조) 매 12 시간 관찰. 죽은 자 즉시 제거합니다.
- 24시간마다 미세 플라스틱 솔루션을 90% 갱신합니다. 노출 기간 동안, 물고기는 먹이지 않습니다.
참고 : 일반적으로, 배아의 부화는 48 hpf에서 시작하여 약 72 hpf에서 완료됩니다.
4. 미세 플라스틱 분포 평가
- 24, 48, 72, 96 및 120 h 의 후 수정에서 배아 /애벌레 (각각3 개의 복제에서 하나)를 무작위로 선택하고 10 % Hank의 용액으로 헹구습니다.
- 애벌레를 페트리 접시에 옮기고 마취를 위해 0.016 % 트리카인에 노출하십시오.
- 트리카인의 재고 용액 준비: 트리카인 분말 4 mg은 이중 증류수 100mL에 용해되고, Tris-HCl(pH 9.0)으로 pH를 7.0으로 조정한다. 재고 용액을 냉동실에 보관하십시오.
- 작업 솔루션을 준비합니다. 주식 용액을 원하는 농도(0.016%)로 희석 실온14에서행크의 10 % 용액.
- 배아/애벌레를 준비하고 관찰을 준비한다.
- 이미징 소프트웨어로 형광 현미경 및 이미지로 물고기를 관찰하십시오.
- ImageJ로 물고기의 형광 강도를 정량화합니다.
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Representative Results
형광 미세 플라스틱의 분포 및 축적은 도 1 및 표 1에표시됩니다. 노출되지 않은 그룹(control)에서 눈에 보이는 형광이 관찰되지 않습니다. 그러나, 형광의 축적은 미세 플라스틱 (24 hpf)의 다른 농도에 노출 된 후 초리온을 둘러싼 발견된다. 녹색 형광은 또한 애벌레에서 검출되고, 형광 수준은 농도 및 시간 의존적인 방식으로 증가하는 것처럼 보입니다. 노른자 낭, 심낭 및 위장관은 미세 플라스틱의 주요 축적 된 사이트입니다(그림 2).
그림 1: 제브라피시의 배아 /애벌레에서 형광 폴리스티렌 미세 플라스틱의 분포 (40×). 물고기는 대조군에서 샘플링되거나 0.1, 1 및 10 mg/L. Scale bar 100 μm에서 500-nm 마이크로 플라스틱에 노출된 그룹은 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 제브라피시 애벌레에 미세 플라스틱 축적 부위 (40×). 이 유충은 120 시간 동안 10 mg / L에서 500-nm 미세 플라스틱에 노출 된 그룹에서 샘플링됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 농도 | 배 | 유충 | ||||
| (mg/L) | 24 hpf | 48 hpf a | 48 hpf b | 72 hpf | 96 hpf | 120 hpf |
| 계속. | 1.2±0.1 | 2.6±0.3 | 2.2 | 3.0±0.2 | 2.6±0.7 | 3.3.±0.3 |
| 1 | 1.2±0.2 | 5.0.±0.1 | 5.3 | 7.5±0.5 | 8.7±0.5 | 10.0±1.9 |
| 0.1 | 7.0±0.9 | 26.1±2.9 | 8.9 | 18.4±0.7 | 16.3±2.8 | 25.7±2.7 |
| 10 | 9.1±1.1 | 82.3±5.3 | 30.4 | 32.7±3.2 | 41.6±0.4 | 44.1±0.9 |
| a: 단 2개의 배아만 평가되었습니다. b: 애벌레 한 개만 평가했습니다. | ||||||
표 1: 형광 미세 플라스틱 (n =3)에 노출 된 후 제브라피시의 형광 수준의 변화. 형광 미세 플라스틱의 흡수에 대한 초리온의 영향으로 인해 데이터는 배아 (부화 전)와 애벌레 (부화 후)의 두 부분으로 나뉩니다.
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Discussion
EU 지침 2010/63/EU와 같은 과학적 목적으로 사용되는 동물의 보호지침에 따르면, 독립적인 먹이주기(5일 후수정)단계까지 제브라피시의 초기 생활 단계 실험에 대해 동물 윤리 허가는 필수가 아니다. 그러나, 모범 복지 관행은 제브라피시의 사용을 최적화하는 데 중요하며, 예를 들어 마취와 안락사의 인도적 방법이 우려되어야 합니다. 에틸 3-aminobenzoate 메탄황산염 (MS-222, 또는 트리카인), 대부분의 실험실에서 일상적으로 사용되는 에이전트, 마취와 안락사를 위해 여기에 사용된다.
현미경의 밑에 관찰하기 전에, 외부 표면에 흡착된 미세 플라스틱이 결과를 방해할 수 있기 때문에 배아및 애벌레는 헹구어야 합니다. 또한, 배아/애벌레의 자동 불발, 특히 때때로 보고된 노른자 낭 주위의 자가 불화는 문제가 될 수 있습니다. 플라빈, 니코티나미드 아데닌 디뉴클레오티드(NAD), 방향족 아미노산, 리포푸스신, 고급 당화 최종 제품 및 콜라주와 같은 많은 바이오 매크로분자의 존재는 적절한 파장에서 흥분하면 빛을 방출할 것이다.
미립자 오염물질로서 미세 플라스틱의 크기는 생체 이용률 및독성(18)의결정 요인 중 하나로 간주된다는 점에 유의하는 것이 중요하다. 여기서 사용되는 미세 플라스틱의 명목 직경은 500 nm이며, 이는 배아 초리온의 모공 크기와 비교된다 (300 nm 내지 1 μm 범위 내)19. 따라서 이러한 미세 플라스틱은 제브라피시 초리온을 쉽게 통과할 것으로 예상되지 않습니다. 일관되게, 부화하기 전에 배아에서 볼 수있는 형광이 거의 없다(도 1). 초리온은 큰 크기의 입자에 대한 효과적인 장벽역할을 하기 때문에, 노출되기 전에 의 반향 과정이 필요할 수 있다. 초리온은 포셉을 사용하여 쉽게 제거할 수 있지만, 배아가 대량으로 처리될 때 pronase를 이용한 효소 비반향이 바람직하다. 그러나, 비반향은 생체 이용률을 증가시키고 물질의 독성에 대한 높은 처리량 스크리닝을 용이하게 할 것이지만, chorion을 그대로 가진 배아는 "실제"세계에서 노출 상태를 고려할 때 오염 물질의 생태 독성을 평가하는 것이 더 좋습니다.
비록 상당한 노력은 물고기에 미세 플라스틱의 부작용을 조사에 전념 했다, 현재 지식, 생체 축적의 포함 하 여, 제한 되 거나 심지어 충돌 남아. 이러한 연구 전반에 걸친 불일치는 주로 크기, 밀도 및 표면 특성(예: 표면 전하)을 포함한 입자의 특성 차이에 기인합니다. 용액에서 미세 플라스틱의 동작은 생체 이용률에도 중요합니다. 미세 플라스틱의 물리화학적 특성은 노출 기간 동안 추적되어야 하며, 발생할 수 있는 응집 현상은 기록되어야 한다. 사실, 미세 플라스틱을 장기간 중단해야 하는 노출의 경우 마그네틱 바로 초음파 처리 또는 교반하는 것이 좋습니다.
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Disclosures
저자는 경쟁또는 재정적 이익을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작품은 중국 국립 자연과학 재단(21777145, 22076170)과 창장학자 및 대학 혁신 연구팀(IRT_17R97)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescent microscope | Nikon, Japan | Eclipse Ti-S | |
| Green fluorescently labeled polystyrene beads | Phosphorex, USA | 2103A | |
| Tricaine | Sigma-Aldrich, USA | A5040 |
References
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