Summary
כאן אנו מתארים פרוטוקול לטיפוח שיטתי של כדורי אפידרמיס בתרבות השעיה תלת-ממדית. פרוטוקול זה כולל יישומים נרחבים לשימוש במגוון סוגי רקמות אפיתל ולדוגמנות של מספר מחלות ותנאים אנושיים.
Abstract
דיסרגציה אפיתל היא צומת עבור מגוון רחב של מצבים אנושיים ומחלות, כולל פצעים כרוניים, דלקת, ומעל 80% של כל סוגי הסרטן האנושי. כרקמת בטנה, אפיתל העור נתון לעתים קרובות לפציעה והותאם אבולוציונית על ידי רכישת הפלסטיות התאית הדרושה לתיקון רקמות פגומות. במהלך השנים נעשו מספר מאמצים לחקור פלסטיות אפיתל באמצעות מודלים מבוססי תאי במבחנה ואקס ויוו. עם זאת, מאמצים אלה הוגבלו ביכולתם לשחזר את השלבים השונים של פלסטיות תאי האפיתל. אנו מתארים כאן פרוטוקול ליצירת כדורי אפידרמיס תלת-ממדיים ותאים שמקורם בספירואיד אפידרמלי מקריטינוציטים אנושיים יילודים ראשוניים. פרוטוקול זה מתאר את היכולת של תרביות ספרואיד אפידרמיס מודל פונקציונלי שלבים נפרדים של פלסטיות יוצרת קרטינוציטים ומדגים כי ציפוי מחדש של כדורי אפידרמלי יכול להעשיר תרביות קרטינוציטים אנושיים נורמליים הטרוגניים (NHKc) עבור integrinα6hi/ EGFRlo keratinocyte subpocyte עם מאפיינים דמויי גזע משופרים. הדו"ח שלנו מתאר את הפיתוח והתחזוקה של מערכת תפוקה גבוהה לחקר פלסטיות קרטינוציטים בעור והתחדשות אפידרמלית.
Introduction
האפיתל המרובד של היונקים הוא הארכיטקטורה האפיתלית המורכבת ביותר בכל מערכות החיים, והוא נתון לרוב לנזק ופציעה. כרקמת הגנה, אפיתל רבדים התפתח כדי ליצור תגובת נזק לרקמות מורכבת ויעילה. עם הפגיעה, תאים אלה חייבים להפעיל תוכניות פלסטיות שושלת, המאפשרות להם לנדוד לאתר הפגוע ולבצעתיקון 1,2,3. תגובה רבת פנים זו מתרחשת במספר שלבים רציפים שנותרו מובנים היטב.
מכשול מרכזי בחקר התהליך המורכב של התחדשות אפיתל טמון במחסור במערכות מודל תפוקה גבוהה שיכולות ללכוד פעילויות תאיות דינמיות בשלבים מוגדרים של התחדשות תאים. בעוד שמודלים של עכברי vivo מציעים תובנה רלוונטית על ריפוי פצעים ומחדשים מקרוב את תהליך ההתחדשות האנושית, ההתפתחות שלהם דורשת מאמצים מייגעים ועלות משמעותית, ומגבילה את יכולת התפוקה שלהם. קיים, אם כן, צורך קריטי בהקמת מערכות המאפשרות חקירה תפקודית של התחדשות רקמת אפיתל אנושית בקנה מידה גבוה של תפוקה.
בשנים האחרונות נעשו מספר ניסיונות לעמוד באתגר המדרגיות. זה בא לידי ביטוי באמצעות התרחבות גדולה של דגמים חדשניים במבחנה ובאקס ויוו המבוססים על תאים המחקים מקרוב את ההקשר המתחדש של in vivo. זה כולל התקדמות איבר על שבב4,ספרואיד5,organoid6, ותרבויות אורגנוטיפיות7. מערכות תלת-ממדיות אלה מבוססות תא כל אחת מציעות יתרונות ייחודיים ומציגות מגבלות ניסיוניות ברורות. עד כה, תרבות כדורית נותרה המודל החסכוני ביותר של תרבית תאים תלת-ממדית בשימוש נרחב. ובעוד מספר דיווחים הצביעו על כך שניתן להשתמש בתרביות כדוריות כדי לחקור את מאפייני תאי הגזע של העור, מחקרים אלה נערכו במידה רבה עם רקמת בעלי חיים8,9, או עם פיברובלסטים עוריים10, עם כמעט שום דיווחים המאפיינים ביסודיות את המאפיינים המתחדשים של תרביות ספרואיד אפידרמיס אנושיות. בפרוטוקול זה אנו מפרטים את ההתפתחות התפקודית, התרבות והתחזוקה של תרביות כדוריות אפידרמיסיות מקרטינוציטים אנושיים רגילים (NHKc). אנו מתארים באותה מידה את התועלת של מערכת זו כדי לדגמן את השלבים הרציפים של התחדשות אפידרמלית ופלסטיות תאי גזע קרטינוציט במבחנה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הפרוטוקול לאיסוף וטיפול בדגימות עור ובידוד של קרטינוציטים אנושיים נבדק על ידי אוניברסיטת דרום קרוליינה (UofSC) IRB ומסווג כ"מחקר שאינו מעורב בנושאים אנושיים ", שכן דגימות העורלה היו פסולת כירורגית שהופקה במהלך הליכים כירורגיים שגרתיים (ברית מילה של נערי ניאון) והיו נטולות מידע מזהה לחלוטין. הפרוטוקול נבדק ואושר גם על ידי ועדת הבטיחות הביולוגית של UofSC על בסיס קבוע, וכל אנשי המעבדה עברו הכשרה בבטיחות ביולוגית במעבדה. כל ההליכים נערכו בהתאם לסטנדרטים הבטיחותיים והאתיקה של UofSC.
1. בידוד ותרבות של קרטינוציטים אנושיים מרקמת עורלה יילודים
- הכן שטיפה בינונית על-ידי הוספת מאגר HEPES של 0.1 M ל- 500 מ"ל של בינוני KSFM והתאם אותו ל- pH של 7.2. לחטא בינוני במסנן ואקום 500 מ"ל (גודל נקבובית 0.22 מיקרומטר). מדיום בזאלי MCDB 153-LB יכול לשמש גם כפתרון כביסה חלופי במקום KSFM.
- במכסה המנוע של זרם למינאר, יש לשטוף עורלה ליילודים עם 5 מ"ל של מדיה לשטוף בצינור חרוט 50 מ"ל. חזור פעמיים.
- מעבירים את השטיפה לצלחת פטרי סטרילית. בעזרת אזמל ומלקחיים, יש לגרד שומן ורקמות חיבור רופפות משכבה העורית. שטוף מחדש את עורלה עם 5 מ"ל של מדיה לשטוף בצינור חרוט 50 מ"ל.
- מניחים את צד האפידרמיס של עורלה בצלחת של 6 בארות המכילה 2 מ"ל של אנזים דיפז מדולל במדיה לשטוף (50 U /ML).
- מעבירים את הצלחת לאינקובטור למשך 4 שעות (37 °C (37 °C), 5% CO2, 95% לחות).
- מוציאים עורלה מהאינקובטור, ובתנאים סטריליים, מעבירים אותה לצלחת פטרי. בעזרת מלקחיים עדינים, יש להפריד את האפידרמיס משכבה הדרמיס.
- מניחים אפידרמיס לתוך צינור חרוט 15 מ"ל המכיל 2 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA. באמצעות צינור סרולוגי 5 מ"ל, למחוץ מכנית את האפידרמיס הצף. דגירה במשך 15 דקות ב 37 °C (5 °F) עם מערבולת תקופתית עבור 5 s כל 5 דקות.
- לאחר הדגירה, להוסיף 2 מ"ל של מעכב טריפסין סויה ומערבבים על ידי pipetting כדי לנטרל את טריפסין.
- השעיית תא צנטריפוגה למשך 2 דקות ב-450 x גרם,ולאחר מכן למשך 8 דקות ב-250 גרם.
- הסר פסולת צפה עם מלקחיים, נזהר לא להוציא את גלולה התא. שאפו בזהירות את סופר-נט מכדור התא.
- כדור resuspend ב 12 מ"ל של בינוני KSFM-scm מלא צלחת בצלחת 10 ס"מ. צלחת דגירה לילה (37 °C (37 °F), 5% CO2, 95% לחות).
- למחרת, להסיר בינוני באמצעות pipette שאפתני ולהחליף עם 12 מ"ל להשלים KSFM-ס"מ. חזור על הפעולה בימים 4 ו -7.
- כדי לשמור על צמיחה אופטימלית של תרביות קרטינוציט אנושיות נורמליות (NHKc), תאי מעבר 1:5 ביום 10 כדי למנוע מהתאים להשיג יותר מ-80% השפעה.
2. יצירת תרביות אפידרמוספרה בעור במבחנה
- הכן תערובת אגרוז 5% על ידי הוספת 2.5 גרם של אגרוז ל 50 מ"ל של 1x תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS), בבקבוק זכוכית 50 מ"ל. בקבוק אוטומטי תחת מחזור נוזלי. אפשר להתקרר לטמפרטורת החדר.
- להכנת צלחות, מניחים את בקבוק הזכוכית מקורר המכיל תמיסת אגרוז בכוס פלסטיק 1 L מלא במים deionized 200 מ"ל (dH2O). ממיסים את תערובת אגרוז במיקרוגל ברמת מחקר עד 2 דקות, ומערבבים את האגר כל 60 s על ידי הטיה עדינה של הבקבוק מצד לצד.
אזהרה: המסת אגר במיקרוגל תגרום למיכל הבקבוקון להיות חם מאוד וכתוצאה מכך הצטברות לחץ. לחץ שחרור הצטברות כל 30s. ללבוש ציוד מגן מתאים כדי למנוע פגיעה. - הוסף 3 מ"ל של אגורוז מומס 5% ל 12 מ"ל KSFM-scm מוזהר מראש ל 42 °C (5 °F) לריכוז סופי של 1% אגרוז (wt/vol).
אופציונלי: לחמם מראש את פיפטות סרולוגיות וטיפים פיפטה כדי למנוע פילמור מוקדם של אגר רך. - במהירות pipette 200 μL של תערובת אגר 1% לתוך בארות בודדות של צלחת עגולה 96 היטב באמצעות pipettor רב ערוצית(איור 1A). השאר צלחת בסביבה סטרילית ב 25 °C (4 שעות) כדי לאפשר agarose כדי פולימר מלא.
הערה: ניתן לעצור את הניסויים כאן ולהמשיך למחרת. לוחות אגרוז פולימריים ניתן לשמור על 37 °C (5 °F) עד 24 °C (4 °F) עד 4 °C (4 °F) כאשר אטום עם עטיפת parafilm. צלחת חמה ל 37 °C (50 °F) בחממה לחה לפחות 1 שעה לפני השימוש. - מעבר בצורת כדורי NHKc על ידי שאיפה מדיה ותאי כביסה ב 2 מ"ל של PBS. שאפו PBS והוסיפו 2 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA לתאים שטופים. דגירה במשך 5 דקות ב 37 °C (5 °F) או עד שכל התאים מנותקים לחלוטין. הוסף 2 מ"ל של מעכב טריפסין סויה לצלחת ולשטוף את התאים מהצלחת לתוך צינור 15 מ"ל. צנטריפוגה ב 250 x g במשך 5 דקות.
- גלולה resuspend ב 1 מ"ל של PBS. כימת את הכדאיות של התא באמצעות כתמים כחולים טריפן והמוציטומטר או מונה תאים אוטומטי.
- Aliquot 2 x 104 NHKc ב 100 μL של KSFM-scm וזרע לתוך בארות בודדות של צלחת 96-תחתית עגולה שהוכנה בעבר. צלחת דגירה לילה (37 °C (37 °F), 5% CO2, 95% לחות).
- באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוכה, לנתח זרעים היטב להיווצרות אפידרמוספרה.
הערה: אפידרמוספרות אנושיות מקריטינוציטים אנושיים רגילים יכולות להישאר קיימות בתרבות השעיה תלת-ממדית עד 96 שעות, אם כי עם ירידה ניכרת ערך התאים (איור 2).
3. אפידרמלי כדורי ציפוי מחדש
- 24-48 שעות לאחר היווצרות אפידרמוספרה תלת-ממדית, הוסיפו 4 מ"ל של KSFM-ס"מ מחמם מראש לצלחת של 6 ס"מ. השתמש קצה פיפטה רחב נשא 1 מ"ל כדי להעביר כדורי יחיד לצלחת, להבטיח לא לשבור אותו לגזרים. לחלופין, הרחב קצה פיפטה של 1 מ"ל באמצעות סכין גילוח סטרילי כדי לחתוך את הקצה.
- לדגור על הצלחת לילה (37 °C (37 °C), 5% CO2, 95% לחות).
- נתחו כדורי זרעים לחיבור לתחתית הצלחת והתבוננו בהפצת תאים באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות פאזההפוך (איור 3). להאכיל תאים כל 96 שעות על ידי הסרה עדינה של 2 מ"ל של המדיה בתוך הצלחת לאט הוספת 2 מ"ל טרי KSFM-scm מדיה לצלחת.
- מעבר נגזר כדורי (SD) NHKc ברגע שהם מגיעים 70-80% השפעה ולהמשיך עם ניסיון בחירה. נטר את SD-NHKc לעתים קרובות כדי למנוע מהתאים להגיע להשפעה מלאה בתרבית, מכיוון שהדבר גורם לבידול מוקדם ומעצר צמיחת תאים (איור 3E-F).
- האפידרמיס ספרואיד המשיב מודלים של בדיקות תיקון פצעים בתיווך קרטינוציטים על ידי לכידת כל אחד מהפעימות הרציפות העיקריות של הפלסטיות ההתחדשותית האפידרמית: א) תחזוקה הומיאוסטטית, ב) עצירת בידול/היפוך c) ניידות שושלת הלחץ, ו- d) שחזור רקמות (איור 1B; טבלה 2). בדיקה זו יכולה לשמש גם כדי לייצר אוכלוסיות תאים עבור תרביות רפסודות אורגנוטיפיות או לדגם ניאופלסיה בתיווך HPV כפי שהוכח בעבודה הקודמת שלנו 11,12.
4.3D מעקב אחר תאי פלואורסצנטיות
- בצלחת 6 ס"מ, טרנספקט לתרבות NHKc יוצרות כדוריות עם 1 מיקרוגרם של pMSCV-IRES-EGFP וקטור פלסמיד הנושא את הגן המשופר של חלבון פלואורסצנטי ירוק (eGFP). צלחת דגירה לילה (37 °C (5 °F), 5% CO2, 95% לחות) מיקרוסקופ(איור 4A).
הערה: חשוב כי transfection הושלמה בתנאים ללא אנטיביוטיקה ללא סרום. - מבלי להסיר תמהיל טרנספקטו, יש להוסיף לתאים 2 מ"ל של KSFM-scm עם התחממות מוקדמת. צלחת דגירה לילה (37 °C (37 °F), 5% CO2, 95% לחות).
- שאפו את כל אמצעי ההדבקה מתאי צלחת והזנה עם 3 מ"ל של KSFM-scm שהופצו מראש.
- מעבר וזרע 2 x 104 תאים EGFP-transfected לתוך בארות בודדות של צלחת 96-טוב-תחתית מוכן בעבר. צלחת דגירה לילה (37 °C (37 °F), 5% CO2, 95% לחות). דמיינו וניטור תנועת תאים כדורייםשל קופת EGFP מתחת לערוץ FITC של מיקרוסקופ פלואורסצנטי(איור 4B-C).
- 24 שעות לאחר ה ציפוי, מוסיפים 3 מ"ל של KSFM-scm מתוכנן מראש לצלחת 6 ס"מ. השתמש קצה פיפטה רחב נשא 1 מ"ל כדי להעביר כדורי יחיד לצלחת, להבטיח לא לשבור אותו לגזרים. צלחת דגירה לילה (37 °C (37 °F), 5% CO2, 95% לחות).
- התבונן וניתח הפצת SD-NHKcEGFP באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הזן תאים כל 96 שעות על ידי הסרה עדינה של 2 מ"ל המדיה בתוך הצלחת והוספת מדיה KSFM-scm טרי 2 מ"ל לצלחת.
- קציר SD-NHKCEGFP לבידוד FACS או לבדיקות של בחירה.
5. אפיון אוכלוסיות משנה שמקורן בספירואיד (SD) על ידי FACS
- מעבר SD-NHKc ותרבויות מונו-שכבתיות דו-ממדיות אוטולוגיות תואמות על ידי שאיפה של מדיה ישנה ותאי כביסה ב-2 מ"ל של PBS. הסר PBS ולהוסיף 2 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA לתאים שטופים. דגירה ב 37 °C (5 דקות) או עד שכל התאים מנותקים לחלוטין.
- הוסף 2 מ"ל של מעכב טריפסין סויה צלחת ולהעביר תאים לתוך צינור 15 מ"ל. צנטריפוגה ב 250 x g במשך 5 דקות.
- כדורי resuspend ב 1 מ"ל של PBS. לכמת את הכדאיות של התא באמצעות כחול טריפן ודלפק תאים אוטומטי של המוציטומטר.
- Aliquot 100 μL המכיל 0.1-4 x 106 תאי NHKc לצינורות מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל. הניחו שפופרת על קרח בסביבה חשוכה, שנוצרה על ידי כיבוי אורות בהירים בתוך מכסה המנוע למינאר.
- הוסף 2 μL של FITC מצומד אנטי integrinα6 ו 2 μL של PE מצומד נגד EGFR צינורות כדי להשיג 1:50 דילול. הכן צינור ללא נוגדנים שנוספו לשמש כשליטה לא מוכתמת. צינורות דגירה על קרח בחושך או ב 4 °C (50 °F) במשך 30 דקות. השימוש חרוזים או קו SCC העור יכול לשמש שליטה חיובית, כמו תאי SCC העור להביע רמות גבוהות של integrinα6 ו EGFR.
- בצע ניתוח ציטומטריית זרימה באמצעות cytometer זרימה של בחירה המכיל עם לייזרים מתאימים.
- השתמש בבקרות השליליות והחיוביות כדי להקים שערים. מיין את תת-אכלוס של integrinα6hi/EGFRlo תאים; אלה הם שבר תא הגזע האפידרמלי. Integrinα6hi/EGFRhi תאים הם שבר תא אב שגשוג. תאי האינגרין 6lo/EGFRhi הם שבר תא אב מחויב(איור 4D). מיון צינורות FACS צריך להכיל לפחות 1 מ"ל של KSFM-scm קר כקרח.
- בדוק קיבולת שגשוג של תת-אוכלוסין של תאים ממוינים על-ידי העברת התוכן של כל צינור מיון בהתאמה לצינור חרוטי של 15 מ"ל המכיל פי 10 מהנפח של תאים ממוינים ב- PBS. הערה: חשוב להסיר את כל התאים המחוברים לשפה על ידי צנרת הקיר של צינורות FACS מיון מספר פעמים, כמו keratinocytes יכול לעתים קרובות לדבוק שם.
- צנטריפוגה 15 מ"ל צינורות ב 250 x גרם במשך 5 דקות. הסר גלולה supernatant ו resuspend ב 12 מ"ל של KSFM-scm. העבר את התאים resuspended לתוך צלחת 6 ס"מ ודגורה לילה (37 °C (37 °C , 5% CO2, 95% לחות).
- למחרת, להסיר מדיה בצלחות ולהוסיף 8 מ"ל חם מראש KSFM ס"מ. דגירה ב 37 °C (5 °F), 5% CO2, 95% לחות. להאכיל מחדש תאים עם 12 מ"ל בינוני כל 3 ימים עד 70-80% confluent (איור 4E).
6. אימונופלואורסצנטיות והכתמה של אפידרמוספרות עבור סמני תאי גזע בזאליים
- מעבירים אפידרמוספרות על כיסויים מצופים בפולי-ליסין. אפשר ל-SD-NHKc להתפשט עד 75% מפגש.
- לשטוף תאים פעמיים PBS (4 °C) במשך 5 דקות כל אחד.
- תקן תאים עם 4% paraformaldehyde (PFA) במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
- פרמז'יליזם תאים עם 0.5% טריטון X-100 ב-1% גליצין. לחסום באמצעות 0.5% BSA ו 5% סרום עז במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- מדגם דגימות עם נוגדנים נגד P63 (1:200) ו cytokeratin 14 (1:200) בחסימת פתרון לילה ב 4 °C (4 °F).
- לשטוף שלוש פעמים עם PBS (4 °C) המכיל Tween 20 (PBST), ואחריו דגירה עם FITC-ואלקסה 568 - נוגדנים משניים מצומדים (1:1000 דילול).
- גרעיני כתמים עם 4', 6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) (דילול 1:5000) לפני הרכבת תאים.
- התבונן בתאים באמצעות מיקרוסקופ בעל יכולת פלואורסצנטית עם קווי לייזר FITC ו- PE (איור 4F).
7. ניתוח תמלול של תרביות אפידרמוספרה
- הגדר לוחות משולשים של תרבויות NHKc במעבר נמוך כדי לבודד RNA יכול להיות מתרבויות מונו-שכבתיות, כדוריות וספירואידיות מאותו קו תאים אוטולוגי.
- בריכה 3-5 אפידרמוספרות מתאימות לתוך צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל. בנפרד לקצור תרבויות אוטומטיות SD-NHKc ו 2D monolayer.
- בודדו את הרנ"א הכולל מכל שלוש הקבוצות.
- בצע תמלול הפוך עם 1 מיקרוגרם של RNA כולל.
- באמצעות cDNA, בצע PCR בזמן אמת, תוך שימוש ב- GAPDH כפקד פנימי (טבלה 1).
- אמת את גודל המוצר של אמפלייקון על ידי אלקטרופורזה ג'ל אגרוז (2% v/ v).
הערה: ליצירת פרופילים כלל-קומיים של תרביות אפידרמוספרה באמצעות ניתוח מיקרואורי של גנום שלם, בודדו את הרנ"א הכולל מתרביות המוניות של תורם NHKc יחיד ו- SD-NHKc מקביל מאותו תורם, בשישה שכפולים כל אחד. - הערכת איכות הרנ"א באמצעות ביואנליזר כדי להשיג מספרי תקינות RNA (RIN) הנעים בין 9.0 ל-9.1 לפחות.
- בצע ניסויי microarray על ידי להגביר וביוטינילציה דגימות RNA הכולל.
- תמלל הפוך 100 ננוגרם של RNA כולל לכל דגימה לתוך ds-cDNA באמצעות פריימרים אקראיים NNN המכילים רצף מקדם פולימראז T7 RNA.
- הוסף T7 RNA פולימראז לדגימות cDNA כדי להגביר את RNA, ולאחר מכן להעתיק RNA ל- ss-cDNA. השפלת RNA עודף באמצעות RNase H.
- שבר מולקולות sscDNA תווית עם ביוטין.
- להגביר דגימות מסומנות עבור 16 שעות ב 45 °C (70 °F).
- היברידי דגימות באמצעות תנור הכלאה וערכת כביסה וכתמים.
- לשטוף ולהכתים מערכים היברידיים.
- סרוק מערכים באמצעות תחנת עבודה של המערכת והמחשב.
- לאחר השלמת סריקות מערך, ייבוא קבצי עוצמת תאי בדיקה (CEL) לתוכנת מסוף ביטוי ולתהליך ברמת הגן באמצעות קובץ ספריה ואלגוריתם ניתוח Multichip חזק (RMA) ליצירת קבצי CHP.
- לאחר אישור איכות הנתונים בתוך מסוף הביטויים, יבא קבצי CHP המכילים אותות ביטוי של Log2 עבור כל בדיקה לתוכנת ניתוח transcriptome כדי לנתח תגובות תמלול ספציפיות לסוג תא באמצעות ניתוח חד-כיווני בין נושאים של שונות.
8. הערכת יעילות יצירת המושבה SD-NHKc
- שאפו מדיה מלוחות כאשר תאים מגיעים ל-70-80% השפעה. לשטוף תאים שלוש פעמים PBS (4 °C)- במשך 5 דקות כל אחד.
- תקן תאים עם 3 מ"ל של 100% מתנול (4 °C (5 °F) למשך 15 דקות. לשטוף שלוש פעמים PBS במשך 5 דקות כל אחד.
- כתם תאים ב 3 מ"ל של 10% Giemsa במשך 30 דקות. לשטוף שלוש פעמים PBS במשך 5 דקות כל אחד. אפשר לתאים להתייבש במהלך הלילה.
- לנתח היווצרות מושבה למחרת ולכומת את מספר המושבות שהושגו
9. קביעת הכפלת אוכלוסיית SD-NHKc
- מעבר SD-NHKc ותרבויות מונו-שכבתיות דו-ממדיות אוטולוגיות תואמות על ידי שאיפה של מדיה ישנה ותאי כביסה ב- PBS 2mL. הסר PBS ולהוסיף 2 מ"ל 0.25% טריפסין-EDTA לתאים שטופים. דגירה במשך 5 דקות או עד שכל התאים יתנתקו לחלוטין (37 °C (37 °C), 5% CO2, 95% לחות).
- הוסף 2 מ"ל של מעכב טריפסין סויה צלחת ולהעביר תאים לתוך צינור 15 מ"ל.
- צנטריפוגה ב 250 x g במשך 5 דקות.
- הסר את גלולה supernatant ו resuspend ב 12 מ"ל של KSFM-ס"מ.
- תאי זרעים בצפיפות נמוכה 1-2 x 104 NHKc למנות בודדות של 10 ס"מ ודגרה בין לילה (37 °C (37 °C (5%, 5% CO2, 95% לחות).
- לוחות הזנה עם 8 מ"ל KSMF-scm למחרת. להאכיל כל 4 ימים עד לפחות 25% confluent, ולאחר מכן להאכיל כל 2 ימים.
- תאים מעבר סדרתי 1:5 ב 60 ס"מ מנות עד קיבולת התפשטות התא מוצה. לכמת את הכדאיות של התא על-ידי כתמים כחולים של טריפן. קביעת הכפלת אוכלוסין בכל מעבר באמצעות הנוסחה: log(N/N0) / log2, כאשר N מייצג את מספר התא הכולל המתקבל בכל מעבר ו- N0 מייצג את מספר התאים מצופים בתחילת הניסוי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
במהלך בדיקת האפידרמוספרה של העור, תרביות NHKc נזרעות בבארות מצופות אגרוז של צלחת 96 באר(איור 1A). תאים היוצרים כדוריים צריכים לצבור את עצמם בתוך 48h. היווצרות כדורית אוטונומית ניתן להעריך כבר 24 שעות באמצעות מיקרוסקופ פזה הפוך סטנדרטי. היווצרות אפידרמוספרה בעור וציוץ מחדש מודלים שונים של התחדשות רקמת האפידרמיס(איור 1B). איור 2 מציג תמונות ברזולוציה גבוהה של זני NHKc שונים שנחשבו ליכולת יצירת כדורי אפידרמיס בתרבות תלת-ממדית. חשוב לבחון את התאים לצבירה צפופה של צורת כדור, שכן זהו סימן היכר של היווצרות כדורית ספונטנית. מצאנו לנכון להשתמש ביותר מ 2 x 104 תאים כדי להבטיח צבירה ספונטנית נכונה. צבירת תאים לא כדוריים, כמו למשל זנים איור 2A, אינו נחשב היווצרות אפידרמוספרה נאותה. ציפוי שאינם כדוריים ויוצרים השעיות תאים בחזרה בתרבות חד שכבתית דו-שכבתית לעיתים רחוקות גורמת לצמיחה בת קיימא של תאי NHKc. עם זאת, ציפוי של אפידרמוספרות בתרבות דו-ממדית גורם להתפשטות של NHKc בת קיימא בגודל קטן (איור 3). ניתן לצפות ולנטר תמונות של אפידרמוספרות ו- SD-NHKc באמצעות מיקרוסקופ סטנדרטי של ניגודיות פאזה. חשוב לשמור על תרבויות אלה מתחת ל-100% השפעה, שכן הדבר עלול לרסן במידה ניכרת את צמיחתן ואת מצב תאי הגזע שלהן בתרבות (איור 3E-F). תהליך היווצרות כדורי אפידרמיס יכול להיות במעקב פונקציונלי ברמת התא הבודד על ידי טרנספרציות תאים עם כתב פלואורסצנטי (איור 4A-C). בתנאים אופטימליים, תת-אכלוס קרטינוציט מועשר בעיקר בתרביות SD-NHKc הם תאילו אינטגריןα6hi/EGFR. תאים אלה מהווים בדרך כלל כ-25% מכל תרביות ה-SD-NHKc וניתן לבודד אותם בקלות על ידי FACS (איור 4D). עם זאת, חשוב להקים אזור פיזור קדמי בצד (FSC-A) ושערים באזור פיזור צד (SSC-A) כדי לא לכלול מכפילים(איור 4D). אפיון נוסף של תת-אוכלוסין זה דמוי גזע ניתן להשיג על ידי ניתוח כתמים אימונופלואורסצנטי של ביטוי סמן תאי גזע אפידרמליים, כגון ציטוקרטין בזאלי 14 (K14) וחלבון גידול 63 (P63) (איור 4F; טבלה 2).
איור 1: טיפוח אפידרמוספרות NHKc בהשעיה תלת-ממדית. (א) ייצוג סכמטי של האפידרמיס ספירואיד ציפוי מחדש. (B) תמונות ניגודיות שלב מייצגות של תרביות NHKc, כדורי אפידרמיס ו- SD-NHKc בכל שלב רציף של האפידרמיס ספרואיד ציפוי מחדש. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הערכת צמיחת האפידרמוספרה של העור. (A) תמונות של שישה זנים בודדים של כדורית שאינה נוצרת ו-(B) יוצרי כדורי NHKc במתלים תלת-ממדיים צפים. (C) אפידרמוספרות שהושגו באמצעות כמויות שונות של NHKc. (D) כימות של גודל אפידרמוספרה ממוצע המתקבל באמצעות כמויות שונות של NHKc בתרבות השעיה 3D צף. פסים מציינים סטיית תקן. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: גידול תרבויות שמקורן בספירואיד. (A) הדמיה של ניגודיות שלבים של תרביות מונו-שכבתיות SD-NHKc המתפשטות מאפידרמוספרה מצורפת 24 שעות, (B) 48 שעות, (C) 72 שעות, ו- (D) 96 שעות לאחר ציפוי מחדש בתרבית הפלסטיק 2D. (ה) תרביות SD-NHKc ב-80% השפעה ו-(ו) 100% השפעה 15 ו-20 יום לאחר תגמול בתרבית הפלסטיק דו-ממד, בהתאמה. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4: אפיון אוכלוסיות משנה שמקורן בספירואידים (SD). (א) ייצוג סכמטי של תא תלת מימד מעקב אחר תוחם של אפידרמוספרות במבחנה כפי שתואר על ידי Woappi ואח '202012. (B) אפידרמוספרות מבטאות EGFP 2 שעות ו-(C) 24 שעות לאחר זריעה בתרבות תלת-ממדית. (ד) מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS) של אוכלוסין SD-NHKc. כ 1/4th מכל התאים צריך להיות integrinα6היי/ EGFRlo. (E) Integrinα6hi/EGFRlo subpopulations לייצר keratinocyte holoclones. (ו) ניתוח כתמים אימונופלואורסצנטי של ביטוי סמן תאי גזע אפיתל בזאלי באינטגרינו6היי/ EGFRlo תאים. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| רצף פריימר (5'-3') | ||
| שם גן | פריימר קדמי | פריימר הפוך |
| ALDH1 | GCACGCCAGACTTACCTGTC | CCTCCTCAGTTGCAGGATTAAAG |
| EGFR | אגקאגאגטהאקאקאק | אטגאגאקטאקאקאקאקאק |
| GAPDH | GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT | GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG |
| K14 | TGAGCCGCATTCTGAACGAG | GATGACTGCGATCCAGAGGA |
| KI-67 | ACGCCTGGTTACTATCAAAAGG | CAGACCCATTTACTTGTGTTGGA |
| KLF4 | CCCACATGAAGCGACTTCCC | CAGGTCCAGGAGATCGTTGAA |
| TP63 | GGACCAGCAGATTCACACACAACGG | AGGACACGTCGAAACTGTGC |
| β-אקטין | CATGTACGTTGCTATCCAGGC | CTCCTTAATGTCACGCACGAT |
| ΔN TP63 | ATGTTGTACCTGGAAAACAATGCC | קאגקטאגקטאקאטאק |
טבלה 1. מתאר רצפי פריימר PCR המשמשים לגילוי גנים נבחרים המעורבים בפלסטיות קרטינוציטים יילודים.
| מצב תרבות | מראה ניגודיות פאזה | חיסון | ניתוח FACS | חתימה תמלולית | |
| תחזוקה הומיאוסטטית | מפולת מונו-שכבתית 2D | תאים קטנים בגודל < 30 מיקרומטר | K14, P63 | ITGα6med/EGFPmed | תחזוקה אפידרמלית (K14, P63, IVL, K10) |
| עצירת בידול/היפוך | כדורי תלת-ממדי | צבירה רב-תאית קומפקטית > 50 מיקרומטר | K14 , P63 , קי-67 | N/A | דה-בידול: NANOG, SOX2, OCT4, KLF4, K14, P63, Ki-67 |
| ניידות שושלת מתח | קובץ מצורף כדורי תלת-ממדי עד שני | פיזור תאים קטנים (< 20 מיקרומטר) מקצה כדורי | K14 , P63 , קי-67 | ITGα6hi/EGFPmed | התפשטות תאי עור: K14, K16, K17, Ki-67 |
| שחזור רקמות | מנולא כדורי תלת-ממדי עד 2D | הפצת תאים קטנים < 20 מיקרומטר | K14, P63, IVL | ITGα6hi/EGFPlo ו- ITGα6hi/EGFPhi | היווצרות אפידרמיס: K14, IVL, FLG |
טבלה 2. אסטרטגיות לאפיון פנוטיפי ומולקולרי של האפידרמיס ספרואיד נישם מחדש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השימוש במערכות תרבית כדורית תלת-ממדית היה בעל תועלת רחבה בהערכת גזע התאים. מערכות אלה הוכחו כדי לשפר את העשרה של תאי גזערקמה 13, עדיין התועלת שלהם לחקר תאי גזע אפידרמיס אנושי נחקרה באופן מוגבל. כאן, אנו מתארים אסטרטגיה להעשרת תאי גזע קרטינוציטים אנושיים בטכניקות תרבית תלת-ממדית. במערכת זו, NHKc מעובדים כמו מתלים כדוריים רב תאיים הרכבה עצמית, המורכבים כמה תת סוגים קרטינוציטים תלויים על גבי מיטות אגרוז המכיל KSFM-ס"מ. ההתקנה של פרוטוקול זה היא זמן רגיש כמו אגר פילמור במהירות בטמפרטורת החדר. התחממות מראש של צינורות סרולוגיים, טיפים מיקרופיפטים, ואת צינור ערבוב אגר / תאים, כמו גם את התקשורת ל 42 °C (70 °F), יכול להפחית באופן דרמטי פילמור מוקדם. ראינו כי הצבת צלחת 96-well ב 4 °C זמן קצר לאחר הוספת תערובת אגר / מדיה לבארות יכול להאיץ במידה ניכרת פילמור ולהבטיח כי כרית אגר הוא מוצק מספיק עבור זריעה הבאה של תאים. חשוב לשמור על הצלחת) ברמה בכל עת במהלך תהליך הפילמור, כמו פילמור לקוי של תערובת אגר / מדיה יגרום תאים זורעים או גדל בתוך אגר רך, ביטול ההסתה.
כמו כן, המתואר בפרוטוקול זה, אנו מציגים אסטרטגיה להפצת אפידרמוספרות בתרבות חד שכבתית דו-שכבתית כדי ליצור תאים שמקורם בספירואיד דמוי גזע. האפידרמיס כדורי ציפוי מחדש assay מעשיר עבור תת-אכלוס דמוי תא גזע של integrinα6היי/ EGFRlo keratinocytes. תאים אלה יכולים לשמש כדי ללמוד שחזור אפידרמיס, פסוריאזיס, או neoplasia הסלולר11,12,14. Integrinα6hi/ EGFRlo keratinocytes יכול גם להיות מבודד בקלות על ידי FACS ומאופיין על ידי כתמים immunofluorescent. בעת ביצוע ניסויים כאלה, מצאנו את זה מועיל להשתמש בתאי monolayer אוטולוגיים לא ממוינים כמו פקדים., קווי תא SCC העור הם חלופה טובה אם אלה אינם זמינים.
לסיכום, דו"ח זה מדגים כי ציפוי מחדש אפידרמלי אנושי מודלים פלסטיות רגנרטיבית קרטינוציט במבחנה, כפי שהוא לוכד כל אחד מארבעת השלבים של התחדשות: תחזוקה הומיאוסטטית, היפוך בידול, ניידות שושלת הלחץ, ושיקום רקמות. עם זאת, מגבלה אחת של הרכבה עצמית כדורית מבוססת אגר היא שלא כל כתמי NHKc מסוגלים ליצור באופן ספונטני כדורי. שיטת טיפהתלויה 15 היא אסטרטגיה חלופית טובה כדי להתגבר על אתגר זה ולאלץ לגרום היווצרות כדורית רב תאית. בדיקה זו יכולה גם להיות מולטיפלקס עם שרירים, סטרומלי, או תאי מערכת החיסון כדי לקבל תובנה נוספת על התרומה של אוכלוסיות תאים שונות על התחדשות אפידרמיס. זה יהיה מעניין לחקור אם חיבור מטריגל לאגר יכול לשפר את ההישרדות והעוצמה של האפידרמוספרה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין קשרים כספיים לחשוף.
Acknowledgments
בית הספר לרפואה UofSC מתקן משאבים מכשור (IRF) סיפק גישה ציוד הדמיה ומיון תאים וסיוע טכני. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענק 1R21CA201853. ה- MCF וה- IRF מקבלים תמיכה חלקית ממענק NIH P20GM103499, SC INBRE. ה- MCF מקבל גם תמיכה ממענק NIH P20GM109091. איבון וופי נתמך בחלקו על ידי מענקי NIH 2R25GM066526-06A1 (PREP) ו- R25GM076277 (IMSD), ועל ידי מלגה על ידי גרייס ג'ורדן מקפאדן פרופסורים תוכנית UofSC. ג'רלדין אזקה וג'סטין Vercellino נתמכו על ידי מענקי NIH 2R25GM0666526-10A1 (PREP) ב UofSC. שון מ. בלוס נתמך על ידי פרס מגלן מלומד לשנת 2016 באוניברסיטת UofSC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Affymetrix platform | Affymetrix | For microarray experiments | |
| Affymetrix’s HuGene-2_0-st library file | Affymetrix | Process | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | For microarray experiments | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | Used for RNA isolation |
| Analysis Console Software version 3.0.0.466 | analyze cell type specific transcriptional responses using one-way between-subject analysis of variance | ||
| BD FACSAria II flow cytometer | Beckman | For flow cytometry | |
| Console Software version 3.0.0.466/Expression console Software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| Cytokeratin 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | 1:200 dilution |
| Dispase | Sigma-Aldrich | D4818 | For cell media |
| FITC-conjugated anti-integrinα6 | Abcam | ab30496 | For FACS analysis |
| GeneChip Command Console 4.0 software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| GeneChip Fluidics Stations 450 (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific) | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip HuGene 2.0 ST Arrays | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | |
| GeneChip Hybridization Oven 640 | Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | Amplify labeled samples | |
| GeneChip Hybridization Wash, and Stain Kit (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific). | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip Scanner 3000 7G system | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | Scanning hybridized arrays | |
| GeneChip WT PLUS Reagent Kit | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For amplifycation of biotinylating total RNA | |
| Human Basic Fibroblast Growth Factor (hFGF basic/FGF2) | Cell Signaling Technology | 8910 | For cell media |
| Human Epidermal Growth Factor (hEGF) | Cell Signaling Technology | 8916 | For cell media |
| Human Insulin | Millipore Sigma | 9011-M | For cell media |
| iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) | Bio-Rad | 1708880 | Used for RT-qPCR |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | Used for RT-qPCR |
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005041 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| KSFM-scm | ThermoFisher Scientific | 17005042 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| MCDB 153-LB basal medium | Sigma-Aldrich | M7403 | MCDB 153-LB basal media w/ HEPES buffer |
| NEST Scientific 1-Well Cell Culture Chamber Slide, BLACK Walls on Glass Slide, 6/PK, 12/CS | Stellar Scientific | NST230111 | For immunostaining |
| P63 | Thermo Scientific | 703809 | 1:200 dilution |
| PE-conjugated anti-EGFR ( San Jose, CA; catalog number ) | BD Pharmingen | 555997 | For FACS analysis |
| pMSCV-IRES-EGFP plasmid vector | Addgene | 20672 | For transfection |
| Promega TransFast kit | Promega | E2431 | For transfection |
| Qiagen RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | For microarray experiments | |
| Thermo Scientific™ Sterile Single Use Vacuum Filter Units | Thermo Scientific | 09-740-63D | For cell media |
| Zeiss Axionvert 135 fluorescence microscope | Zeiss | Use with Axiovision Rel. 4.5 software |
References
- Patel, G. K., Wilson, C. H., Harding, K. G., Finlay, A. Y., Bowden, P. E. Numerous keratinocyte subtypes involved in wound re-epithelialization. Journal of Investigative Dermatology. 126 (2), 497-502 (2006).
- Dekoninck, S., Blanpain, C. Stem cell dynamics, migration and plasticity during wound healing. Nature Cell Biology. 21 (1), 18-24 (2019).
- Byrd, K. M., et al. Heterogeneity within Stratified Epithelial Stem Cell Populations Maintains the Oral Mucosa in Response to Physiological Stress. Cell Stem Cell. , (2019).
- Rothbauer, M., Rosser, J. M., Zirath, H., Ertl, P. Tomorrow today: organ-on-a-chip advances towards clinically relevant pharmaceutical and medical in vitro models. Current Opinion in Biotechnology. 55, 81-86 (2019).
- Kim, S. J., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. Engineering Multi-Cellular Spheroids for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Advanced Healthcare Materials. , 2000608 (2020).
- Lee, J., et al. Hair-bearing human skin generated entirely from pluripotent stem cells. Nature. 582 (7812), 399-404 (2020).
- Zhang, Q., et al. Early-stage bilayer tissue-engineered skin substitute formed by adult skin progenitor cells produces an improved skin structure in vivo. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 407 (2020).
- Borena, B. M., et al. Sphere-forming capacity as an enrichment strategy for epithelial-like stem cells from equine skin. Cellular Physiology and Biochemistry. 34 (4), 1291-1303 (2014).
- Vollmers, A., et al. Two- and three-dimensional culture of keratinocyte stem and precursor cells derived from primary murine epidermal cultures. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (2), 402-413 (2012).
- Kang, B. M., Kwack, M. H., Kim, M. K., Kim, J. C., Sung, Y. K. Sphere formation increases the ability of cultured human dermal papilla cells to induce hair follicles from mouse epidermal cells in a reconstitution assay. Journal of Investigative Dermatology. 132 (1), 237-239 (2012).
- Woappi, Y., Hosseinipour, M., Creek, K. E., Pirisi, L. Stem Cell Properties of Normal Human Keratinocytes Determine Transformation Responses to Human Papillomavirus 16 DNA. Journal of Virology. 92 (11), (2018).
- Woappi, Y., Altomare, D., Creek, K., Pirisi, L. Self-assembling 3D spheroid cultures of human neonatal keratinocytes have enhanced regenerative properties. Stem Cell Research. , (2020).
- Toma, J. G., McKenzie, I. A., Bagli, D., Miller, F. D. Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin. Stem Cells. 23 (6), 727-737 (2005).
- Li, F., et al. Loss of the Epigenetic Mark 5-hmC in Psoriasis: Implications for Epidermal Stem Cell Dysregulation. Journal of Investigative Dermatology. , (2020).
- Kuo, C. T., et al. Three-dimensional spheroid culture targeting versatile tissue bioassays using a PDMS-based hanging drop array. Scientific Reports. , (2017).
- Woappi, Y., Ezeka, G., Vercellino, J., Bloos, S. M., Creek, K. E., Pirisi, L. GSE94244 - Expression data from normal human spheroid-forming keratinocytes in monolayer mass culture and from corresponding cornified-like spheroid ring structures. Gene Expression Omnibus (GEO). , (2020).
