Summary
Здесь мы описываем протокол систематического культивирования эпидермальных сфероидов в 3D суспензии культуры. Этот протокол имеет широкий спектр применений для использования в различных типах эпителиальных тканей и для моделирования нескольких заболеваний и состояний человека.
Abstract
Дисрегуляция эпителия является узлом для различных состояний и заболеваний человека, включая хронические раны, воспаление и более 80% всех видов рака человека. Как подкладочная ткань, эпителий кожи часто подвергается повреждению и эволюционно адаптируется, приобретая клеточную пластичность, необходимую для восстановления поврежденной ткани. На протяжении многих лет было предпринято несколько усилий по изучению эпителиальной пластичности с использованием моделей на основе клеток in vitro и ex vivo. Однако эти усилия были ограничены в их способности рекапитулировать различные фазы пластичности эпителиальных клеток. Здесь мы описываем протокол для генерации 3D-эпидермальных сфероидов и эпидермальных сфероидных клеток из первичных неонатальных кератиноцитов человека. Этот протокол описывает способность эпидермальных сфероидных культур функционально моделировать различные стадии генеративной пластичности кератиноцитов и демонстрирует, что эпидермальное сфероидное повторное покрытие может обогащать гетерогенные культуры нормальных кератиноцитов человека (NHKc) для интегринα6hi/ EGFRlo кератиноцитарных субпопуляций с улучшенными стволовыми характеристиками. В нашем отчете описывается разработка и поддержание высокопроизводительной системы для исследования пластичности кератиноцитов кожи и регенерации эпидермиса.
Introduction
Стратифицированный эпителий млекопитающих является наиболее сложной эпителиальной архитектурой во всех живых системах и чаще всего подвержен повреждениям и травмам. Как защитная ткань, стратифицированный эпителий эволюционировал, чтобы генерировать сложную и эффективную реакцию на повреждение тканей. При травме эти клетки должны активировать программы пластичности линии, которые позволяют им мигрировать в поврежденный участок и проводить ремонт1,2,3. Эта многогранная реакция происходит в несколько последовательных шагов, которые остаются плохо изученными.
Основное препятствие в изучении сложного процесса регенерации эпителия заключается в нехватке высокопроизводительных модельных систем, которые могут захватывать динамическую клеточную активность на определенных этапах регенерации клеток. В то время как мышиные модели in vivo предлагают соответствующее понимание заживления ран и наиболее точно повторяют регенеративный процесс человека, их разработка требует трудоемких усилий и значительных затрат, ограничивая их пропускную способность. Поэтому существует острая необходимость в создании систем, позволяющих проводить функциональное исследование регенерации эпителиальной ткани человека в масштабе высокой пропускной способности.
В последние годы было предпринято несколько попыток решить проблему масштабируемости. Это видно через значительное расширение инновационных моделей на основе клеток in vitro и ex vivo, которые близко имитируют регенеративный контекст in vivo. Это включает в себя достижения в области органа на чипе4,сфероида5,органоида6и органотипических культур7. Каждая из этих 3D-систем на основе ячеек предлагает уникальные преимущества и представляет собой явные экспериментальные ограничения. На сегодняшний день сфероидная культура остается наиболее экономически эффективной и широко используемой моделью 3D-культуры клеток. И хотя в нескольких отчетах указывалось, что сфероидные культуры могут быть использованы для изучения характеристик стволовых клеток кожи, эти исследования в основном проводились с тканями животных8,9или с дермальными фибробластами10,практически без отчетов, полностью характеризующих регенеративные свойства эпидермальных сфероидных культур человека. В этом протоколе мы подробно описываем функциональное развитие, культуру и поддержание эпидермальных сфероидных культур из нормальных кератиноцитов человека (NHKc). Мы также описываем полезность этой системы для моделирования последовательных фаз регенерации эпидермиса и пластичности стволовых клеток кератиноцитов in vitro.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол сбора и обработки образцов кожи и выделения кератиноцитов человека был пересмотрен IRB Университета Южной Каролины (UofSC) и классифицирован как «исследование, не связанное с человеческими субъектами», поскольку образцы конечной плоти были хирургическими выбросами, полученными во время обычных хирургических процедур (обрезание новорожденных мальчиков), и были полностью лишены идентифицирующей информации. Протокол также рассматривался и утверждался Комитетом по биобезопасности UofSC на регулярной основе, и весь лабораторный персонал прошел лабораторную подготовку по биобезопасности. Все процедуры проводились в соответствии со стандартами безопасности и этики УОФСК.
1. Выделение и культивирование кератиноцитов человека из ткани неонатальной ткани конечной плоти
- Подготовьте промывочную среду, добавив 0,1 M HEPES буфера к 500 мл среды KSFM и отрегулируйте его до рН 7,2. Стерилизуйте среду в вакуумном фильтре объемом 500 мл (размер пор 0,22 мкм). Базальная среда MCDB 153-LB также может быть использована в качестве альтернативного моющего раствора вместо KSFM.
- В ламинарной проточной вытяжке промыть неонатальную плоть 5 мл моющих средств в конической трубке 50 мл. Повторите дважды.
- Переложите промытую крайню в стерильную чашку Петри. С помощью скальпеля и щипцов соскоблите жировую и рыхлую соединительную ткань с дермального слоя. Промыть плоть 5 мл промывочной среды в конической трубке 50 мл.
- Поместите эпидермис конечной плоти стороной вверх в 6-ямочную пластину, содержащую 2 мл фермента диспазы, разведенного в промывочной среде (50 Ед/мл).
- Переложите плиту в инкубатор на 4 часа (37 °C, 5% CO2,95% влажности).
- Удалите крайнюю плоть из инкубатора и в стерильных условиях перенесите ее в чашку Петри. С помощью тонких щипцов отделите эпидермис от слоя дермы.
- Поместите эпидермис в коническую трубку 15 мл, содержащую 2 мл 0,25% трипсина-ЭДТА. Используя серологическую пипетку 5 мл, механически раздавите плавающий эпидермис. Инкубировать в течение 15 мин при 37 °C с периодическим вихрем в течение 5 с каждые 5 мин.
- После инкубации добавляют 2 мл ингибитора трипсина сои и смешивают путем пипетирования для нейтрализации трипсина.
- Центрифужная клеточная суспензия в течение 2 мин при 450 х г,а затем в течение 8 мин при 250 х г.
- Удаляйте плавающий мусор щипцами, стараясь не выбить ячейку гранулы. Осторожно аспирировать супернатант из ячейки гранулы.
- Повторное суспендирование гранул в 12 мл полной среды KSFM-scm и тарелка в 10-сантиметровой посуде. Инкубировать блюдо на ночь (37 °C, 5% CO2,95% влажность).
- На следующий день удалите среду с помощью аспирирующей пипетки и замените 12 мл полной KSFM-scm. Повторите на 4 и 7 день.
- Чтобы поддерживать оптимальный рост нормальных культур кератиноцитов человека (NHKc), проходим клетки 1:5 на 10-й день, чтобы предотвратить достижение клетками более 80% конфлюции.
2. Формирование культур эпидермосферы кожи in vitro
- Приготовьте 5% смесь агарозы, добавив 2,5 г агарозы в 50 мл 1x фосфатного буферного физиологического раствора (PBS) в стеклянной бутылке емкостью 50 мл. Автоклавная бутылка в жидком цикле. Дайте остыть до комнатной температуры.
- Для приготовления тарелок поместите охлажденную стеклянную бутылку, содержащую раствор агарозы, в пластиковый стакан объемом 1 л, наполненный деионизированной водой объемом 200 мл (dH2O). Расплавляйте смесь агарозы в микроволновой печи исследовательского класса в течение 2 минут, перемешивая агар каждые 60 с, осторожно наклоняя бутылку из стороны в сторону.
ВНИМАНИЕ: Плавление агара в микроволновой печи приведет к тому, что контейнер для колбы станет чрезвычайно горячим, что приведет к увеличению давления. Давление высвобождения нарастает каждые 30 с. Носите соответствующие защитные средства для предотвращения травм. - Добавьте 3 мл расплавленной 5% агарозы к 12 мл KSFM-scm предварительно расплавленного до 42 °C для конечной концентрации 1% агарозы (масс./об.).
Дополнительно: предварительно разогрейте серологические пипетки и наконечники пипеток, чтобы предотвратить преждевременную полимеризацию мягкого агара. - Быстро пипетку 200 мкл 1% агара смешивают в отдельные скважины из 96-скважинной круглодонной плиты с помощью многоканального пипетка(рисунок 1А). Оставьте пластину в стерильной среде при 25 °C в течение 4 ч, чтобы агароза полностью полимеризовала.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эксперименты могут быть остановлены здесь и продолжены на следующий день. Полимеризованные агарозные пластины могут поддерживаться при 37 °C до 24 ч или при 4 °C в течение 48 ч при герметизации парапленочной пленкой. Нагревают пластину до 37 °С в увлажненный инкубатор не менее 1 ч перед применением. - Прохождение сфероидообразующих NHKc путем аспирации среды и промывки клеток в 2 мл PBS. Аспирировать PBS и добавить 2 мл 0,25% трипсина-ЭДТА в промытые клетки. Инкубировать в течение 5 мин при 37 °C или до полного отсоединения всех клеток. Добавьте 2 мл ингибитора трипсина сои в пластину и смойте клетки с пластины в трубку с 15 мл. Центрифуга при 250 х г в течение 5 мин.
- Повторное суспендирование гранул в 1 мл PBS. Количественно оцените жизнеспособность клеток с помощью окрашивания трипановым синим цветом и гемоцитометра или автоматизированного счетчика клеток.
- Аликвота 2 х 104 NHKc в 100 мкл KSFM-scm и засеять в отдельные скважины из предварительно подготовленной 96-скважинной круглодонной плиты. Инкубационная плита на ночь (37 °C, 5% CO2,95% влажность).
- Используя инвертированный фазовый контрастный микроскоп, хорошо проанализируйте посев на формирование эпидермосферы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эпидермосферы человека из нормальных кератиноцитов человека могут оставаться жизнеспособными в культуре 3D-суспензии до 96 ч, хотя и со значительным снижением жизнеспособности клеток(рисунок 2).
3. Эпидермальный сфероидный анализ
- Через 24-48 ч после формирования 3D эпидермосферы добавить 4 мл предварительно распохленного KSFM-scm в тарелку 6 см. Используйте широкий наконечник пипетки 1 мл для переноса одного сфероида на пластину, гарантируя, что она не разобьется. В качестве альтернативы, расширьте наконечник пипетки 1 мл, используя стерильное лезвие бритвы, чтобы разрезать наконечник.
- Инкубировать плиту в течение ночи (37 °C, 5% CO2,95% влажности).
- Проанализируйте семенной сфероид для прикрепления к нижней части пластины и наблюдайте за размножением клеток с помощью инвертированного фазового контрастного микроскопа(рисунок 3). Подавая ячейки каждые 96 ч, осторожно удаляя 2 мл среды внутри пластины и медленно добавляя 2 мл свежей среды KSFM-scm в пластину.
- Прохождение сфероидного происхождения (SD) NHKc, как только они достигают 70-80% слияния и продолжают с анализом по выбору. Часто контролируйте SD-NHKc, чтобы предотвратить достижение клетками полного слияния в культуре, поскольку это приводит к преждевременной дифференцировке и остановке роста клеток(рисунок 3E-F).
- Эпидермальный сфероидный анализ моделирует кератиноцитарно-опосредованное восстановление раны путем захвата каждой из ключевых последовательных фаз регенеративной пластичности эпидермиса: а) гомеостатическое поддержание, б) дифференцировка остановки/обращения в) подвижность линии стресса и г) восстановление тканей(рисунок 1B); Таблица 2). Этот анализ также может быть использован для получения клеточных популяций для оловоорганических культур плотов или для моделирования ВПЧ-опосредопосредооченной неоплазии, как показано в нашей предыдущей работе 11,12.
4.3D флуоресцентные клетки отслеживания
- В 6-сантиметровой чашке трансфектируют сфероидообразующие 2D монослойные культуры NHKc с 1 мкг плазмидного вектора pMSCV-IRES-EGFP, несущего ген усиленного зеленого флуоресцентного белка (eGFP). Инкубировать пластинчатый на ночь (37 °C, 5% CO2,95% влажности) микроскоп(рисунок 4A).
ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы трансфекция была завершена в условиях, не емких антибиотиков. - Не удаляя трансфекционную смесь, добавьте в ячейки 2 мл предварительно выгремленного KSFM-scm. Инкубационная плита на ночь (37 °C, 5% CO2,95% влажность).
- Аспирировать все трансфекционные среды из пластинчатых и питательных клеток 3 мл предварительно располагаемого KSFM-scm. Оцените наличие EGFP-экспрессирующих клеток под каналом FITC флуоресцентного микроскопа.
- Прохождение и посев 2 х 104 EGFP-трансфехтированных клеток в отдельные колодцы из предварительно подготовленной 96-скважинной круглодонной пластины. Инкубационная плита на ночь (37 °C, 5% CO2,95% влажность). Визуализация и мониторинг движения сфероидных клеток EGFP под каналом FITC флуоресцентного микроскопа(рисунок 4B-C).
- Через 24 ч после нанесения покрытия добавьте 3 мл предварительно распаленного KSFM-scm в блюдо 6 см. Используйте широкий наконечник пипетки 1 мл для переноса одного сфероида на пластину, гарантируя, что она не разобьется. Инкубационная плита на ночь (37 °C, 5% CO2,95% влажность).
- Наблюдение и анализ распространения SD-NHKcEGFP с помощью флуоресцентного микроскопа. Подавая ячейки каждые 96 ч, осторожно удаляя 2 мл носителя внутри пластины и медленно добавляя 2 мл свежей среды KSFM-scm на пластину.
- Сбор урожая SD-NHKCEGFP для изоляции FACS или анализов по выбору.
5. Характеристика субпуллей, полученных из сфероидов (SD) с помощью FACS
- Прохождение SD-NHKc и соответствующих аутологичных 2D монослойных культур путем аспирации старых сред и промывки клеток в 2 мл PBS. Удалите PBS и добавьте 2 мл 0,25% трипсина-ЭДТА в промытые клетки. Инкубировать при 37 °C в течение 5 мин или до полного отсоединения всех клеток.
- Добавьте 2 мл ингибитора трипсина сои к пластине и перенесите клетки в трубку с 15 мл. Центрифуга при 250 х г в течение 5 мин.
- Повторное суспендирование гранул в 1 мл PBS. Количественно оцените жизнеспособность клеток с помощью трипан-синего и автоматизированного счетчика клеток гемоцитометра.
- Аликвот 100 мкл, содержащий 0,1-4 х10 6 nhKc клеток до 1,5 мл микроцентрифужных пробирок. Поместите трубку на лед в темной среде, созданной путем выключения яркого света внутри ламинарного капота.
- Добавьте 2 мкл FITC-конъюгированного анти-интегринаα6 и 2 мкл PE-конъюгированного анти-EGFR в пробирки для достижения разведения 1:50. Подготовьте трубку без добавления антител, чтобы служить в качестве незапятнанный контроль. Инкубировать трубки на льду в темное время суток или при 4 °C в течение 30 мин. Использование бусин или линии SCC кожи может служить положительным контролем, так как клетки SCC кожи экспрессировали повышенные уровни интегринаα6 и EGFR.
- Выполните анализ проточной цитометрии с использованием проточного цитометра по выбору, содержащего соответствующие лазеры.
- Используйте отрицательные и позитивные элементы управления для установления ворот. Сортировка субпопуляции integrinα6hi/EGFRlo cells; это фракция эпидермальных стволовых клеток. Integrinα6hi/ EGFRhi клетки являются пролиферативной фракцией клеток-прородиторов. Интегринα6lo/EGFRhi клетки являются зафиксированной фракцией клеток-прародителя(рисунок 4D). Сортировочная трубка (трубы) FACS должна содержать не менее 1 мл ледяного KSFM-scm.
- Тест на пролиферативную способность отсортированных клеточных субпопуляций путем переноса содержимого каждой соответствующей сортировочной трубки в коническую трубку объемом 15 мл, содержащую в 10 раз больше объема отсортированных клеток в PBS. ПРИМЕЧАНИЕ: Важно удалить все клетки, прикрепленные к ободу, путем пипетки стенки сортировочной трубки (трубок) FACS несколько раз, так как кератиноциты часто могут прилипать туда.
- Центрифуга 15 мл в тубах по 250 х г в течение 5 мин. Удалите супернатант и повторно суспендировать гранулы в 12 мл KSFM-scm. Переложите повторно суспендированные ячейки в пластину размером 6 см и инкубируем в течение ночи (37 °C, 5% CO2,95% влажности).
- На следующий день удалите жижи в пластины и добавьте 8 мл предварительно подогретого KSFM-scm. Инкубировать при 37 °C, 5% CO2,95% влажности. Повторно подавать клетки со средой 12 мл каждые 3 дня до 70-80% слияния(рисунок 4Е).
6. Иммунофлуоресценция и окрашивание эпидермосфер маркерами базальных стволовых клеток
- Перенесите эпидермосферы на покровные листы, покрытые полилизином. Позвольте SD-NHKc распространяться до 75% слияния.
- Промывайте ячейки дважды в PBS (4 °C) в течение 5 мин каждая.
- Фиксируйте клетки 4% параформальдегидом (PFA) в течение 20 мин при комнатной температуре.
- Пермеабилизируют клетки с 0,5% тритона X-100 в 1% глицина. Блокируйте с использованием 0,5% BSA и 5% козьей сыворотки в течение 30 мин при комнатной температуре.
- Инкубировать образцы с антителами против Р63 (1:200) и цитокератина 14 (1:200) в блокирующем растворе на ночь при 4 °С.
- Трижды промыть PBS (4 °C), содержащим Tween 20 (PBST), с последующим инкубацией с FITC- и Alexa 568-конъюгированных вторичных антител (разведение 1:1000).
- Окрашивание ядер 4', 6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) (разведение 1:5000) перед установкой клеток.
- Наблюдайте за клетками с помощью флуоресцентного микроскопа с лазерными линиями FITC и PE(рисунок 4F).
7. Транскрипционный анализ культур эпидермосферы
- Установка тройных пластин низкопролетных культур NHKc для выделения РНК может быть из монослойных, сфероидных и сфероидных культур из одной и той же аутологиозной клеточной линии.
- Пул 3-5 соответствующих эпидермосфер в 1,5 мл микроцентрифужной трубки. Отдельно собирают автологичные SD-NHKc и 2D монослойные культуры.
- Изолируйте общую РНК из всех трех групп.
- Выполняют обратную транскрипцию с 1 мкг общей РНК.
- Используя кДНК, выполняют ПЦР в режиме реального времени, используя GAPDH в качестве внутреннего контроля(табл. 1).
- Проверить размер продукта ампликона электрофорезом агарозного геля (2% v/v).
ПРИМЕЧАНИЕ: Для транскриптомного профилирования культур эпидермосферы с использованием анализа микрочипов всего генома изолируйте общую РНК из массовых культур одного донора NHKc и соответствующих SD-NHKc от одного и того же донора в шести репликах каждая. - Оцените качество РНК с помощью биоанализатора для достижения показателей целостности РНК (RIN) в диапазоне от не менее 9,0 до 9,1.
- Проводите эксперименты с микрочипами путем амплификации и биотинилирования общих образцов РНК.
- Обратная транскрибирование 100 нг общей РНК на образец в ds-кДНК с использованием случайных праймеров NNN, содержащих последовательность промотора полимеразы РНК T7.
- Добавьте РНК-полимеразу T7 в образцы кДНК для амплиации РНК, а затем скопируйте РНК в ss-кДНК. Разлагать избыток РНК с помощью РНКазы Н.
- Фрагмент молекулы сцДНК и метка с биотином.
- Усиливать маркированные образцы в течение 16 ч при 45 °C.
- Гибридизируйте образцы с помощью гибридной печи и комплекта для стирки и окрашивания.
- Мойка и окрашивание гибридизированных массивов.
- Сканирование массивов с помощью системы и рабочей станции компьютера.
- После завершения сканирования массива импортируйте файлы интенсивности зондовых клеток (CEL) в консольное программное обеспечение экспрессии и обрабатывайте на уровне генов файл с использованием библиотечного файла и алгоритма Robust Multichip Analysis (RMA) для создания файлов CHP.
- После подтверждения качества данных в Expression Console импортируйте файлы CHP, содержащие сигналы экспрессии log2 для каждого зонда, в программное обеспечение для анализа транскриптома для анализа специфических для типа клеток транскрипционных ответов с использованием одностороннего анализа дисперсии между субъектами.
8. Оценка колониеобразующей эффективности SD-NHKc
- Аспиратные среды из пластин, когда клетки достигают 70-80% слияния. Промывайте ячейки три раза в PBS (4 °C) в течение 5 мин каждая.
- Зафиксируйте клетки 3 мл 100% метанола (4 °C) в течение 15 мин. Трижды вымыть в PBS по 5 мин каждый.
- Окрашивание клеток в 3 мл 10% Гимса в течение 30 мин. Трижды вымыть в PBS по 5 мин каждый. Дайте клеткам высохнуть на воздухе в течение ночи.
- Анализ формирования колоний на следующий день и количественная оценка количества полученных колоний
9. Определение удвоения популяции SD-NHKc
- Прохождение SD-NHKc и соответствующих аутологичных 2D монослойных культур путем аспирации старых сред и промывки клеток в 2мл PBS. Удалите PBS и добавьте 2 мл 0,25% трипсина-ЭДТА в промытые клетки. Инкубировать в течение 5 мин или до полного отсоединения всех ячеек (37 °C, 5% CO2,влажность 95%).
- Добавьте 2 мл ингибитора трипсина сои к пластине и перенесите клетки в трубку с 15 мл.
- Центрифуга при 250 х г в течение 5 мин.
- Удалить супернатант и повторно суспендировали гранулы в 12 мл KSFM-scm.
- Семенные ячейки при низкой плотности 1-2 х10 4 NHKc в отдельные 10 см блюда и инкубируют в течение ночи (37 °C, 5% CO2,95% влажности).
- Кормовые пластины с 8 мл KSMF-scm на следующий день. Кормят каждые 4 дня до 25% впадие, затем кормят каждые 2 дня.
- Последовательно проходит клетки 1:5 в 60 см посуде до тех пор, пока пролиферативная способность клеток не будет исчерпана. Количественная оценка жизнеспособности клеток путем окрашивания трипан-синим цветом. Определите удвоение популяции при каждом прохождении по формуле: log(N/N0) / log2, где N представляет общее число клеток, полученное при каждом прохождении, а N0 представляет количество клеток, покрытых в начале эксперимента.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Во время анализа эпидермосферы кожи культуры NHKc высевают в покрытые агарозой колодцы из 96-скважинной пластины(рисунок 1А). Сфероидообразующие клетки должны самоагрегироваться в течение 48 ч. Автономное образование сфероидов может быть оценено уже через 24 ч с помощью стандартного перевернутого фазоконтрастного микроскопа. формирование эпидермосферы кожи и анализ повторного покрытия моделируют различные фазы регенерации эпидермальной ткани(рисунок 1В). На рисунке 2 показаны изображения с высоким разрешением различных штаммов NHKc, анализируемых на способность эпидермального сферообразования в 3D-культуре. Важно исследовать клетки на плотную шарообразную агрегацию, так как это является отличительной чертой спонтанного сфероидного образования. Мы сочли необходимым использовать более 2 х 104 клеток для обеспечения правильной спонтанной агрегации. Несферическая агрегация клеток, как это видно на штаммах на рисунке 2А,не считается адекватным формированием эпидермосферы. Покрытие несфероидообразующих клеточных суспензий обратно в 2D-монослойную культуру редко приводит к жизнеспособным росту клеток NHKc. Однако покрытие эпидермосфер в 2D-культуре приводит к распространению малогабаритных жизнеспособных NHKc(рисунок 3). Изображения эпидермосфер и SD-NHKc можно просматривать и контролировать с помощью стандартного перевернутого фазоконтрастного микроскопа. Важно поддерживать эти культуры ниже 100% слияния, так как это может значительно изменить их рост и состояние стволовых клеток в культуре(рисунок 3E-F). Процесс образования эпидермального сфероида может быть функционально отслежен на уровне одной клетки путем трансфектирования клеток флуоресцентным репортером(рисунок 4A-C). В оптимальных условиях субпопуляция кератиноцитов, в первую очередь обогащенная культурами SD-NHKc, является Integrinα6hi/EGFRlo клетками. Эти клетки обычно составляют около 25% всех культур SD-NHKc и могут быть легко выделены FACS(рисунок 4D). Тем не менее, важно установить затворы прямой боковой зоны рассеяния (FSC-A) и боковой зоны рассеяния (SSC-A), чтобы исключить дублеты(рисунок 4D). Дальнейшая характеристика этой стеблеобразной кератиноцитарной субпопуляции может быть достигнута путем иммунофлуоресцентного окрашивания экспрессии маркеров эпидермальных стволовых клеток, таких как базальный цитокератин 14 (K14) и опухолевый белок 63 (P63)(фиг.4F; Таблица 2).
Рисунок 1:Культивирование эпидермосфер NHKc в 3D-суспензии. (A) Схематическое изображение эпидермального сфероидного анализа, адаптированного из 11. (B) Репрезентативные фазовые контрастные изображения культур NHKc, эпидермальных сфероидов и SD-NHKc на каждом последовательном этапе анализа эпидермального сфероидного повторного покрытия. Шкала = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2:Оценка роста эпидермосферы кожи. (A) Изображения шести отдельных сфероидных необразующих и (B) сферообразующих штаммов NHKc в плавающей 3D-суспензии. (C) Эпидермосферы, полученные с использованием различных количеств NHKc. (D) Количественная оценка среднего размера эпидермосферы, полученная с использованием различных количеств NHKc в плавающей 3D-культуре суспензии. Бары указывают на стандартное отклонение. Шкала = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3:Выращивание культур, полученных из сфероидов. (A) Фазово-контрастная визуализация однослойных культур SD-NHKc, распространяющихся из присоединенной эпидермосферы 24 ч, (В) 48 ч, (С) 72 ч и (D) 96 ч после повторного покрытия в 2D-пластиковую культуру. (E) культуры SD-NHKc при 80% слиянии и (F) 100% слиянии через 15 и 20 дней после повторного покрытия в 2D-пластиковую культуру, соответственно. Шкала = 100 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4:Характеристика субпудиций, полученных из сфероидов (SD). (A) Схематическое изображение 3D-анализа эпидермосфер in vitro, как описано Woappi et al. 202012. (B) EGFP-экспрессивные эпидермосферы через 2 ч и (С) 24 ч после посева в 3D культуру. (D) Флуоресцентно активированная сортировка клеток (FACS) субпопуляций SD-NHKc. Примерно 1/4-я часть всех клеток должна быть интегринфиномhi/EGFRlo. (E) Integrinα6hi/EGFRlo субпопуляции продуцируют кератиноцитарные голоклоны. (F) Иммунофлуоресцентный анализ окрашивания экспрессии маркеров базальных эпителиальных стволовых клеток в клетках Integrinα6hi/EGFRlo. Шкала = 50 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Последовательность праймеров (5'-3') | ||
| Название гена | Форвард Праймер | Обратная грунтовка |
| АЛДХ1 | GCACGCCAGACTTACCTGTC | CCTCCTCAGTTGCAGGATTAAAG |
| ЭГФР | AGGCACGAGTAACAAGCTCAC | АТГАГГАКАТААККАККК |
| ГАПДХ | GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT | GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG |
| К14 | TGAGCCGCATTCTGAACGAG | ГАТГАКТГКГАТАГАГГА |
| КИ-67 | ACGCCTGGTTACTATCAAAAGG | CAGACCCATTTACTTGTGTTGGA |
| КЛФ4 | CCCACATGAAGCGACTTCCC | CAGGTCCAGGAGATCGTTGAA |
| ТР63 | GGACCAGCAGATTCAGAACGG | АГГАКАКГТКГАААКГТГК |
| β-Актин | CATGTACGTTGCTATCCAGGC | CTCCTTAATGTCACGCACGAT |
| ΔN TP63 | ATGTTGTACCTGGAAAACAATGCC | КАГГКАТГГКАКГАТААК |
Таблица 1. Описываются последовательности праймеров ПЦР, используемые для обнаружения отдельных генов, участвующих в пластичности неонатальных кератиноцитов.
| Состояние культуры | Появление фазового контраста | Иммуноокрашивание | Анализ FACS | Транскриптомическая подпись | |
| Гомеостатическое обслуживание | 2D монослой | Ячейки малого размера < 30 мкм | К14, П63 | ITGα6med/EGFPmed | Эпидермальное обслуживание (K14, P63, IVL, K10) |
| Остановка/разворот дифференциации | 3D сфероид | Компактный многоклеточный агрегат > 50 мкм | К14, П63, Ки-67 | Н/Д | Дедифференциация: NANOG, SOX2, OCT4, KLF4, K14, P63, Ki-67 |
| Мобильность линии стресса | 3D-к-2D сфероидное крепление | Диффузия малогабаритных клеток (< 20 мкм) от сфероидного края | К14, П63, Ки-67 | ITGα6hi/EGFPmed | Пролиферация клеток кожи: K14, K16, K17, Ki-67 |
| Восстановление тканей | 3D-to-2D сфероид монослой | Распространение малогабаритных клеток < 20 мкм | К14, П63, ИВЛ | ITGα6hi/EGFPlo и ITGα6hi/EGFPhi | Образование эпидермиса: K14, IVL, FLG |
Таблица 2. Стратегии фенотипической и молекулярной характеристики эпидермального сфероидного анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Использование систем 3D-сфероидных культур имело широкую полезность при оценке стволовой анемии. Было продемонстрировано, что эти системы улучшают обогащение тканевых стволовых клеток13,но их полезность для изучения эпидермальных стволовых клеток человека была ограниченно изучена. Здесь мы описываем стратегию обогащения стволовых клеток кератиноцитов человека с использованием методов 3D-культивирования. В этой системе NHKc культивируются как самособирающиеся многоклеточные сфероидные суспензии, состоящие из нескольких подтипов кератиноцитов, подвешенных поверх агарозных пластов, содержащих KSFM-scm. Установка для этого протокола чувствительна ко времени, так как агар быстро полимеризуется при комнатной температуре. Предварительный нагрев серологических пипеток, наконечников микропипеток и трубки для смешивания агара / клеток, а также среды до 42 ° C может значительно уменьшить преждевременную полимеризацию. Мы заметили, что размещение 96-скважинной пластины при 4 °C вскоре после добавления смеси агара и среды в скважины может значительно ускорить полимеризацию и гарантировать, что агаровая подушка достаточно тверда для последующего посева клеток. Важно постоянно поддерживать уровень пластины) во время процесса полимеризации, так как плохая полимеризация смеси агар / среда приведет к посеву клеток или росту внутри мягкого агара, опустошая анализ.
Также в этом протоколе мы представляем стратегию распространения эпидермосфер в 2D-монослойной культуре для генерации стволовых сфероидных клеток. Эпидермальный сфероидный анализ обогащает для субпопуляции стволовых клеток интегринα6hi/ EGFRlo кератиноцитов. Эти клетки могут быть использованы для изучения эпидермальной реконструкции, псориаза или клеточной неоплазии11,12,14. Integrinα6hi/EGFRlo кератиноциты также могут быть легко выделены FACS и характеризуются иммунофлуоресцентным окрашиванием. При проведении таких экспериментов мы сочли полезным использовать несортированные аутологичную 2D-монослойную клетку в качестве контрольных элементов.
Таким образом, этот отчет демонстрирует, что повторное покрытие эпидермальных сфероидов человека моделирует регенеративную пластичность кератиноцитов in vitro,поскольку оно охватывает каждую из четырех фаз регенерации: гомеостатическое поддержание, изменение дифференцировки, подвижность линии стресса и восстановление тканей. Однако одним из ограничений самосборки сфероидов на основе агара является то, что не все пятна NHKc способны спонтанно образовывать сфероиды. Метод висячего падения15 является хорошей альтернативной стратегией для преодоления этой проблемы и принудительного индуцирования образования многоклеточных сфероидов. Этот анализ также может быть мультиплексирован мышечными, стромальными или иммунными клетками, чтобы получить дальнейшее представление о вкладе различных клеточных популяций в регенерацию эпидермиса. было бы интересно изучить, может ли добавление Матрегеля в агар улучшить выживание и потенцию эпидермосферы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют финансовых отношений для раскрытия.
Acknowledgments
Ресурсный центр UofSC School of Medicine Instrumentation Resource Facility (IRF) предоставил доступ к оборудованию для визуализации и сортировки клеток и технической помощи. Эта работа была частично поддержана грантом 1R21CA201853. MCF и IRF получают частичную поддержку от гранта NIH P20GM103499, SC INBRE. MCF также получает поддержку от гранта NIH P20GM109091. Ивон Воаппи был частично поддержан грантами NIH 2R25GM066526-06A1 (PREP) и R25GM076277 (IMSD), а также стипендией Программы профессоров Грейс Джордан Макфадден в UofSC. Джеральдин Эзека и Джастин Верчеллино были поддержаны грантами NIH 2R25GM066526-10A1 (PREP) в UofSC. Шон М. Блус был поддержан премией Magellan Scholar Award 2016 года в UofSC.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Affymetrix platform | Affymetrix | For microarray experiments | |
| Affymetrix’s HuGene-2_0-st library file | Affymetrix | Process | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | For microarray experiments | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | Used for RNA isolation |
| Analysis Console Software version 3.0.0.466 | analyze cell type specific transcriptional responses using one-way between-subject analysis of variance | ||
| BD FACSAria II flow cytometer | Beckman | For flow cytometry | |
| Console Software version 3.0.0.466/Expression console Software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| Cytokeratin 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | 1:200 dilution |
| Dispase | Sigma-Aldrich | D4818 | For cell media |
| FITC-conjugated anti-integrinα6 | Abcam | ab30496 | For FACS analysis |
| GeneChip Command Console 4.0 software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| GeneChip Fluidics Stations 450 (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific) | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip HuGene 2.0 ST Arrays | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | |
| GeneChip Hybridization Oven 640 | Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | Amplify labeled samples | |
| GeneChip Hybridization Wash, and Stain Kit (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific). | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip Scanner 3000 7G system | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | Scanning hybridized arrays | |
| GeneChip WT PLUS Reagent Kit | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For amplifycation of biotinylating total RNA | |
| Human Basic Fibroblast Growth Factor (hFGF basic/FGF2) | Cell Signaling Technology | 8910 | For cell media |
| Human Epidermal Growth Factor (hEGF) | Cell Signaling Technology | 8916 | For cell media |
| Human Insulin | Millipore Sigma | 9011-M | For cell media |
| iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) | Bio-Rad | 1708880 | Used for RT-qPCR |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | Used for RT-qPCR |
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005041 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| KSFM-scm | ThermoFisher Scientific | 17005042 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| MCDB 153-LB basal medium | Sigma-Aldrich | M7403 | MCDB 153-LB basal media w/ HEPES buffer |
| NEST Scientific 1-Well Cell Culture Chamber Slide, BLACK Walls on Glass Slide, 6/PK, 12/CS | Stellar Scientific | NST230111 | For immunostaining |
| P63 | Thermo Scientific | 703809 | 1:200 dilution |
| PE-conjugated anti-EGFR ( San Jose, CA; catalog number ) | BD Pharmingen | 555997 | For FACS analysis |
| pMSCV-IRES-EGFP plasmid vector | Addgene | 20672 | For transfection |
| Promega TransFast kit | Promega | E2431 | For transfection |
| Qiagen RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | For microarray experiments | |
| Thermo Scientific™ Sterile Single Use Vacuum Filter Units | Thermo Scientific | 09-740-63D | For cell media |
| Zeiss Axionvert 135 fluorescence microscope | Zeiss | Use with Axiovision Rel. 4.5 software |
References
- Patel, G. K., Wilson, C. H., Harding, K. G., Finlay, A. Y., Bowden, P. E. Numerous keratinocyte subtypes involved in wound re-epithelialization. Journal of Investigative Dermatology. 126 (2), 497-502 (2006).
- Dekoninck, S., Blanpain, C. Stem cell dynamics, migration and plasticity during wound healing. Nature Cell Biology. 21 (1), 18-24 (2019).
- Byrd, K. M., et al. Heterogeneity within Stratified Epithelial Stem Cell Populations Maintains the Oral Mucosa in Response to Physiological Stress. Cell Stem Cell. , (2019).
- Rothbauer, M., Rosser, J. M., Zirath, H., Ertl, P. Tomorrow today: organ-on-a-chip advances towards clinically relevant pharmaceutical and medical in vitro models. Current Opinion in Biotechnology. 55, 81-86 (2019).
- Kim, S. J., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. Engineering Multi-Cellular Spheroids for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Advanced Healthcare Materials. , 2000608 (2020).
- Lee, J., et al. Hair-bearing human skin generated entirely from pluripotent stem cells. Nature. 582 (7812), 399-404 (2020).
- Zhang, Q., et al. Early-stage bilayer tissue-engineered skin substitute formed by adult skin progenitor cells produces an improved skin structure in vivo. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 407 (2020).
- Borena, B. M., et al. Sphere-forming capacity as an enrichment strategy for epithelial-like stem cells from equine skin. Cellular Physiology and Biochemistry. 34 (4), 1291-1303 (2014).
- Vollmers, A., et al. Two- and three-dimensional culture of keratinocyte stem and precursor cells derived from primary murine epidermal cultures. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (2), 402-413 (2012).
- Kang, B. M., Kwack, M. H., Kim, M. K., Kim, J. C., Sung, Y. K. Sphere formation increases the ability of cultured human dermal papilla cells to induce hair follicles from mouse epidermal cells in a reconstitution assay. Journal of Investigative Dermatology. 132 (1), 237-239 (2012).
- Woappi, Y., Hosseinipour, M., Creek, K. E., Pirisi, L. Stem Cell Properties of Normal Human Keratinocytes Determine Transformation Responses to Human Papillomavirus 16 DNA. Journal of Virology. 92 (11), (2018).
- Woappi, Y., Altomare, D., Creek, K., Pirisi, L. Self-assembling 3D spheroid cultures of human neonatal keratinocytes have enhanced regenerative properties. Stem Cell Research. , (2020).
- Toma, J. G., McKenzie, I. A., Bagli, D., Miller, F. D. Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin. Stem Cells. 23 (6), 727-737 (2005).
- Li, F., et al. Loss of the Epigenetic Mark 5-hmC in Psoriasis: Implications for Epidermal Stem Cell Dysregulation. Journal of Investigative Dermatology. , (2020).
- Kuo, C. T., et al. Three-dimensional spheroid culture targeting versatile tissue bioassays using a PDMS-based hanging drop array. Scientific Reports. , (2017).
- Woappi, Y., Ezeka, G., Vercellino, J., Bloos, S. M., Creek, K. E., Pirisi, L. GSE94244 - Expression data from normal human spheroid-forming keratinocytes in monolayer mass culture and from corresponding cornified-like spheroid ring structures. Gene Expression Omnibus (GEO). , (2020).
