כאן שיטות המשמשות כדי ללמוד את ההשפעה התפקודית של מוטציות RYR1 בא לידי ביטוי אנדוגני וירוס אפשטיין בר מונצח B-לימפוציטים, ביופסיה שריר נגזר תאי לווין המובחנים myotubes מתוארים.
יותר מ -700 גרסאות בגן RYR1 זוהו בחולים עם הפרעות עצביות-שריריות שונות כולל רגישות היפרתרמיה ממאירה, מיופתיות ליבה ומיופתיה centronuclear. בגלל פנוטיפים מגוונים הקשורים מוטציות RYR1 זה בסיסי לאפיין את ההשפעות התפקודיות שלהם כדי לסווג וריאנטים נישאים על ידי חולים להתערבויות טיפוליות עתידיות ולזהות וריאנטים שאינם פתוגניים. מעבדות רבות התעניינו בפיתוח שיטות לאפיון תפקודי של מוטציות RYR1 המתבטאות בתאי המטופלים. לגישה זו יתרונות רבים, כולל: מוטציות מתבטאות באנדוגניות, RyR1 אינו מתבטא יתר על המידה, השימוש בתאי RyR1 הטרולוגיים המבטאים נמנע. עם זאת, מאז חולים עשויים להציג מוטציות בגנים שונים מלבד RYR1, חשוב להשוות תוצאות מחומר ביולוגי מאנשים מחסה אותה מוטציה, עם רקע גנטי שונה. כתב היד הנוכחי מתאר שיטות שפותחו כדי לחקור את ההשפעות התפקודיות של גרסאות RYR1 המובעות באנדוגניות ב: (א) וירוס אפשטיין בר הנציח לימפוציטים B אנושיים ו -(ב) תאי לווין הנגזרים ביופסיות שרירים ומובחנים לתוך מיוטיוב. שינויים בריכוז הסידן התאי המופעלים על ידי תוספת מפעילי RyR1 פרמקולוגיים מנוטרים לאחר מכן. סוג התא שנבחר נטען עם מחוון סידן פלואורסצנטי יחסטרי ושינויים תאיים [Ca2+] מנוטרים או ברמת התא הבודד על ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית או באוכלוסיות תאים באמצעות ספקטרופלואורומטר. המנוחה [Ca2+], עקומות תגובת מינון אגוניסטיות משווות לאחר מכן בין תאים משליטה בריאה וחולים מחסה וריאנטים RYR1 המוביל תובנה לתוך ההשפעה התפקודית של גרסה נתונה.
עד כה זוהו יותר מ-700 גרסאות RYR1 באוכלוסייה האנושית וקשורות להפרעות נוירו-שריריות שונות, כולל רגישות היפרתרמיה ממאירה (MHS), פעילות גופנית המושרה rhabdomyolysis, מחלת ליבה מרכזית (CCD), מחלת רב-מיני-קור (MmD), מיופתיה סנטרונוקלארית (CNM)1,2,3 ; עם זאת, מחקרים לאפיון ההשפעות התפקודיות שלהם מפגרים ורק כ -10% מהמוטציות נבדקו באופן פונקציונלי. ניתן להשתמש בגישות ניסיוניות שונות כדי להעריך את ההשפעה של גרסה RyR1 נתון, כולל transfection של תאים הטרולוגיים כגון HEK293 ו COS-7 תאים עם קידוד plasmid עבור WT מוטציה RYR1 cDNA4,5, טרנסדוקציה של פיברובלסטים עכבר דיפדי עם plasmids וקטורים קידוד עבור WT מוטציה RYR1 cDNA, ואחריו טרנסדוקציה עם myo-D ובידול לתוך myotubes6 דור של מודלים חייתיים מהונדסים הנושאים מוטציה RyR1s7,8,9, אפיון תאים מחולים המבטאים את גרסת RYR1 אנדוגני10,11,12. שיטות כאלה עזרו לקבוע כיצד מוטציות שונות משפיעות מבחינה פונקציונלית על ערוץ RyR1 Ca2+ .
כאן, שיטות שפותחו כדי להעריך את ההשפעות הפונקציונליות של מוטציות RYR1 מתוארים. פרמטרים שונים של הומאוסטזיס סידן תאי נחקרים בתאים אנושיים מבטאים אנדוגני את ערוץ הסידן RyR1, כולל מיוטיוב ווירוס אפסטין בר (EBV) לימפוציטים מונצחים B. תאים מתקבלים מחולים, מורחבים בתרבית ועמוסים במדדי סידן פלואורסצנטיים יחסטריים כגון Fura-2 או indo-1. פרמטרים אשר דווחו להיות שונה בגלל מוטציות RYR1 פתוגניים כולל מנוחה [Ca2 +], הרגישות אגוניסטים רוקח שונים ואת הגודל של מאגרי Ca2 + תאי נמדדים או ברמת התא הבודד, באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, או באוכלוסיות תאים באמצעות פלואורימטר. לאחר מכן, התוצאות המתקבלות בתאים מנשאי מוטציה משווות את התוצאות של בני משפחה בשליטה בריאה. גישה זו הוכיחה כי: (i) מוטציות רבות הקשורות ל- MHS מובילות לעלייה במנוחה [Ca2+] ומעבר שמאלה בעקומת תגובת המינון להפעלה של דה-קוטביות הנגרמת על ידי KCl או להפעלת RyR1 פרמקולוגית עם 4-כלורו-m-קרסול10,11,12,13; (ii) מוטציות הקשורות ל- CCD מובילות לירידה בשיא [Ca2+] שפורסמו על ידי הפעלה פרמקולוגית של RyR1 וירידה בגודל אם Ca2 + תאיים חנויות12,13,14,15; (iii) גרסאות מסוימות אינן משפיעות על Ca2 + הומאוסטזיס13. היתרונות של גישה ניסיונית זו הם: חלבון RyR1 אינו מבוטא יתר על המידה ורמות פיזיולוגיות קיימות, ניתן להנציח תאים (הן תאי שריר והן לימפוציטים B) המספקים קווי תאים המכילים מוטציות. חסרונות מסוימים מתייחסים לעובדה כי חולים עשויים לשאת מוטציות ביותר מחלבונים קידוד גן אחד המעורבים סידן הומאוסטזיס ו /או צימוד התכווצות עירור (ECC) וזה עלול לסבך מסקנות ניסיוניות. לדוגמה, שתי גרסאות JP-45 זוהו ב- MHS ואוכלוסיית הבקרה ונוכחותם הוכחו כמשפיעות על הרגישות של קולטן הדיהידרופרידין (DHPR) להפעלה16. חולים צריכים להיות זמינים, חומר ביולוגי צריך להיות שנאסף טרי ויש לקבל היתרים אתיים מוועדת האתיקה המקומית.
הפרוטוקולים המתוארים במאמר זה נוצלו בהצלחה על ידי מספר מעבדות כדי לחקור את ההשפעה של מוטציות RYR1 על הומאוסטזיס סידן. הצעדים הקריטיים של הגישות המתוארות במאמר זה עוסקים בעקרות, מיומנויות וטכניקות פולחן תאים וזמינות של חומר ביולוגי. באופן עקרוני, השימוש בלימפוציטים B מונצחים EBV הוא פשוט יותר…
The authors have nothing to disclose.
העבודה המתוארת בכתב יד זה נתמכה על ידי מענקים מהקרן הלאומית השוויצרית למדע (SNF) ומקרן השרירים השוויצרית.
4-chloro-m-cresol | Fluka | 24940 | |
Blood collection tubes | Sarstedt | 172202 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
caffeine | Merk | 102584 | |
Cascade 125+ CCD camera | Photometrics | ||
Cascade 128+ CCD | Photometrics | ||
Creatine | Sigma-Aldrich | C-3630 | |
DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
DMSO | Sigma | 41639 | |
EGTA | Fluka | 3778 | |
Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
Ficoll Paque | Cytiva | 17144002 | |
Foetal calf serum | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
Fura-2/AM | Invitrogen Life Sciences | F1201 | |
Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630049 | |
Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050122 | |
Insulin | ThermoFisher Scientific | A11382II | |
Ionomycin | Sigma | I0634 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
Lanthanum | Fluka | 61490 | |
Microperfusion system | ALA-Scientific | DAD VM 12 valve manifold | |
Origin Software | OriginLab Corp | Software | |
Pennicillin/Streptomycin | Gibco Life Sciences | 15140-122 | |
Perfusion chamber POC-R | Pecon | 000000-1116-079 | |
poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
RPMI | ThermoFisher Scientific | 21875091 | |
Spectrofluorimeter | Perkin Elmer | LS50 | |
Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | |
Tissue culture dishes | Falcon | 353046 | |
Tissue culture flask | Falcon | 353107 | |
Tissue culture inserts | Falcon | 353090 | |
Trypsin/EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300054 | |
Visiview | Visitron Systems GmbH | Software | |
Zeiss Axiovert S100 TV microscope | Carl Zeiss AG | ||
Zeiss glass coverslips | Carl Zeiss AG | 0727-016 |