内在的に発現したヒトRYR1変異体の機能特性評価
Summary
ここでは、エプスタインバーウイルスで内因的に発現するRYR1変異の機能的効果を研究するために用いられる方法について、ヒトBリンパ球および筋生検由来衛星細胞をミオチューブに分化した不死生のヒトリンパ球が説明されている。
Abstract
RYR1遺伝子の700以上の変異体は、悪性温熱療法感受性、コアミオパシーおよび中心核筋症を含む異なる神経筋障害を有する患者において同定されている。RYR1突然変異に関連する多様な型素型のために、将来の治療介入のために患者が運んだ変異体を分類し、非病原性変異体を同定するために、その機能的効果を特徴付けるのが基本である。多くの研究室では、患者の細胞に発現するRYR1変異を機能的に特徴付ける方法の開発に関心を持っています。このアプローチは、多くの利点を有する:変異が内因的に発現し、RyR1は過剰発現せず、異種のRyR1発現細胞の使用は避ける。しかし、患者はRYR1を除いて異なる遺伝子に変異を提示する可能性があるため、同じ突然変異を有する個体の生物学的物質の結果を、異なる遺伝的背景を有する場合に比較することが重要である。本稿は、(a)エプスタインバーウイルス不死化ヒトBリンパ球および(b)筋肉生検に由来する衛星細胞および筋管内に分化された、内因的に発現したRYR1変異体の機能的効果を研究するために開発された方法を説明する。次に、薬理学的なRyR1活性化剤の添加によって引き起こされる細胞内カルシウム濃度の変化をモニターする。選択した細胞タイプには、レシオメトリック蛍光カルシウム指標がロードされ、細胞内[Ca2+]変化は、蛍光顕微鏡検査によって単一細胞レベルまたは分光蛍光計を用いた細胞集団のいずれかで監視される。休息[Ca2+]では、アゴニスト用量応答曲線を、健康なコントロールからの細胞と、特定の変異体の機能的効果に関する洞察をもたらすRYR1変異体を有する患者との間で比較される。
Introduction
現在までに700以上のRYR1変異体がヒト集団で同定され、悪性温熱症感受性(MHS)、運動誘発横紋筋融解症、中核疾患(CCD)、マルチミニコア病(MmD)、心筋症(CNM)1、2、3を含む様々な神経筋疾患に関連している;しかし、その機能効果を特徴付ける研究は遅れており、突然変異の約10%だけが機能的にテストされている。異なる実験的アプローチを使用して、特定のRyR1バリアントの影響を評価することができます。 WTおよび変異体RYR1 cDNA4、5に対するプラスミドコードを有するヘクロスミドおよびCOS-7細胞などの異種細胞のトランスフェクションを含む、WTおよび変異型RYR1 cDNAをコードするプラスミドおよびベクターを用いた異端マウス線維芽細胞の導入、続いてmyo-DとのトランスダクションとmyoTubetubeへの分化、変異体RyR1s7、8、9を担持するトランスジェニック動物モデルの生成は、10、11、12の内在的にRYR1変異体を発現する患者からの細胞の特徴付けである。このような方法は、異なる突然変異が機能的にRyR1 Ca2+チャネルに与える影響を確立するのに役立っています。
ここでは、RYR1変異の機能的効果を評価するために開発された方法について説明する。細胞内カルシウム恒常性の様々なパラメータは、ヒト細胞において、ミオチューブやエプスタインバーウイルス(EBV)を含む、YR1カルシウムチャネルを内発的に発現し、Bリンパ球を不死化した。細胞は患者から得られ、培養中に拡大され、フラ-2またはインド-1などのレシオメトリック蛍光カルシウムインジクターを装填する。休養期[Ca2+]を含む病原性RYR1突然変異のために変化することが報告されているパラメータは、異なる薬理学的アゴニストに対する感受性および細胞内Ca2+ストアのサイズは、蛍光顕微鏡を用いて、または蛍光計を用いた細胞集団において、単一細胞レベルで測定される。突然変異担体から得られた細胞で得られた結果は、次いで、健康な対照ファミリーメンバーから得られたものと比較される。このアプローチは、(i)MHSに関連する多くの突然変異が休息[Ca2+]の増加につながり、4-クロロm-クレゾール10、11、12、13でKCl誘導脱分極または薬理学的RyR1活性化のいずれかに用量応答曲線の左へのシフトにつながることを実証した。(ii) CCDに関連する変異は、ライR1の薬理学的活性化によって放出されるピークの減少につながる [Ca2+] 細胞内Ca2+が12,13,14,15を格納する場合のサイズを減少させる;(iii) いくつかの変異体は、Ca2+ホメオスタシス13に影響を与えない。この実験的アプローチの利点は、RyR1タンパク質が過剰発現せず、生理学的レベルが存在し、細胞(筋肉細胞およびBリンパ球の両方)が変異を含む細胞株を提供することができる。いくつかの欠点は、患者がカルシウム恒常性および/または励起収縮結合(ECC)に関与するタンパク質をコードする複数の遺伝子に変異を運ぶ可能性があり、これは実験的結論を複雑にする可能性があるという事実に関連する。例えば、2つのJP-45変異体がMHSおよび対照集団において同定され、それらの存在は、ジヒドロピリジン受容体(DHPR)の感受性に影響を与える16を活性化する。患者は利用可能である必要があり、生物学的材料は新たに収集される必要があり、倫理的許可は地元の倫理委員会から取得する必要があります。
Protocol
Representative Results
Discussion
本論文に記載されているプロトコルは、いくつかの研究所で、カルシウム恒常性に対するRYR1変異の影響を研究するために有効に活用されている。この論文で概説されているアプローチの重要なステップは、生物材料の無菌性、細胞培養技術および技術および入手可能性を扱う。原則として、EBV不死化Bリンパ球の使用は、より簡単であり、変異型RyR1チャネルを含む細胞株を生成することを可?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この原稿に記載されている研究は、スイス国立科学財団(SNF)とスイスマッスル財団からの助成金によって支えられました。
Materials
| 4-chloro-m-cresol | Fluka | 24940 | |
| Blood collection tubes | Sarstedt | 172202 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| caffeine | Merk | 102584 | |
| Cascade 125+ CCD camera | Photometrics | ||
| Cascade 128+ CCD | Photometrics | ||
| Creatine | Sigma-Aldrich | C-3630 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMSO | Sigma | 41639 | |
| EGTA | Fluka | 3778 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ficoll Paque | Cytiva | 17144002 | |
| Foetal calf serum | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Fura-2/AM | Invitrogen Life Sciences | F1201 | |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630049 | |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050122 | |
| Insulin | ThermoFisher Scientific | A11382II | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| Lanthanum | Fluka | 61490 | |
| Microperfusion system | ALA-Scientific | DAD VM 12 valve manifold | |
| Origin Software | OriginLab Corp | Software | |
| Pennicillin/Streptomycin | Gibco Life Sciences | 15140-122 | |
| Perfusion chamber POC-R | Pecon | 000000-1116-079 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | ThermoFisher Scientific | 21875091 | |
| Spectrofluorimeter | Perkin Elmer | LS50 | |
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | |
| Tissue culture dishes | Falcon | 353046 | |
| Tissue culture flask | Falcon | 353107 | |
| Tissue culture inserts | Falcon | 353090 | |
| Trypsin/EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300054 | |
| Visiview | Visitron Systems GmbH | Software | |
| Zeiss Axiovert S100 TV microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss glass coverslips | Carl Zeiss AG | 0727-016 |
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