التوصيف الوظيفي للمتغيرات RYR1 البشرية المعبر عنها داخليا
Summary
هنا الأساليب المستخدمة لدراسة التأثير الوظيفي للطفرات RYR1 أعرب عنها محليا في فيروس إبشتاين بار خلدت الإنسان B-الخلايا الليمفاوية وخزعة العضلات المستمدة من خلايا الأقمار الصناعية المتمايزة في myotubes توصف.
Abstract
وقد تم تحديد أكثر من 700 المتغيرات في الجين RYR1 في المرضى الذين يعانون من اضطرابات عصبية عضلية مختلفة بما في ذلك فرط الحرارة الخبيثة التعرض, اعتلال عضلي الأساسية واعتلال عضلي سنترونوي. بسبب الأنماط الظاهرية المتنوعة المرتبطة بطفرات RYR1 ، من الأساسي توصيف آثارها الوظيفية لتصنيف المتغيرات التي يحملها المرضى للتدخلات العلاجية المستقبلية وتحديد المتغيرات غير المسببة للأمراض. وقد اهتمت العديد من المختبرات بتطوير طرق لتوصيف وظيفيا طفرات RYR1 المعبر عنها في خلايا المرضى. هذا النهج له العديد من المزايا، بما في ذلك: يتم التعبير عن الطفرات الذاتية، RyR1 لا يتم التعبير عن أكثر من ذلك، يتم تجنب استخدام الخلايا التعبير عن heterologous RyR1. ومع ذلك ، لأن المرضى قد يقدمون طفرات في جينات مختلفة جانبا RYR1 ، فمن المهم مقارنة النتائج من المواد البيولوجية من الأفراد الذين يأوون نفس الطفرة ، مع خلفيات وراثية مختلفة. تصف المخطوطة الحالية الطرق التي تم تطويرها لدراسة الآثار الوظيفية لمتغيرات RYR1 المعبر عنها محليا في: (أ) خلد فيروس إبشتاين بار الخلايا الليمفاوية B البشرية و(ب) الخلايا الساتلية المشتقة من خزعات العضلات والمتمايزة في الميوتوب. ثم يتم رصد التغيرات في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا الناجمة عن إضافة المنشطات RyR1 الدوائية. يتم تحميل نوع الخلية المحددة بمؤشر الكالسيوم الفلوري الفلورسنت النسبة ويتم رصد التغيرات داخل الخلايا [Ca2+] إما على مستوى الخلية الواحدة عن طريق المجهر الفلوري أو في مجموعات الخلايا باستخدام مقياس الطيف. يستريح [Ca2 +] ، ثم تتم مقارنة منحنيات استجابة الجرعة الناهضة بين الخلايا من الضوابط الصحية والمرضى الذين يؤوون المتغيرات RYR1 مما يؤدي إلى نظرة ثاقبة التأثير الوظيفي للمتغير معين.
Introduction
حتى الآن تم تحديد أكثر من 700 المتغيرات RYR1 في السكان البشرية وربطها باضطرابات عصبية عضلية مختلفة بما في ذلك فرط الحرارة الخبيث (MHS)، ممارسة انحلال الربيدات المستحثة، الأمراض الأساسية المركزية (CCD)، مرض متعدد النوى (MmD)، اعتلال عضلة القلب المركزي (CNM)1،2،3 ; ومع ذلك، فإن الدراسات التي تميز آثارها الوظيفية متخلفة وتم اختبار ما يقرب من 10٪ فقط من الطفرات وظيفيا. يمكن استخدام نهج تجريبية مختلفة لتقييم تأثير متغير RyR1 معين، بما في ذلك نقل خلايا heterologous مثل HEK293 و COS-7 الخلايا مع ترميز البلازميد لWT وRYR1 متحولة cDNA4،5، نقل الخلايا الليفية الماوس خلل التنسيب مع البلازميدات وناقلات ترميز لWT وRYR1 متحولة cDNA ، تليها التحويل مع ميو دال والتمايز في myotubes6 ، جيل من نماذج الحيوانات المعدلة وراثيا تحمل متحولة RyR1s7،8،9، توصيف الخلايا من المرضى الذين يعبرون عن البديل RYR1 الذاتية10،11،12. وقد ساعدت هذه الأساليب على تحديد كيفية تأثير الطفرات المختلفة وظيفيا على قناة RyR1 Ca2+ .
هنا، يتم وصف الأساليب التي تم تطويرها لتقييم الآثار الوظيفية لطفرات RYR1. يتم التحقيق في معلمات مختلفة من التوازن الكالسيوم داخل الخلايا في الخلايا البشرية التعبير عن الذاتية قناة الكالسيوم RyR1، بما في ذلك الميوتوب وفيروس ابشتاين بار (EBV) خلدت الخلايا الليمفاوية B. يتم الحصول على الخلايا من المرضى، وتوسيع نطاقها في الثقافة وتحميلها مع النسبة الفلورسنت الكالسيوم المتهمين مثل Fura-2 أو الهندو-1. يتم قياس المعلمات التي تم الإبلاغ عن تغييرها بسبب طفرات RYR1 المسببة للأمراض بما في ذلك الراحة [Ca2 +] ، والحساسية تجاه ناهضات دوائية مختلفة وحجم مخازن Ca2 + داخل الخلايا إما على مستوى الخلية الواحدة ، باستخدام المجهر الفلوري ، أو في مجموعات الخلايا باستخدام مقياس الفلوريتر. ثم تتم مقارنة النتائج التي يتم الحصول عليها في الخلايا من ناقلات الطفرات بتلك التي تم الحصول عليها من أفراد عائلة التحكم السليم. وقد أثبت هذا النهج أن: (1) العديد من الطفرات المرتبطة MHS تؤدي إلى زيادة في يستريح [Ca2+] والتحول إلى اليسار في منحنى استجابة الجرعة إما إلى إزالة الاستقطاب الناجم عن KCl أو تنشيط RyR1 الدوائية مع 4-chloro-m-cresol10,11,12,13; ‘2’ الطفرات المرتبطة اتفاقية مكافحة الارتهاق تؤدي إلى انخفاض في الذروة [Ca2 +] صدر عن طريق التنشيط الدوائي من RyR1 وانخفاض حجم إذا كان Ca2 + داخل الخلية مخازن12،13،14،15؛ ‘3’ بعض المتغيرات لا تؤثر على Ca2 + التوازن13. مزايا هذا النهج التجريبي هي: بروتين RyR1 ليس مفرطا في التعبير والمستويات الفسيولوجية موجودة ، ويمكن تخليد الخلايا (كل من خلايا العضلات والخلايا الليمفاوية B) التي توفر خطوط الخلايا التي تحتوي على طفرات. بعض المساوئ تتعلق بحقيقة أن المرضى قد تحمل الطفرات في أكثر من جين واحد ترميز البروتينات المشاركة في التوازن الكالسيوم و / أو اقتران انكماش الإثارة (ECC) وهذا قد يعقد الاستنتاجات التجريبية. على سبيل المثال، تم تحديد اثنين من المتغيرات JP-45 في MHS والسكان السيطرة وتبين وجودها للتأثير على حساسية مستقبلات ثنائي هيدروبيريدين (DHPR) لتنشيط16. ويحتاج المرضى إلى أن يكونوا متاحين، وإلى جمع المواد البيولوجية حديثا، وإلى الحصول على تصاريح أخلاقية من المجالس الأخلاقية المحلية.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد استخدمت بنجاح البروتوكولات الموصوفة في هذه الورقة من قبل العديد من المختبرات لدراسة تأثير الطفرات RYR1 على التوازن الكالسيوم. وتتناول الخطوات الحاسمة للنهج المبينة في هذه الورقة العقم ومهارات وتقنيات زراعة الخلايا وتوافر المواد البيولوجية. من حيث المبدأ ، فإن استخدام الخلايا الليمفا?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم العمل الموصوف في هذه المخطوطة بمنح من المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (SNF) ومؤسسة العضلات السويسرية.
Materials
| 4-chloro-m-cresol | Fluka | 24940 | |
| Blood collection tubes | Sarstedt | 172202 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| caffeine | Merk | 102584 | |
| Cascade 125+ CCD camera | Photometrics | ||
| Cascade 128+ CCD | Photometrics | ||
| Creatine | Sigma-Aldrich | C-3630 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMSO | Sigma | 41639 | |
| EGTA | Fluka | 3778 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ficoll Paque | Cytiva | 17144002 | |
| Foetal calf serum | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Fura-2/AM | Invitrogen Life Sciences | F1201 | |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630049 | |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050122 | |
| Insulin | ThermoFisher Scientific | A11382II | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| Lanthanum | Fluka | 61490 | |
| Microperfusion system | ALA-Scientific | DAD VM 12 valve manifold | |
| Origin Software | OriginLab Corp | Software | |
| Pennicillin/Streptomycin | Gibco Life Sciences | 15140-122 | |
| Perfusion chamber POC-R | Pecon | 000000-1116-079 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | ThermoFisher Scientific | 21875091 | |
| Spectrofluorimeter | Perkin Elmer | LS50 | |
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | |
| Tissue culture dishes | Falcon | 353046 | |
| Tissue culture flask | Falcon | 353107 | |
| Tissue culture inserts | Falcon | 353090 | |
| Trypsin/EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300054 | |
| Visiview | Visitron Systems GmbH | Software | |
| Zeiss Axiovert S100 TV microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss glass coverslips | Carl Zeiss AG | 0727-016 |
References
- Dlamini, N., et al. Mutations in RYR1 are a common cause of exertional myalgia and rhabdomyolysis. Neuromuscular Disorders. 23 (7), 540-548 (2013).
- Klein, A., et al. Clinical and genetic findings in a large cohort of patients with ryanodine receptor 1 gene-associated myopathies. Human Mutation. 33, 981-988 (2012).
- Robinson, R., Carpenter, D., Shaw, M. A., Halsall, J., Hopkins, P. Mutations in RYR1 in malignant hyperthermia and central core disease. Human Mutation. 27 (20), 977-989 (2006).
- Xu, L., et al. Ca2+ mediated activation of the skeletal muscle ryanodine receptor ion channel. Journal of Biological Chemistry. 293 (50), 19501-19509 (2018).
- Treves, S., et al. Alteration of intracellular Ca2+ transients in COS-7 cells transfected with the cDNA encoding skeletal-muscle ryanodine receptor carrying a mutation associated with malignant hyperthermia. Biochemical Journal. 301 (3), 661-665 (1994).
- Nakai, J., et al. Enhanced dihydropyridine receptor channel activity in the presence of ryanodine receptor. Nature. 389 (6569), 72-75 (1996).
- Durham, W. J., et al. RyR1 S-nitrosylation underlies environmental heat stroke and sudden death in Y522S RyR1 knockin mice. Cell. 133 (81), 53-65 (2008).
- Zvaritch, E., et al. Ca2+ dysregulation in Ryr1(I4895T/wt) mice causes congenital myopathy with progressive formation of minicores, cores, and nemaline rods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21813-21818 (2009).
- Elbaz, M., et al. Bi-allelic expression of the RyR1 p.A4329D mutation decreases muscle strength in slow-twitch muscles in mice. Journal of Biological Chemistry. 295, 10331-10339 (2020).
- Censier, K., Urwyler, A., Zorzato, F., Treves, S. Intracellular calcium homeostasis in human primary muscle cells from malignant hyperthermia susceptible and normal individuals. Journal of Clinical Investigations. 101 (6), 1233-1242 (1998).
- Girard, T., et al. B-lymphocytes from Malignant Hyperthermia-Susceptible patients have an increased sensitivity to skeletal muscle ryanodine receptor activators. Journal of Biological Chemistry. 276 (51), 48077 (2001).
- Ducreux, S., et al. Effect of ryanodine receptor mutations on interleukin-6 release and intracellular calcium homeostasis in human myotubes from Malignant Hyperthermia- Susceptible individuals and patients affected by Central Core Disease. Journal of Biological Chemistry. 279 (42), 43838-43846 (2004).
- Ducreux, S., et al. Functional properties of ryanodine receptors carrying three amino acid substitutions identified in patients affected by multi-minicore disease and central core disease, expressed in immortalized lymphocytes. Biochemical Journal. 395, 259-266 (2006).
- Tilgen, N., et al. Identification of four novel mutations in the C-terminal membrane spanning domain of the ryanodine receptor 1: association with central core disease and alteration of calcium homeostasis. Human Molecular Genetics. 10 (25), 2879-2887 (2001).
- Treves, S., et al. Enhanced excitation-coupled Ca2+ entry induces nuclear translocation of NFAT and contributes to IL-6 release from myotubes from patients with central core disease. Human Molecular Genetics. 20 (3), 589-600 (2011).
- Yasuda, T., et al. JP-45/JSRP1 variants affect skeletal muscle excitation contraction coupling by decreasing the sensitivity of the dihydropyridine receptor. Human Mutation. 34, 184-190 (2013).
- Sei, Y., Gallagher, K. L., Basile, A. S. Skeletal muscle ryanodine receptor is involved in calcium signaling in human B lymphocytes. Journal of Biological Chemistry. 274 (9), 5995-6062 (1999).
- Tegazzin, V., Scutari, E., Treves, S., Zorzato, F. Chlorocresol, an additive to commercial succinylcholine, induces contracture of human malignant Hyperthermia Susceptible muscles via activation of the ryanodine receptor Ca2+ channel. Anesthesiology. 84, 1275-1279 (1996).
- Kushnir, A., et al. Ryanodine receptor calcium leak in circulating B-lymphocytes as a biomarker for heart failure. Circulation. 138 (11), 1144-1154 (2018).
- Zullo, A., et al. Functional characterization of ryanodine receptor sequence variants using a metabolic assay in immortalized B-lymphocytes. Human Mutation. 30 (4), 575-590 (2009).
- Hoppe, K., et al. Hypermetabolism in B-lymphocytes from malignant hyperthermia susceptible individuals. Scientific Reports. 6, 33372 (2016).
- Monnier, N., et al. A homozygous splicing mutation causing a depletion of skeletal muscle RYR1 is associated with multi-minicore disease congenital myopathy with ophthalmoplegia. Human Molecular Genetics. 12, 1171-1178 (2003).
- Schartner, V., et al. Dihydropyridine receptor (DHPR, CACNA1S) congenital myopathy. Acta Neuropathologica. 133, 517-533 (2017).
- Ullrich, N. D., et al. Alterations of excitation-contraction coupling and excitation coupled Ca2+ entry in human myotubes carrying CAV3 mutations linked to rippling muscle disease. Human Mutation. 32, 1-9 (2010).
- Rokach, O., et al. Characterization of a human skeletal muscle- derived cell line: biochemical, cellular and electrophysiological characterization. Biochemical Journal. 455, 169-177 (2013).
- Zhou, H., et al. Characterization of RYR1 mutations in core myopathies. Human Molecular Genetics. 15, 2791-2803 (2006).
- Klinger, W., Baur, C., Georgieff, M., Lehmann-Horn, F., Melzer, W. Detection of proton release from cultured human myotubes to identify malignant hyperthermia susceptibility. Anesthesiology. 97, 1043-1056 (2002).
