Functionele karakterisering van endogene uitgedrukte menselijke RYR1-varianten
Summary
Hier worden methoden beschreven die worden gebruikt om het functionele effect van RYR1-mutaties te bestuderen die endogeen tot expressie komen in epstein barr-virus vereeuwigde menselijke B-lymfocyten en spierbiopsie afgeleide satellietcellen gedifferentieerd in myotubes.
Abstract
Meer dan 700 varianten in het RYR1-gen zijn geïdentificeerd bij patiënten met verschillende neuromusculaire aandoeningen, waaronder maligne hyperthermiegevoeligheid, kernmyopathieën en centronucleaire myopathie. Vanwege de diverse fenotypen die verband houden met RYR1-mutaties is het van fundamenteel belang om hun functionele effecten te karakteriseren om varianten te classificeren die door patiënten worden gedragen voor toekomstige therapeutische interventies en niet-pathogene varianten te identificeren. Veel laboratoria zijn geïnteresseerd in het ontwikkelen van methoden om RYR1-mutaties in cellen van patiënten functioneel te karakteriseren. Deze aanpak heeft tal van voordelen, waaronder: mutaties worden endogeen tot expressie gebracht, RyR1 wordt niet overexpressie gegeven, het gebruik van heterologe RyR1-expressiecellen wordt vermeden. Omdat patiënten echter naast RYR1 mutaties in verschillende genen kunnen vertonen, is het belangrijk om resultaten van biologisch materiaal te vergelijken van personen met dezelfde mutatie, met verschillende genetische achtergronden. Het huidige manuscript beschrijft methoden die zijn ontwikkeld om de functionele effecten van endogene tot expressie gebrachte RYR1-varianten te bestuderen in: (a) Epstein Barr-virus vereeuwigde menselijke B-lymfocyten en (b) satellietcellen afgeleid van spierbiopten en gedifferentieerd in myotubes. Veranderingen in de intracellulaire calciumconcentratie veroorzaakt door de toevoeging van een farmacologische RyR1-activatoren worden vervolgens gecontroleerd. Het geselecteerde celtype wordt geladen met een ratiometrische fluorescerende calciumindicator en intracellulaire [Ca2+] veranderingen worden gecontroleerd op het niveau van één cel door fluorescentiemicroscopie of in celpopulaties met behulp van een spectrofluorometer. De rust [Ca2+], agonist dosisresponscurven worden vervolgens vergeleken tussen cellen van gezonde controles en patiënten met RYR1-varianten, wat leidt tot inzicht in het functionele effect van een bepaalde variant.
Introduction
Tot op heden zijn meer dan 700 RYR1-varianten geïdentificeerd in de menselijke populatie en gekoppeld aan verschillende neuromusculaire aandoeningen, waaronder maligne hyperthermiegevoeligheid (MHS), door inspanning geïnduceerde rabdomyolyse, centrale kernziekte (CCD), multi-minicoreziekte (MmD), centronucleaire myopathie (CNM)1,2,3 ; niettemin blijven studies om hun functionele effecten te karakteriseren achter en slechts ongeveer 10% van de mutaties is functioneel getest. Verschillende experimentele benaderingen kunnen worden gebruikt om de impact van een bepaalde RyR1-variant te beoordelen, waaronder transfectie van heterologe cellen zoals HEK293- en COS-7-cellen met plasmidecodering voor de WT en mutant RYR1 cDNA4,5, transductie van dyspedische muisfibroblasten met plasmiden en vectoren die coderen voor de WT en mutant RYR1 cDNA, gevolgd door transductie met myo-D en differentiatie in myotubes6 , generatie van transgene diermodellen met mutant RyR1s7,8,9, karakterisering van cellen van patiënten die de RYR1-variant endogeen tot expressie brengen10,11,12. Dergelijke methoden hebben geholpen vast te stellen hoe verschillende mutaties functioneel van invloed zijn op het RyR1 Ca2+ kanaal.
Hier worden methoden beschreven die zijn ontwikkeld om de functionele effecten van RYR1-mutaties te beoordelen. Verschillende parameters van intracellulaire calciumhomeostase worden onderzocht in menselijke cellen die endogeen het RyR1-calciumkanaal tot expressie brengen, waaronder myotubes en epstein barr-virus (EBV) vereeuwigde B-lymfocyten. Cellen worden verkregen van patiënten, uitgebreid in cultuur en geladen met ratiometrische fluorescerende calciumindicatoren zoals Fura-2 of indo-1. Parameters waarvan is gemeld dat ze zijn gewijzigd als gevolg van pathogene RYR1-mutaties, waaronder de rust [Ca2+], de gevoeligheid voor verschillende farmacologische agonisten en de grootte van de intracellulaire Ca2+-winkels, worden gemeten op het niveau van één cel, met behulp van fluorescentiemicroscopie, of in celpopulaties met behulp van een fluorimeter. Resultaten verkregen in cellen van mutatiedragers worden vervolgens vergeleken met die verkregen van gezonde controlefamilieleden. Deze benadering heeft aangetoond dat: (i) veel mutaties gekoppeld aan MHS leiden tot een toename van de rust [Ca2+] en een verschuiving naar links in de dosisresponscurve naar ofwel KCl-geïnduceerde depolarisatie of farmacologische RyR1-activering met 4-chloor-m-cresol10,11,12,13; ii) mutaties in verband met CCD leiden tot een afname van de piek [Ca2+ ]die vrijkomt door farmacologische activering van de RyR1 en een afname van de omvang als het intracellulaire Ca2+ 12,13,14,15opslaat; (iii) sommige varianten hebben geen invloed op Ca2+ homeostase13. Voordelen van deze experimentele aanpak zijn: het RyR1-eiwit is niet overexpressie en fysiologische niveaus zijn aanwezig, cellen kunnen worden vereeuwigd (zowel spiercellen als B-lymfocyten) en cellijnen met mutaties leveren. Sommige nadelen hebben betrekking op het feit dat patiënten mutaties kunnen dragen in meer dan één gen dat codeert voor eiwitten die betrokken zijn bij calciumhomeostase en / of excitatiecontractiekoppeling (ECC) en dit kan experimentele conclusies bemoeilijken. Er werden bijvoorbeeld twee JP-45-varianten geïdentificeerd in de MHS- en controlepopulatie en hun aanwezigheid bleek de gevoeligheid van de dihydropyridinereceptor (DHPR) voor activering te beïnvloeden16. Patiënten moeten beschikbaar zijn, biologisch materiaal moet vers worden ingezameld en ethische vergunningen moeten worden verkregen van de lokale ethische raden.
Protocol
Representative Results
Discussion
De protocollen die in dit artikel worden beschreven, zijn met succes gebruikt door verschillende laboratoria om de impact van RYR1-mutaties op calciumhomeostase te bestuderen. De kritische stappen van de benaderingen die in dit artikel worden beschreven, hebben betrekking op steriliteit, celkweekvaardigheden en -technieken en beschikbaarheid van biologisch materiaal. In principe is het gebruik van EBV-vereeuwigde B-lymfocyten eenvoudiger en kan men cellijnen genereren die mutante RyR1-kanalen bevatten. De cellen kunnen v…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Het werk beschreven in dit manuscript werd ondersteund door subsidies van de Swiss National Science Foundation (SNF) en de Swiss Muscle Foundation.
Materials
| 4-chloro-m-cresol | Fluka | 24940 | |
| Blood collection tubes | Sarstedt | 172202 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| caffeine | Merk | 102584 | |
| Cascade 125+ CCD camera | Photometrics | ||
| Cascade 128+ CCD | Photometrics | ||
| Creatine | Sigma-Aldrich | C-3630 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMSO | Sigma | 41639 | |
| EGTA | Fluka | 3778 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ficoll Paque | Cytiva | 17144002 | |
| Foetal calf serum | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Fura-2/AM | Invitrogen Life Sciences | F1201 | |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630049 | |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050122 | |
| Insulin | ThermoFisher Scientific | A11382II | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| Lanthanum | Fluka | 61490 | |
| Microperfusion system | ALA-Scientific | DAD VM 12 valve manifold | |
| Origin Software | OriginLab Corp | Software | |
| Pennicillin/Streptomycin | Gibco Life Sciences | 15140-122 | |
| Perfusion chamber POC-R | Pecon | 000000-1116-079 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | ThermoFisher Scientific | 21875091 | |
| Spectrofluorimeter | Perkin Elmer | LS50 | |
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | |
| Tissue culture dishes | Falcon | 353046 | |
| Tissue culture flask | Falcon | 353107 | |
| Tissue culture inserts | Falcon | 353090 | |
| Trypsin/EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300054 | |
| Visiview | Visitron Systems GmbH | Software | |
| Zeiss Axiovert S100 TV microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss glass coverslips | Carl Zeiss AG | 0727-016 |
References
- Dlamini, N., et al. Mutations in RYR1 are a common cause of exertional myalgia and rhabdomyolysis. Neuromuscular Disorders. 23 (7), 540-548 (2013).
- Klein, A., et al. Clinical and genetic findings in a large cohort of patients with ryanodine receptor 1 gene-associated myopathies. Human Mutation. 33, 981-988 (2012).
- Robinson, R., Carpenter, D., Shaw, M. A., Halsall, J., Hopkins, P. Mutations in RYR1 in malignant hyperthermia and central core disease. Human Mutation. 27 (20), 977-989 (2006).
- Xu, L., et al. Ca2+ mediated activation of the skeletal muscle ryanodine receptor ion channel. Journal of Biological Chemistry. 293 (50), 19501-19509 (2018).
- Treves, S., et al. Alteration of intracellular Ca2+ transients in COS-7 cells transfected with the cDNA encoding skeletal-muscle ryanodine receptor carrying a mutation associated with malignant hyperthermia. Biochemical Journal. 301 (3), 661-665 (1994).
- Nakai, J., et al. Enhanced dihydropyridine receptor channel activity in the presence of ryanodine receptor. Nature. 389 (6569), 72-75 (1996).
- Durham, W. J., et al. RyR1 S-nitrosylation underlies environmental heat stroke and sudden death in Y522S RyR1 knockin mice. Cell. 133 (81), 53-65 (2008).
- Zvaritch, E., et al. Ca2+ dysregulation in Ryr1(I4895T/wt) mice causes congenital myopathy with progressive formation of minicores, cores, and nemaline rods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21813-21818 (2009).
- Elbaz, M., et al. Bi-allelic expression of the RyR1 p.A4329D mutation decreases muscle strength in slow-twitch muscles in mice. Journal of Biological Chemistry. 295, 10331-10339 (2020).
- Censier, K., Urwyler, A., Zorzato, F., Treves, S. Intracellular calcium homeostasis in human primary muscle cells from malignant hyperthermia susceptible and normal individuals. Journal of Clinical Investigations. 101 (6), 1233-1242 (1998).
- Girard, T., et al. B-lymphocytes from Malignant Hyperthermia-Susceptible patients have an increased sensitivity to skeletal muscle ryanodine receptor activators. Journal of Biological Chemistry. 276 (51), 48077 (2001).
- Ducreux, S., et al. Effect of ryanodine receptor mutations on interleukin-6 release and intracellular calcium homeostasis in human myotubes from Malignant Hyperthermia- Susceptible individuals and patients affected by Central Core Disease. Journal of Biological Chemistry. 279 (42), 43838-43846 (2004).
- Ducreux, S., et al. Functional properties of ryanodine receptors carrying three amino acid substitutions identified in patients affected by multi-minicore disease and central core disease, expressed in immortalized lymphocytes. Biochemical Journal. 395, 259-266 (2006).
- Tilgen, N., et al. Identification of four novel mutations in the C-terminal membrane spanning domain of the ryanodine receptor 1: association with central core disease and alteration of calcium homeostasis. Human Molecular Genetics. 10 (25), 2879-2887 (2001).
- Treves, S., et al. Enhanced excitation-coupled Ca2+ entry induces nuclear translocation of NFAT and contributes to IL-6 release from myotubes from patients with central core disease. Human Molecular Genetics. 20 (3), 589-600 (2011).
- Yasuda, T., et al. JP-45/JSRP1 variants affect skeletal muscle excitation contraction coupling by decreasing the sensitivity of the dihydropyridine receptor. Human Mutation. 34, 184-190 (2013).
- Sei, Y., Gallagher, K. L., Basile, A. S. Skeletal muscle ryanodine receptor is involved in calcium signaling in human B lymphocytes. Journal of Biological Chemistry. 274 (9), 5995-6062 (1999).
- Tegazzin, V., Scutari, E., Treves, S., Zorzato, F. Chlorocresol, an additive to commercial succinylcholine, induces contracture of human malignant Hyperthermia Susceptible muscles via activation of the ryanodine receptor Ca2+ channel. Anesthesiology. 84, 1275-1279 (1996).
- Kushnir, A., et al. Ryanodine receptor calcium leak in circulating B-lymphocytes as a biomarker for heart failure. Circulation. 138 (11), 1144-1154 (2018).
- Zullo, A., et al. Functional characterization of ryanodine receptor sequence variants using a metabolic assay in immortalized B-lymphocytes. Human Mutation. 30 (4), 575-590 (2009).
- Hoppe, K., et al. Hypermetabolism in B-lymphocytes from malignant hyperthermia susceptible individuals. Scientific Reports. 6, 33372 (2016).
- Monnier, N., et al. A homozygous splicing mutation causing a depletion of skeletal muscle RYR1 is associated with multi-minicore disease congenital myopathy with ophthalmoplegia. Human Molecular Genetics. 12, 1171-1178 (2003).
- Schartner, V., et al. Dihydropyridine receptor (DHPR, CACNA1S) congenital myopathy. Acta Neuropathologica. 133, 517-533 (2017).
- Ullrich, N. D., et al. Alterations of excitation-contraction coupling and excitation coupled Ca2+ entry in human myotubes carrying CAV3 mutations linked to rippling muscle disease. Human Mutation. 32, 1-9 (2010).
- Rokach, O., et al. Characterization of a human skeletal muscle- derived cell line: biochemical, cellular and electrophysiological characterization. Biochemical Journal. 455, 169-177 (2013).
- Zhou, H., et al. Characterization of RYR1 mutations in core myopathies. Human Molecular Genetics. 15, 2791-2803 (2006).
- Klinger, W., Baur, C., Georgieff, M., Lehmann-Horn, F., Melzer, W. Detection of proton release from cultured human myotubes to identify malignant hyperthermia susceptibility. Anesthesiology. 97, 1043-1056 (2002).
