Caracterização funcional de variantes ryr1 humanas expressas e endógenas
Summary
Aqui são descritos métodos usados para estudar o efeito funcional das mutações RYR1 expressas endógenamente no Vírus Epstein Barr, linfócitos B humanos e células de satélite derivadas da biópsia muscular diferenciadas em miótubos.
Abstract
Mais de 700 variantes do gene RYR1 foram identificadas em pacientes com diferentes distúrbios neuromusculares, incluindo suscetibilidade de hipertermia maligna, miopatias centrais e miopatia centronuclear. Devido aos diversos fenótipos ligados às mutações RYR1, é fundamental caracterizar seus efeitos funcionais para classificar variantes transportadas pelos pacientes para futuras intervenções terapêuticas e identificar variantes não patogênicas. Muitos laboratórios têm se interessado em desenvolver métodos para caracterizar funcionalmente mutações RYR1 expressas nas células dos pacientes. Essa abordagem tem inúmeras vantagens, incluindo: mutações são expressas endógenamente, RyR1 não é super-expressa, o uso de células expressas heterólogas RyR1 é evitado. No entanto, uma vez que os pacientes podem apresentar mutações em diferentes genes além do RYR1, é importante comparar os resultados de material biológico de indivíduos que abrigam a mesma mutação, com diferentes origens genéticas. O presente manuscrito descreve métodos desenvolvidos para estudar os efeitos funcionais das variantes ryr1 expressas endógenamente em: (a) O vírus Epstein Barr imortalizou linfócitos B humanos e (b) células satélites derivadas de biópsias musculares e diferenciadas em miotubes. Alterações na concentração intracelular de cálcio desencadeadas pela adição de ativadores RyR1 farmacológicos são então monitoradas. O tipo de célula selecionada é carregado com um indicador de cálcio fluorescente ratiométrico e alterações intracelulares [Ca2+] são monitoradas tanto no nível de célula única por microscopia de fluorescência ou em populações celulares usando um espectrômetro. As curvasde resposta à dose agonista são então comparadas entre células de controles saudáveis e pacientes que abrigam variantes RYR1 levando a uma visão sobre o efeito funcional de uma determinada variante.
Introduction
Até o momento, mais de 700 variantes RYR1 foram identificadas na população humana e ligadas a vários distúrbios neuromusculares, incluindo suscetibilidade de hipertermia maligna (SM), rabdomiólise induzida pelo exercício, doença central do núcleo (CCD), doença multi-minicore (TM), miopatia centronuclear (CNM)1,2,3 ; no entanto, estudos para caracterizar seus efeitos funcionais estão defasados e apenas aproximadamente 10% das mutações foram testadas funcionalmente. Diferentes abordagens experimentais podem ser usadas para avaliar o impacto de uma determinada variante RyR1, incluindo transfecção de células heterólogas como HEK293 e CÉLULAS CO-7 com codificação plasmida para o WT e mutante RYR1 cDNA4,5, transdução de fibroblastos de camundongos dispédicos com plasmídeos e vetores codificando para o WT e mutante RYR1 cDNA, seguido de transdução com mio-D e diferenciação em miotubes6 , geração de modelos animais transgênicos portadores de mutantes RyR1s7,8,9, caracterização de células de pacientes que expressam a variante RYR1 endndogenously10,11,12. Tais métodos ajudaram a estabelecer como diferentes mutações afetam funcionalmente o canal RyR1 Ca2+.
Aqui, são descritos métodos desenvolvidos para avaliar os efeitos funcionais das mutações RYR1. Vários parâmetros de homeostase intracelular de cálcio são investigados em células humanas expressando endógenamente o canal de cálcio RyR1, incluindo myotubes e Epstein Barr Virus (EBV) linfócitos Imortais. As células são obtidas de pacientes, expandidas na cultura e carregadas com indicadores de cálcio fluorescentes ratiométricos, como Fura-2 ou indo-1. Parâmetros que foram relatados para serem alterados por causa de mutações patogênicas RYR1, incluindo o repouso [Ca2+],a sensibilidade a diferentes agonistas farmacológicos e o tamanho das lojas intracelulares Ca2+ são medidos tanto no nível de célula única, usando microscopia de fluorescência, ou em populações de células usando um fluorímetro. Os resultados obtidos em células de portadores de mutação são então comparados aos obtidos de membros da família de controle saudável. Esta abordagem demonstrou que: (i) muitas mutações ligadas ao MHS levam a um aumento no repouso [Ca2+] e uma mudança para a esquerda na curva de resposta de dose para despolarização induzida por KCl ou ativação farmacológica RyR1 com 4-cloro-m-cresol10,11,12,13; (ii) mutações ligadas ao CCD levam a uma diminuição no pico [Ca2+] liberado pela ativação farmacológica do RyR1 e diminuição do tamanho se o Ca2+ intracelular armazena12,13,14,15; (iii) algumas variantes não impactam a homeostase Ca2+13. As vantagens dessa abordagem experimental são: a proteína RyR1 não é superfostinada e os níveis fisiológicos estão presentes, as células podem ser imortalizadas (tanto células musculares quanto linfócitos B) fornecendo linhas celulares contendo mutações. Algumas desvantagens dizem respeito ao fato de que os pacientes podem carregar mutações em mais de um gene codificando proteínas envolvidas na homeostase de cálcio e/ou acoplamento de contração de excitação (ECC) e isso pode complicar conclusões experimentais. Por exemplo, duas variantes JP-45 foram identificadas na população de CONTROLE e sua presença e sua presença foi demonstrada para impactar a sensibilidade do receptor de dihidropyridina (DHPR) à ativação16. Os pacientes precisam estar disponíveis, o material biológico precisa ser coletado recentemente e as licenças éticas precisam ser obtidas nos conselhos éticos locais.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os protocolos descritos neste artigo foram utilizados com sucesso por vários laboratórios para estudar o impacto das mutações RYR1 na homeostase do cálcio. As etapas críticas das abordagens descritas neste artigo tratam da esterilidade, habilidades e técnicas de cultivo celular e disponibilidade de material biológico. Em princípio, o uso de linfócitos B imortalizados pelo EBV é mais simples e permite gerar linhas celulares contendo canais mutantes RyR1. As células podem ser congeladas e armazenadas em nitrog?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O trabalho descrito neste manuscrito foi apoiado por subsídios da Fundação Nacional de Ciência da Suíça (SNF) e da Fundação Suíça de Músculos.
Materials
| 4-chloro-m-cresol | Fluka | 24940 | |
| Blood collection tubes | Sarstedt | 172202 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| caffeine | Merk | 102584 | |
| Cascade 125+ CCD camera | Photometrics | ||
| Cascade 128+ CCD | Photometrics | ||
| Creatine | Sigma-Aldrich | C-3630 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMSO | Sigma | 41639 | |
| EGTA | Fluka | 3778 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ficoll Paque | Cytiva | 17144002 | |
| Foetal calf serum | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Fura-2/AM | Invitrogen Life Sciences | F1201 | |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630049 | |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050122 | |
| Insulin | ThermoFisher Scientific | A11382II | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| Lanthanum | Fluka | 61490 | |
| Microperfusion system | ALA-Scientific | DAD VM 12 valve manifold | |
| Origin Software | OriginLab Corp | Software | |
| Pennicillin/Streptomycin | Gibco Life Sciences | 15140-122 | |
| Perfusion chamber POC-R | Pecon | 000000-1116-079 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | ThermoFisher Scientific | 21875091 | |
| Spectrofluorimeter | Perkin Elmer | LS50 | |
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | |
| Tissue culture dishes | Falcon | 353046 | |
| Tissue culture flask | Falcon | 353107 | |
| Tissue culture inserts | Falcon | 353090 | |
| Trypsin/EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300054 | |
| Visiview | Visitron Systems GmbH | Software | |
| Zeiss Axiovert S100 TV microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss glass coverslips | Carl Zeiss AG | 0727-016 |
References
- Dlamini, N., et al. Mutations in RYR1 are a common cause of exertional myalgia and rhabdomyolysis. Neuromuscular Disorders. 23 (7), 540-548 (2013).
- Klein, A., et al. Clinical and genetic findings in a large cohort of patients with ryanodine receptor 1 gene-associated myopathies. Human Mutation. 33, 981-988 (2012).
- Robinson, R., Carpenter, D., Shaw, M. A., Halsall, J., Hopkins, P. Mutations in RYR1 in malignant hyperthermia and central core disease. Human Mutation. 27 (20), 977-989 (2006).
- Xu, L., et al. Ca2+ mediated activation of the skeletal muscle ryanodine receptor ion channel. Journal of Biological Chemistry. 293 (50), 19501-19509 (2018).
- Treves, S., et al. Alteration of intracellular Ca2+ transients in COS-7 cells transfected with the cDNA encoding skeletal-muscle ryanodine receptor carrying a mutation associated with malignant hyperthermia. Biochemical Journal. 301 (3), 661-665 (1994).
- Nakai, J., et al. Enhanced dihydropyridine receptor channel activity in the presence of ryanodine receptor. Nature. 389 (6569), 72-75 (1996).
- Durham, W. J., et al. RyR1 S-nitrosylation underlies environmental heat stroke and sudden death in Y522S RyR1 knockin mice. Cell. 133 (81), 53-65 (2008).
- Zvaritch, E., et al. Ca2+ dysregulation in Ryr1(I4895T/wt) mice causes congenital myopathy with progressive formation of minicores, cores, and nemaline rods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21813-21818 (2009).
- Elbaz, M., et al. Bi-allelic expression of the RyR1 p.A4329D mutation decreases muscle strength in slow-twitch muscles in mice. Journal of Biological Chemistry. 295, 10331-10339 (2020).
- Censier, K., Urwyler, A., Zorzato, F., Treves, S. Intracellular calcium homeostasis in human primary muscle cells from malignant hyperthermia susceptible and normal individuals. Journal of Clinical Investigations. 101 (6), 1233-1242 (1998).
- Girard, T., et al. B-lymphocytes from Malignant Hyperthermia-Susceptible patients have an increased sensitivity to skeletal muscle ryanodine receptor activators. Journal of Biological Chemistry. 276 (51), 48077 (2001).
- Ducreux, S., et al. Effect of ryanodine receptor mutations on interleukin-6 release and intracellular calcium homeostasis in human myotubes from Malignant Hyperthermia- Susceptible individuals and patients affected by Central Core Disease. Journal of Biological Chemistry. 279 (42), 43838-43846 (2004).
- Ducreux, S., et al. Functional properties of ryanodine receptors carrying three amino acid substitutions identified in patients affected by multi-minicore disease and central core disease, expressed in immortalized lymphocytes. Biochemical Journal. 395, 259-266 (2006).
- Tilgen, N., et al. Identification of four novel mutations in the C-terminal membrane spanning domain of the ryanodine receptor 1: association with central core disease and alteration of calcium homeostasis. Human Molecular Genetics. 10 (25), 2879-2887 (2001).
- Treves, S., et al. Enhanced excitation-coupled Ca2+ entry induces nuclear translocation of NFAT and contributes to IL-6 release from myotubes from patients with central core disease. Human Molecular Genetics. 20 (3), 589-600 (2011).
- Yasuda, T., et al. JP-45/JSRP1 variants affect skeletal muscle excitation contraction coupling by decreasing the sensitivity of the dihydropyridine receptor. Human Mutation. 34, 184-190 (2013).
- Sei, Y., Gallagher, K. L., Basile, A. S. Skeletal muscle ryanodine receptor is involved in calcium signaling in human B lymphocytes. Journal of Biological Chemistry. 274 (9), 5995-6062 (1999).
- Tegazzin, V., Scutari, E., Treves, S., Zorzato, F. Chlorocresol, an additive to commercial succinylcholine, induces contracture of human malignant Hyperthermia Susceptible muscles via activation of the ryanodine receptor Ca2+ channel. Anesthesiology. 84, 1275-1279 (1996).
- Kushnir, A., et al. Ryanodine receptor calcium leak in circulating B-lymphocytes as a biomarker for heart failure. Circulation. 138 (11), 1144-1154 (2018).
- Zullo, A., et al. Functional characterization of ryanodine receptor sequence variants using a metabolic assay in immortalized B-lymphocytes. Human Mutation. 30 (4), 575-590 (2009).
- Hoppe, K., et al. Hypermetabolism in B-lymphocytes from malignant hyperthermia susceptible individuals. Scientific Reports. 6, 33372 (2016).
- Monnier, N., et al. A homozygous splicing mutation causing a depletion of skeletal muscle RYR1 is associated with multi-minicore disease congenital myopathy with ophthalmoplegia. Human Molecular Genetics. 12, 1171-1178 (2003).
- Schartner, V., et al. Dihydropyridine receptor (DHPR, CACNA1S) congenital myopathy. Acta Neuropathologica. 133, 517-533 (2017).
- Ullrich, N. D., et al. Alterations of excitation-contraction coupling and excitation coupled Ca2+ entry in human myotubes carrying CAV3 mutations linked to rippling muscle disease. Human Mutation. 32, 1-9 (2010).
- Rokach, O., et al. Characterization of a human skeletal muscle- derived cell line: biochemical, cellular and electrophysiological characterization. Biochemical Journal. 455, 169-177 (2013).
- Zhou, H., et al. Characterization of RYR1 mutations in core myopathies. Human Molecular Genetics. 15, 2791-2803 (2006).
- Klinger, W., Baur, C., Georgieff, M., Lehmann-Horn, F., Melzer, W. Detection of proton release from cultured human myotubes to identify malignant hyperthermia susceptibility. Anesthesiology. 97, 1043-1056 (2002).
