Caratterizzazione funzionale di varianti RYR1 umane espresse endogenamente
Summary
Qui vengono descritti i metodi utilizzati per studiare l’effetto funzionale delle mutazioni RYR1 endogenamente espresse nel virus di Epstein Barr immortalato nei linfociti B umani e nelle cellule satelliti derivate dalla biopsia muscolare differenziate in miotubi.
Abstract
Più di 700 varianti del gene RYR1 sono state identificate in pazienti con diversi disturbi neuromuscolari tra cui suscettibilità all’ipertermia maligna, miopatie core e miopatia centronucleare. A causa dei diversi fenotipi legati alle mutazioni RYR1 è fondamentale caratterizzare i loro effetti funzionali per classificare le varianti trasportate dai pazienti per futuri interventi terapeutici e identificare le varianti non patogene. Molti laboratori sono stati interessati a sviluppare metodi per caratterizzare funzionalmente le mutazioni RYR1 espresse nelle cellule dei pazienti. Questo approccio presenta numerosi vantaggi, tra cui: le mutazioni sono espresse endogenamente, RyR1 non è sovraespresso, l’uso di cellule eterologhe che esprimono RyR1 è evitato. Tuttavia, poiché i pazienti possono presentare mutazioni in geni diversi oltre a RYR1, è importante confrontare i risultati di materiale biologico di individui che ospitano la stessa mutazione, con background genetici diversi. Il presente manoscritto descrive i metodi sviluppati per studiare gli effetti funzionali delle varianti RYR1 espresse endogenamente in: (a) il virus di Epstein Barr ha immortalato i linfociti B umani e (b) le cellule satelliti derivate da biopsie muscolari e differenziate in miotubi. Vengono quindi monitorate le variazioni della concentrazione intracellulare di calcio innescate dall’aggiunta di un attivatore RyR1 farmacologico. Il tipo di cellula selezionato viene caricato con un indicatore di calcio fluorescente raziometrico e le variazioni intracellulari [Ca2+] vengono monitorate a livello di singola cellula mediante microscopia a fluorescenza o in popolazioni cellulari utilizzando uno spettrofluorometro. Le curve di risposta alla dose agonista [Ca2+], a riposo vengono quindi confrontate tra cellule provenienti da controlli sani e pazienti che ospitano varianti RYR1 portando a comprendere l’effetto funzionale di una determinata variante.
Introduction
Ad oggi sono state identificate più di 700 varianti di RYR1 nella popolazione umana e legate a vari disturbi neuromuscolari tra cui la suscettibilità all’ipertermia maligna (MHS), la rabdomiolisi indotta dall’esercizio, la malattia del nucleo centrale (CCD), la malattia multi-minicore (MmD), la miopatia centronucleare (CNM)1,2,3 ; tuttavia, gli studi per caratterizzare i loro effetti funzionali sono in ritardo e solo circa il 10% delle mutazioni sono state testate funzionalmente. Diversi approcci sperimentali possono essere utilizzati per valutare l’impatto di una data variante di RyR1, compresa la trasfezione di cellule eterologhe come cellule HEK293 e COS-7 con plasmide che codifica per il WT e mutante RYR1 cDNA4,5, trasduzione di fibroblasti di topo dispedici con plasmidi e vettori che codificano per il WT e il cDNA RYR1 mutante, seguita da trasduzione con mio-D e differenziazione in miotubi6 , generazione di modelli animali transgenici portatori mutanti RyR1s7,8,9,caratterizzazione di cellule da pazienti che esprimono la variante RYR1 endogenamente10,11,12. Tali metodi hanno contribuito a stabilire come diverse mutazioni influiscano funzionalmente sul canale RyR1 Ca2+.
Qui vengono descritti i metodi sviluppati per valutare gli effetti funzionali delle mutazioni RYR1. Vari parametri dell’omeostasi intracellulare del calcio sono studiati nelle cellule umane che esprimono endogenamente il canale del calcio RyR1, compresi i miotubi e i linfociti B immortalati del virus di Epstein Barr (EBV). Le cellule sono ottenute da pazienti, espanse in coltura e caricate con indicatori di calcio fluorescenti raziometrici come Fura-2 o indo-1. I parametri che sono stati segnalati per essere alterati a causa di mutazioni patogenetiche di RYR1 tra cui il riposo [Ca2+],la sensibilità a diversi agonisti farmacologici e la dimensione delle riserve intracellulari di Ca2+ sono misurati a livello di singola cellula, usando la microscopia a fluorescenza, o in popolazioni cellulari usando un fluorimetro. I risultati ottenuti in cellule da portatori di mutazioni vengono quindi confrontati con quelli ottenuti da membri sani della famiglia di controllo. Questo approccio ha dimostrato che: (i) molte mutazioni legate alla MHS portano ad un aumento del riposo [Ca2+]e ad uno spostamento a sinistra nella curva dose-risposta alla depolarizzazione indotta da KCl o all’attivazione farmacologica di RyR1 con 4-cloro-m-cresolo10,11,12,13; (ii) le mutazioni legate alla CCD portano ad una diminuzione del picco [Ca2+] rilasciato dall’attivazione farmacologica del RyR1 e alla diminuzione delle dimensioni se il Ca2+ intracellulare immagazzina12,13,14,15; (iii) alcune varianti non influiscono sull’omeostasi del Ca2+13. I vantaggi di questo approccio sperimentale sono: la proteina RyR1 non è sovraespressa e sono presenti livelli fisiologici, le cellule possono essere immortalate (sia cellule muscolari che linfociti B) fornendo linee cellulari contenenti mutazioni. Alcuni svantaggi riguardano il fatto che i pazienti possono portare mutazioni in più di un gene che codifica per proteine coinvolte nell’omeostasi del calcio e/o nell’accoppiamento di contrazione dell’eccitazione (ECC) e questo può complicare le conclusioni sperimentali. Ad esempio, due varianti di JP-45 sono state identificate nella mhS e nella popolazione di controllo e la loro presenza ha dimostrato di influire sulla sensibilità del recettore della diidropiridina (DHPR) all’attivazione16. I pazienti devono essere disponibili, il materiale biologico deve essere appena raccolto e i permessi etici devono essere ottenuti dai comitati etici locali.
Protocol
Representative Results
Discussion
I protocolli descritti in questo articolo sono stati utilizzati con successo da diversi laboratori per studiare l’impatto delle mutazioni RYR1 sull’omeostasi del calcio. I passaggi critici degli approcci delineati in questo documento riguardano la sterilità, le capacità e le tecniche di coltivazione cellulare e la disponibilità di materiale biologico. In linea di principio, l’uso di linfociti B immortalizzati EBV è più semplice e consente di generare linee cellulari contenenti canali RyR1 mutanti. Le cellule possono…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro descritto in questo manoscritto è stato sostenuto da sovvenzioni del Fondo nazionale svizzero (FNS) e della Fondazione svizzera per i muscoli.
Materials
| 4-chloro-m-cresol | Fluka | 24940 | |
| Blood collection tubes | Sarstedt | 172202 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| caffeine | Merk | 102584 | |
| Cascade 125+ CCD camera | Photometrics | ||
| Cascade 128+ CCD | Photometrics | ||
| Creatine | Sigma-Aldrich | C-3630 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMSO | Sigma | 41639 | |
| EGTA | Fluka | 3778 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ficoll Paque | Cytiva | 17144002 | |
| Foetal calf serum | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Fura-2/AM | Invitrogen Life Sciences | F1201 | |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630049 | |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050122 | |
| Insulin | ThermoFisher Scientific | A11382II | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| Lanthanum | Fluka | 61490 | |
| Microperfusion system | ALA-Scientific | DAD VM 12 valve manifold | |
| Origin Software | OriginLab Corp | Software | |
| Pennicillin/Streptomycin | Gibco Life Sciences | 15140-122 | |
| Perfusion chamber POC-R | Pecon | 000000-1116-079 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | ThermoFisher Scientific | 21875091 | |
| Spectrofluorimeter | Perkin Elmer | LS50 | |
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | |
| Tissue culture dishes | Falcon | 353046 | |
| Tissue culture flask | Falcon | 353107 | |
| Tissue culture inserts | Falcon | 353090 | |
| Trypsin/EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300054 | |
| Visiview | Visitron Systems GmbH | Software | |
| Zeiss Axiovert S100 TV microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss glass coverslips | Carl Zeiss AG | 0727-016 |
References
- Dlamini, N., et al. Mutations in RYR1 are a common cause of exertional myalgia and rhabdomyolysis. Neuromuscular Disorders. 23 (7), 540-548 (2013).
- Klein, A., et al. Clinical and genetic findings in a large cohort of patients with ryanodine receptor 1 gene-associated myopathies. Human Mutation. 33, 981-988 (2012).
- Robinson, R., Carpenter, D., Shaw, M. A., Halsall, J., Hopkins, P. Mutations in RYR1 in malignant hyperthermia and central core disease. Human Mutation. 27 (20), 977-989 (2006).
- Xu, L., et al. Ca2+ mediated activation of the skeletal muscle ryanodine receptor ion channel. Journal of Biological Chemistry. 293 (50), 19501-19509 (2018).
- Treves, S., et al. Alteration of intracellular Ca2+ transients in COS-7 cells transfected with the cDNA encoding skeletal-muscle ryanodine receptor carrying a mutation associated with malignant hyperthermia. Biochemical Journal. 301 (3), 661-665 (1994).
- Nakai, J., et al. Enhanced dihydropyridine receptor channel activity in the presence of ryanodine receptor. Nature. 389 (6569), 72-75 (1996).
- Durham, W. J., et al. RyR1 S-nitrosylation underlies environmental heat stroke and sudden death in Y522S RyR1 knockin mice. Cell. 133 (81), 53-65 (2008).
- Zvaritch, E., et al. Ca2+ dysregulation in Ryr1(I4895T/wt) mice causes congenital myopathy with progressive formation of minicores, cores, and nemaline rods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21813-21818 (2009).
- Elbaz, M., et al. Bi-allelic expression of the RyR1 p.A4329D mutation decreases muscle strength in slow-twitch muscles in mice. Journal of Biological Chemistry. 295, 10331-10339 (2020).
- Censier, K., Urwyler, A., Zorzato, F., Treves, S. Intracellular calcium homeostasis in human primary muscle cells from malignant hyperthermia susceptible and normal individuals. Journal of Clinical Investigations. 101 (6), 1233-1242 (1998).
- Girard, T., et al. B-lymphocytes from Malignant Hyperthermia-Susceptible patients have an increased sensitivity to skeletal muscle ryanodine receptor activators. Journal of Biological Chemistry. 276 (51), 48077 (2001).
- Ducreux, S., et al. Effect of ryanodine receptor mutations on interleukin-6 release and intracellular calcium homeostasis in human myotubes from Malignant Hyperthermia- Susceptible individuals and patients affected by Central Core Disease. Journal of Biological Chemistry. 279 (42), 43838-43846 (2004).
- Ducreux, S., et al. Functional properties of ryanodine receptors carrying three amino acid substitutions identified in patients affected by multi-minicore disease and central core disease, expressed in immortalized lymphocytes. Biochemical Journal. 395, 259-266 (2006).
- Tilgen, N., et al. Identification of four novel mutations in the C-terminal membrane spanning domain of the ryanodine receptor 1: association with central core disease and alteration of calcium homeostasis. Human Molecular Genetics. 10 (25), 2879-2887 (2001).
- Treves, S., et al. Enhanced excitation-coupled Ca2+ entry induces nuclear translocation of NFAT and contributes to IL-6 release from myotubes from patients with central core disease. Human Molecular Genetics. 20 (3), 589-600 (2011).
- Yasuda, T., et al. JP-45/JSRP1 variants affect skeletal muscle excitation contraction coupling by decreasing the sensitivity of the dihydropyridine receptor. Human Mutation. 34, 184-190 (2013).
- Sei, Y., Gallagher, K. L., Basile, A. S. Skeletal muscle ryanodine receptor is involved in calcium signaling in human B lymphocytes. Journal of Biological Chemistry. 274 (9), 5995-6062 (1999).
- Tegazzin, V., Scutari, E., Treves, S., Zorzato, F. Chlorocresol, an additive to commercial succinylcholine, induces contracture of human malignant Hyperthermia Susceptible muscles via activation of the ryanodine receptor Ca2+ channel. Anesthesiology. 84, 1275-1279 (1996).
- Kushnir, A., et al. Ryanodine receptor calcium leak in circulating B-lymphocytes as a biomarker for heart failure. Circulation. 138 (11), 1144-1154 (2018).
- Zullo, A., et al. Functional characterization of ryanodine receptor sequence variants using a metabolic assay in immortalized B-lymphocytes. Human Mutation. 30 (4), 575-590 (2009).
- Hoppe, K., et al. Hypermetabolism in B-lymphocytes from malignant hyperthermia susceptible individuals. Scientific Reports. 6, 33372 (2016).
- Monnier, N., et al. A homozygous splicing mutation causing a depletion of skeletal muscle RYR1 is associated with multi-minicore disease congenital myopathy with ophthalmoplegia. Human Molecular Genetics. 12, 1171-1178 (2003).
- Schartner, V., et al. Dihydropyridine receptor (DHPR, CACNA1S) congenital myopathy. Acta Neuropathologica. 133, 517-533 (2017).
- Ullrich, N. D., et al. Alterations of excitation-contraction coupling and excitation coupled Ca2+ entry in human myotubes carrying CAV3 mutations linked to rippling muscle disease. Human Mutation. 32, 1-9 (2010).
- Rokach, O., et al. Characterization of a human skeletal muscle- derived cell line: biochemical, cellular and electrophysiological characterization. Biochemical Journal. 455, 169-177 (2013).
- Zhou, H., et al. Characterization of RYR1 mutations in core myopathies. Human Molecular Genetics. 15, 2791-2803 (2006).
- Klinger, W., Baur, C., Georgieff, M., Lehmann-Horn, F., Melzer, W. Detection of proton release from cultured human myotubes to identify malignant hyperthermia susceptibility. Anesthesiology. 97, 1043-1056 (2002).
