अंतर्जात रूप से व्यक्त मानव RYR1 वेरिएंट के कार्यात्मक लक्षण वर्णन
Summary
यहां एपस्टीन बार वायरस में अंतर्जात रूप से व्यक्त किए गए आरवाईआर 1 उत्परिवर्तन के कार्यात्मक प्रभाव का अध्ययन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले तरीकों ने मानव बी-लिम्फोसाइट्स को अमर कर दिया और मांसपेशियों की बायोप्सी व्युत्पन्न उपग्रह कोशिकाओं को मायोट्यूब में विभेदित किया गया।
Abstract
RYR1 जीन में 700 से अधिक वेरिएंट की पहचान विभिन्न न्यूरोमस्कुलर विकारों वाले रोगियों में की गई है, जिनमें घातक हाइपरथर्मिया संवेदनशीलता, कोर मायोपैथी और सेंट्रोन्यूक्लियर मायोपैथी शामिल हैं। आरवाईआर 1 उत्परिवर्तन से जुड़े विभिन्न फेनोटाइप्स के कारण भविष्य के चिकित्सीय हस्तक्षेपों के लिए रोगियों द्वारा किए गए वेरिएंट को वर्गीकृत करने और गैर-रोगजनक वेरिएंट की पहचान करने के लिए उनके कार्यात्मक प्रभावों को चिह्नित करना मौलिक है। कई प्रयोगशालाएं रोगियों की कोशिकाओं में व्यक्त RYR1 उत्परिवर्तन को कार्यात्मक रूप से चिह्नित करने के तरीकों को विकसित करने में रुचि रखती हैं। इस दृष्टिकोण के कई फायदे हैं, जिनमें शामिल हैं: उत्परिवर्तन अंतर्जात रूप से व्यक्त किए जाते हैं, RyR1 को अधिक व्यक्त नहीं किया जाता है, हेटरोलॉगस RyR1 व्यक्त कोशिकाओं के उपयोग से बचा जाता है। हालांकि, चूंकि रोगी आरवाईआर 1 के अलावा विभिन्न जीनों में उत्परिवर्तन प्रस्तुत कर सकते हैं, इसलिए विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि के साथ एक ही उत्परिवर्तन को आश्रय देने वाले व्यक्तियों से जैविक सामग्री के परिणामों की तुलना करना महत्वपूर्ण है। वर्तमान पांडुलिपि अंतर्जात रूप से व्यक्त RYR1 वेरिएंट के कार्यात्मक प्रभावों का अध्ययन करने के लिए विकसित तरीकों का वर्णन करती है: (ए) एपस्टीन बार वायरस ने मानव बी-लिम्फोसाइट्स को अमर कर दिया और (बी) मांसपेशियों की बायोप्सी से व्युत्पन्न उपग्रह कोशिकाओं और मायोट्यूब में विभेदित किया। इंट्रासेल्युलर कैल्शियम एकाग्रता में परिवर्तन एक औषधीय RyR1 activators के अलावा द्वारा ट्रिगर तो निगरानी कर रहे हैं. चयनित सेल प्रकार एक ratiometric फ्लोरोसेंट कैल्शियम संकेतक और intracellular [Ca2+]परिवर्तन के साथ भरी हुई है या तो प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी द्वारा एकल सेल स्तर पर या एक स्पेक्ट्र फ्लोरोमीटर का उपयोग कर सेल आबादी में निगरानी की जाती है। आराम [सीए2 +],एगोनिस्ट खुराक प्रतिक्रिया घटता तब स्वस्थ नियंत्रण से कोशिकाओं और RYR1 वेरिएंट harboring रोगियों के बीच तुलना कर रहे हैं एक दिए गए संस्करण के कार्यात्मक प्रभाव में अंतर्दृष्टि के लिए अग्रणी.
Introduction
आज तक मानव आबादी में 700 से अधिक RYR1 वेरिएंट की पहचान की गई है और घातक हाइपरथर्मिया संवेदनशीलता (MHS), व्यायाम प्रेरित rhabdomyolysis, केंद्रीय कोर रोग (सीसीडी), मल्टी-मिनीकोर रोग (MmD), सेंट्रोन्यूक्लियर मायोपैथी (CNM)1,2,3 सहित विभिन्न न्यूरोमस्कुलर विकारों से जुड़ा हुआ है ; फिर भी, उनके कार्यात्मक प्रभावों को चिह्नित करने के लिए अध्ययन पिछड़ रहे हैं और केवल लगभग 10% उत्परिवर्तनों का कार्यात्मक रूप से परीक्षण किया गया है। किसी दिए गए RyR1 संस्करण के प्रभाव का आकलन करने के लिए विभिन्न प्रयोगात्मक दृष्टिकोणों का उपयोग किया जा सकता है, जिसमें हेटरोलॉगस कोशिकाओं जैसे HEK293 और COS-7 कोशिकाओं का अभिकर्मक WT और उत्परिवर्ती RYR1 cDNA4,5केलिए प्लास्मिड एन्कोडिंग के साथ प्लास्मिड और वैक्टर एन्कोडिंग के साथ डिस्पेडिक माउस फाइब्रोब्लास्ट्स का ट्रांसडक्शन शामिल है, इसके बाद मायो-डी के साथ ट्रांसडक्शन और मायोट्यूब में भेदभाव6 , उत्परिवर्ती RyR1s 7 ,8,9को ले जाने वाले ट्रांसजेनिक पशुमॉडलोंका उत्पादन , RYR1 संस्करण अंतर्जात रूप से10 , 11,12को व्यक्त करने वाले रोगियों से कोशिकाओं का लक्षण वर्णन . इस तरह के तरीकों ने यह स्थापित करने में मदद की है कि विभिन्न उत्परिवर्तन कार्यात्मक रूप से RyR1 Ca2 + चैनल को कैसे प्रभावित करते हैं।
यहां, RYR1 उत्परिवर्तन के कार्यात्मक प्रभावों का आकलन करने के लिए विकसित तरीकों का वर्णन किया गया है। इंट्रासेल्युलर कैल्शियम होमोस्टैसिस के विभिन्न मापदंडों की जांच मानव कोशिकाओं में अंतर्जात रूप से RyR1 कैल्शियम चैनल को व्यक्त करते हुए की जाती है, जिसमें मायोट्यूब और एपस्टीन बार वायरस (ईबीवी) अमर बी-लिम्फोसाइट्स शामिल हैं। कोशिकाओं को रोगियों से प्राप्त किया जाता है, संस्कृति में विस्तारित किया जाता है और रेशियोमेट्रिक फ्लोरोसेंट कैल्शियम इंडिक्टर जैसे कि फुरा -2 या इंडो -1 के साथ लोड किया जाता है। जिन मापदंडों को रोगजनक RYR1 उत्परिवर्तन के कारण परिवर्तित होने की सूचना दी गई है, जिसमें आराम करना [Ca2+]शामिल है, विभिन्न औषधीय एगोनिस्टों के प्रति संवेदनशीलता और इंट्रासेल्युलर Ca2 + स्टोर के आकार को या तो एकल सेल स्तर पर मापा जाता है, प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके, या एक फ्लोरिमीटर का उपयोग करके सेल आबादी में। उत्परिवर्तन वाहक से कोशिकाओं में प्राप्त परिणामों की तुलना तब स्वस्थ नियंत्रण परिवार के सदस्यों से प्राप्त लोगों से की जाती है। इस दृष्टिकोण ने प्रदर्शित किया है कि: (i) एमएचएस से जुड़े कई उत्परिवर्तन आराम में वृद्धि का कारण बनते हैं [सीए2+]और खुराक प्रतिक्रिया वक्र में बाईं ओर एक बदलाव या तो KCl-प्रेरित विध्रुवीकरण या औषधीय RyR1 सक्रियण के साथ 4-क्लोरो-एम-क्रेसोल10,11,12,13; (ii) सीसीडी से जुड़े उत्परिवर्तन ों से RyR1 के औषधीय सक्रियण द्वारा जारी शिखर [Ca2+]में कमी आती है और यदि इंट्रासेल्युलरCa2+ 12, 13, 14,15संग्रहीत करता है तो आकार में कमी आती है; (iii) कुछ प्रकार Ca2+ होमोस्टैसिस13को प्रभावित नहीं करते हैं। इस प्रयोगात्मक दृष्टिकोण के फायदे हैं: RyR1 प्रोटीन अधिक व्यक्त नहीं किया गया है और शारीरिक स्तर मौजूद हैं, कोशिकाओं को अमर किया जा सकता है (मांसपेशियों की कोशिकाओं और बी-लिम्फोसाइट्स दोनों) उत्परिवर्तन युक्त सेल लाइनों को प्रदान करते हैं। कुछ नुकसान इस तथ्य से संबंधित हैं कि रोगी कैल्शियम होमोस्टैसिस और / या उत्तेजना संकुचन युग्मन (ईसीसी) में शामिल एक से अधिक जीन एन्कोडिंग प्रोटीन में उत्परिवर्तन ले जा सकते हैं और यह प्रयोगात्मक निष्कर्षों को जटिल बना सकता है। उदाहरण के लिए, एमएचएस और नियंत्रण जनसंख्या में दो जेपी -45 वेरिएंट की पहचान की गई थी और उनकी उपस्थिति को सक्रियण16के लिए डाइहाइड्रोपायरिडीन रिसेप्टर (डीएचपीआर) की संवेदनशीलता को प्रभावित करने के लिए दिखाया गया था। रोगियों को उपलब्ध होने की आवश्यकता है, जैविक सामग्री को ताजा एकत्र करने की आवश्यकता है और स्थानीय नैतिक बोर्डों से नैतिक परमिट प्राप्त करने की आवश्यकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पेपर में वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कई प्रयोगशालाओं द्वारा कैल्शियम होमियोस्टैसिस पर RYR1 उत्परिवर्तन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए सफलतापूर्वक किया गया है। इस पेपर में उल्लिखित दृष्टिकोणों के मह?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस पांडुलिपि में वर्णित कार्य स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन (एसएनएफ) और स्विस मसल फाउंडेशन से अनुदान द्वारा समर्थित था।
Materials
| 4-chloro-m-cresol | Fluka | 24940 | |
| Blood collection tubes | Sarstedt | 172202 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| caffeine | Merk | 102584 | |
| Cascade 125+ CCD camera | Photometrics | ||
| Cascade 128+ CCD | Photometrics | ||
| Creatine | Sigma-Aldrich | C-3630 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMSO | Sigma | 41639 | |
| EGTA | Fluka | 3778 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ficoll Paque | Cytiva | 17144002 | |
| Foetal calf serum | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Fura-2/AM | Invitrogen Life Sciences | F1201 | |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630049 | |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050122 | |
| Insulin | ThermoFisher Scientific | A11382II | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| Lanthanum | Fluka | 61490 | |
| Microperfusion system | ALA-Scientific | DAD VM 12 valve manifold | |
| Origin Software | OriginLab Corp | Software | |
| Pennicillin/Streptomycin | Gibco Life Sciences | 15140-122 | |
| Perfusion chamber POC-R | Pecon | 000000-1116-079 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | ThermoFisher Scientific | 21875091 | |
| Spectrofluorimeter | Perkin Elmer | LS50 | |
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | |
| Tissue culture dishes | Falcon | 353046 | |
| Tissue culture flask | Falcon | 353107 | |
| Tissue culture inserts | Falcon | 353090 | |
| Trypsin/EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300054 | |
| Visiview | Visitron Systems GmbH | Software | |
| Zeiss Axiovert S100 TV microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss glass coverslips | Carl Zeiss AG | 0727-016 |
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