Здесь описаны методы, используемые для изучения функционального эффекта мутаций RYR1, эндогенно экспрессируемых в вирусе Эпштейна Барра, увековеченных В-лимфоцитах человека и биопсии мышц, полученных из клеток-сателлитов, дифференцированных в миотрубы.
Более 700 вариантов гена RYR1 были идентифицированы у пациентов с различными нервно-мышечными расстройствами, включая восприимчивость к злокачественной гипертермии, основные миопатии и центроядерную миопатию. Из-за различных фенотипов, связанных с мутациями RYR1, крайне важно охарактеризовать их функциональные эффекты, чтобы классифицировать варианты, переносимые пациентами для будущих терапевтических вмешательств, и идентифицировать непатогенные варианты. Многие лаборатории были заинтересованы в разработке методов функциональной характеристики мутаций RYR1, экспрессируемых в клетках пациентов. Такой подход имеет многочисленные преимущества, в том числе: мутации эндогенно экспрессируются, RyR1 не переэкспрессируется, использование гетерологичных клеток, экспрессирующих RyR1, избегается. Однако, поскольку у пациентов могут присутствовать мутации в разных генах, кроме RYR1, важно сравнивать результаты биологического материала от людей, имеющих одну и ту же мутацию, с разным генетическим фоном. В настоящей рукописи описаны методы, разработанные для изучения функциональных эффектов эндогенно экспрессированных вариантов RYR1 в: (а) вирус Эпштейна Барра увековечил человеческие В-лимфоциты и (б) клетки-сателлиты, полученные из биопсии мышц и дифференцированные в миотрубы. Затем контролируют изменения внутриклеточной концентрации кальция, вызванные добавлением фармакологических активаторов RyR1. Выбранный тип клеток нагружается ратиометрическим флуоресцентным индикатором кальция, а внутриклеточные [Ca2+] изменения контролируются либо на уровне одной клетки с помощью флуоресцентной микроскопии, либо в клеточных популяциях с использованием спектрофлуорометра. Затем кривые реакции агониста агониста в состоянии покоя [Ca2+]сравниваются между клетками здорового контроля и пациентами, имеющими варианты RYR1, что приводит к пониманию функционального эффекта данного варианта.
На сегодняшний день более 700 вариантов RYR1 были идентифицированы в человеческой популяции и связаны с различными нервно-мышечными расстройствами, включая восприимчивость к злокачественной гипертермии (MHS), рабдомиолиз, индуцированный физической нагрузкой, заболевание центрального ядра (CCD), многомикровое заболевание (MmD), центроядерную миопатию (CNM)1,2,3 ; тем не менее, исследования по характеристике их функциональных эффектов отстают, и только около 10% мутаций были протестированы функционально. Различные экспериментальные подходы могут быть использованы для оценки влияния данного варианта RyR1, включая трансфекцию гетерологичных клеток, таких как HEK293 и КЛЕТКИ COS-7 с плазмидным кодированием для WT и мутантной КДНК RYR14,5,трансдукцию диспедических фибробластов мышей с плазмидами и векторами, кодирующими WT и мутантную кДНК RYR1, с последующей трансдукцией с мио-D и дифференцировкой в миотрубы6 , генерация трансгенных животных моделей, несущих мутантные RyR1s7,8,9,характеристику клеток у пациентов, экспрессирующих вариант RYR1 эндогенно10,11,12. Такие методы помогли установить, как различные мутации функционально влияют на канал RyR1 Ca2+.
Здесь описаны методы, разработанные для оценки функциональных эффектов мутаций RYR1. Различные параметры внутриклеточного гомеостаза кальция исследуются в клетках человека, эндогенно экспрессирующих кальциевый канал RyR1, включая миотрубки и увековеченные вирусом Эпштейна Барра (EBV) В-лимфоциты. Клетки получают от пациентов, расширяют в культуре и нагружают ратиометрическими флуоресцентными индикаторами кальция, такими как Fura-2 или indo-1. Параметры, которые, как сообщалось, были изменены из-за патогенных мутаций RYR1, включая покоящуюся [Ca2+],чувствительность к различным фармакологическим агонистам и размер внутриклеточных запасов Ca2+, измеряются либо на уровне одной клетки, с помощью флуоресцентной микроскопии, либо в клеточных популяциях с использованием флуориметра. Результаты, полученные в клетках от носителей мутаций, затем сравниваются с результатами, полученными от здоровых членов контрольной семьи. Этот подход продемонстрировал, что: (i) многие мутации, связанные с MHS, приводят к увеличению покоя [Ca2+]и сдвигу влево кривой реакции дозы либо к KCl-индуцированной деполяризации, либо к фармакологической активации RyR1 с 4-хлор-м-крезолом10,11,12,13; (ii) мутации, связанные с ПЗС, приводят к снижению пика [Ca2+],высвобождаемого фармакологической активацией RyR1, и уменьшению размера, если внутриклеточный Ca2+ хранит12,13,14,15; (iii) некоторые варианты не влияют на гомеостаз Ca2+13. Преимущества этого экспериментального подхода заключаются в следующем: белок RyR1 не переэкспрессирован и физиологические уровни присутствуют, клетки могут быть увековечены (как мышечные клетки, так и В-лимфоциты), обеспечивая клеточные линии, содержащие мутации. Некоторые недостатки связаны с тем, что пациенты могут нести мутации в более чем одном гене, кодирующем белки, участвующие в гомеостазе кальция и / или связи сокращения возбуждения (ECC), и это может усложнить экспериментальные выводы. Например, два варианта JP-45 были идентифицированы в MHS и контрольной популяции, и было показано, что их присутствие влияет на чувствительность рецептора дигидропиридина (DHPR) к активации16. Пациенты должны быть доступны, биологический материал должен быть собран заново, а этические разрешения должны быть получены от местных этических советов.
Протоколы, описанные в этой статье, были успешно использованы несколькими лабораториями для изучения влияния мутаций RYR1 на гомеостаз кальция. Важнейшие этапы подходов, изложенных в настоящем документе, касаются стерильности, навыков и методов культивирования клеток и доступности био…
The authors have nothing to disclose.
Работа, описанная в этой рукописи, была поддержана грантами Швейцарского национального научного фонда (SNF) и Швейцарского мышечного фонда.
4-chloro-m-cresol | Fluka | 24940 | |
Blood collection tubes | Sarstedt | 172202 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
caffeine | Merk | 102584 | |
Cascade 125+ CCD camera | Photometrics | ||
Cascade 128+ CCD | Photometrics | ||
Creatine | Sigma-Aldrich | C-3630 | |
DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
DMSO | Sigma | 41639 | |
EGTA | Fluka | 3778 | |
Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
Ficoll Paque | Cytiva | 17144002 | |
Foetal calf serum | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
Fura-2/AM | Invitrogen Life Sciences | F1201 | |
Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630049 | |
Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050122 | |
Insulin | ThermoFisher Scientific | A11382II | |
Ionomycin | Sigma | I0634 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
Lanthanum | Fluka | 61490 | |
Microperfusion system | ALA-Scientific | DAD VM 12 valve manifold | |
Origin Software | OriginLab Corp | Software | |
Pennicillin/Streptomycin | Gibco Life Sciences | 15140-122 | |
Perfusion chamber POC-R | Pecon | 000000-1116-079 | |
poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
RPMI | ThermoFisher Scientific | 21875091 | |
Spectrofluorimeter | Perkin Elmer | LS50 | |
Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | |
Tissue culture dishes | Falcon | 353046 | |
Tissue culture flask | Falcon | 353107 | |
Tissue culture inserts | Falcon | 353090 | |
Trypsin/EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300054 | |
Visiview | Visitron Systems GmbH | Software | |
Zeiss Axiovert S100 TV microscope | Carl Zeiss AG | ||
Zeiss glass coverslips | Carl Zeiss AG | 0727-016 |