Функциональная характеристика эндогенно экспрессированных вариантов RYR1 человека
Summary
Здесь описаны методы, используемые для изучения функционального эффекта мутаций RYR1, эндогенно экспрессируемых в вирусе Эпштейна Барра, увековеченных В-лимфоцитах человека и биопсии мышц, полученных из клеток-сателлитов, дифференцированных в миотрубы.
Abstract
Более 700 вариантов гена RYR1 были идентифицированы у пациентов с различными нервно-мышечными расстройствами, включая восприимчивость к злокачественной гипертермии, основные миопатии и центроядерную миопатию. Из-за различных фенотипов, связанных с мутациями RYR1, крайне важно охарактеризовать их функциональные эффекты, чтобы классифицировать варианты, переносимые пациентами для будущих терапевтических вмешательств, и идентифицировать непатогенные варианты. Многие лаборатории были заинтересованы в разработке методов функциональной характеристики мутаций RYR1, экспрессируемых в клетках пациентов. Такой подход имеет многочисленные преимущества, в том числе: мутации эндогенно экспрессируются, RyR1 не переэкспрессируется, использование гетерологичных клеток, экспрессирующих RyR1, избегается. Однако, поскольку у пациентов могут присутствовать мутации в разных генах, кроме RYR1, важно сравнивать результаты биологического материала от людей, имеющих одну и ту же мутацию, с разным генетическим фоном. В настоящей рукописи описаны методы, разработанные для изучения функциональных эффектов эндогенно экспрессированных вариантов RYR1 в: (а) вирус Эпштейна Барра увековечил человеческие В-лимфоциты и (б) клетки-сателлиты, полученные из биопсии мышц и дифференцированные в миотрубы. Затем контролируют изменения внутриклеточной концентрации кальция, вызванные добавлением фармакологических активаторов RyR1. Выбранный тип клеток нагружается ратиометрическим флуоресцентным индикатором кальция, а внутриклеточные [Ca2+] изменения контролируются либо на уровне одной клетки с помощью флуоресцентной микроскопии, либо в клеточных популяциях с использованием спектрофлуорометра. Затем кривые реакции агониста агониста в состоянии покоя [Ca2+]сравниваются между клетками здорового контроля и пациентами, имеющими варианты RYR1, что приводит к пониманию функционального эффекта данного варианта.
Introduction
На сегодняшний день более 700 вариантов RYR1 были идентифицированы в человеческой популяции и связаны с различными нервно-мышечными расстройствами, включая восприимчивость к злокачественной гипертермии (MHS), рабдомиолиз, индуцированный физической нагрузкой, заболевание центрального ядра (CCD), многомикровое заболевание (MmD), центроядерную миопатию (CNM)1,2,3 ; тем не менее, исследования по характеристике их функциональных эффектов отстают, и только около 10% мутаций были протестированы функционально. Различные экспериментальные подходы могут быть использованы для оценки влияния данного варианта RyR1, включая трансфекцию гетерологичных клеток, таких как HEK293 и КЛЕТКИ COS-7 с плазмидным кодированием для WT и мутантной КДНК RYR14,5,трансдукцию диспедических фибробластов мышей с плазмидами и векторами, кодирующими WT и мутантную кДНК RYR1, с последующей трансдукцией с мио-D и дифференцировкой в миотрубы6 , генерация трансгенных животных моделей, несущих мутантные RyR1s7,8,9,характеристику клеток у пациентов, экспрессирующих вариант RYR1 эндогенно10,11,12. Такие методы помогли установить, как различные мутации функционально влияют на канал RyR1 Ca2+.
Здесь описаны методы, разработанные для оценки функциональных эффектов мутаций RYR1. Различные параметры внутриклеточного гомеостаза кальция исследуются в клетках человека, эндогенно экспрессирующих кальциевый канал RyR1, включая миотрубки и увековеченные вирусом Эпштейна Барра (EBV) В-лимфоциты. Клетки получают от пациентов, расширяют в культуре и нагружают ратиометрическими флуоресцентными индикаторами кальция, такими как Fura-2 или indo-1. Параметры, которые, как сообщалось, были изменены из-за патогенных мутаций RYR1, включая покоящуюся [Ca2+],чувствительность к различным фармакологическим агонистам и размер внутриклеточных запасов Ca2+, измеряются либо на уровне одной клетки, с помощью флуоресцентной микроскопии, либо в клеточных популяциях с использованием флуориметра. Результаты, полученные в клетках от носителей мутаций, затем сравниваются с результатами, полученными от здоровых членов контрольной семьи. Этот подход продемонстрировал, что: (i) многие мутации, связанные с MHS, приводят к увеличению покоя [Ca2+]и сдвигу влево кривой реакции дозы либо к KCl-индуцированной деполяризации, либо к фармакологической активации RyR1 с 4-хлор-м-крезолом10,11,12,13; (ii) мутации, связанные с ПЗС, приводят к снижению пика [Ca2+],высвобождаемого фармакологической активацией RyR1, и уменьшению размера, если внутриклеточный Ca2+ хранит12,13,14,15; (iii) некоторые варианты не влияют на гомеостаз Ca2+13. Преимущества этого экспериментального подхода заключаются в следующем: белок RyR1 не переэкспрессирован и физиологические уровни присутствуют, клетки могут быть увековечены (как мышечные клетки, так и В-лимфоциты), обеспечивая клеточные линии, содержащие мутации. Некоторые недостатки связаны с тем, что пациенты могут нести мутации в более чем одном гене, кодирующем белки, участвующие в гомеостазе кальция и / или связи сокращения возбуждения (ECC), и это может усложнить экспериментальные выводы. Например, два варианта JP-45 были идентифицированы в MHS и контрольной популяции, и было показано, что их присутствие влияет на чувствительность рецептора дигидропиридина (DHPR) к активации16. Пациенты должны быть доступны, биологический материал должен быть собран заново, а этические разрешения должны быть получены от местных этических советов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протоколы, описанные в этой статье, были успешно использованы несколькими лабораториями для изучения влияния мутаций RYR1 на гомеостаз кальция. Важнейшие этапы подходов, изложенных в настоящем документе, касаются стерильности, навыков и методов культивирования клеток и доступности био…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа, описанная в этой рукописи, была поддержана грантами Швейцарского национального научного фонда (SNF) и Швейцарского мышечного фонда.
Materials
| 4-chloro-m-cresol | Fluka | 24940 | |
| Blood collection tubes | Sarstedt | 172202 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| caffeine | Merk | 102584 | |
| Cascade 125+ CCD camera | Photometrics | ||
| Cascade 128+ CCD | Photometrics | ||
| Creatine | Sigma-Aldrich | C-3630 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| DMSO | Sigma | 41639 | |
| EGTA | Fluka | 3778 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
| Ficoll Paque | Cytiva | 17144002 | |
| Foetal calf serum | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
| Fura-2/AM | Invitrogen Life Sciences | F1201 | |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630049 | |
| Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050122 | |
| Insulin | ThermoFisher Scientific | A11382II | |
| Ionomycin | Sigma | I0634 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
| Lanthanum | Fluka | 61490 | |
| Microperfusion system | ALA-Scientific | DAD VM 12 valve manifold | |
| Origin Software | OriginLab Corp | Software | |
| Pennicillin/Streptomycin | Gibco Life Sciences | 15140-122 | |
| Perfusion chamber POC-R | Pecon | 000000-1116-079 | |
| poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
| RPMI | ThermoFisher Scientific | 21875091 | |
| Spectrofluorimeter | Perkin Elmer | LS50 | |
| Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | |
| Tissue culture dishes | Falcon | 353046 | |
| Tissue culture flask | Falcon | 353107 | |
| Tissue culture inserts | Falcon | 353090 | |
| Trypsin/EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300054 | |
| Visiview | Visitron Systems GmbH | Software | |
| Zeiss Axiovert S100 TV microscope | Carl Zeiss AG | ||
| Zeiss glass coverslips | Carl Zeiss AG | 0727-016 |
References
- Dlamini, N., et al. Mutations in RYR1 are a common cause of exertional myalgia and rhabdomyolysis. Neuromuscular Disorders. 23 (7), 540-548 (2013).
- Klein, A., et al. Clinical and genetic findings in a large cohort of patients with ryanodine receptor 1 gene-associated myopathies. Human Mutation. 33, 981-988 (2012).
- Robinson, R., Carpenter, D., Shaw, M. A., Halsall, J., Hopkins, P. Mutations in RYR1 in malignant hyperthermia and central core disease. Human Mutation. 27 (20), 977-989 (2006).
- Xu, L., et al. Ca2+ mediated activation of the skeletal muscle ryanodine receptor ion channel. Journal of Biological Chemistry. 293 (50), 19501-19509 (2018).
- Treves, S., et al. Alteration of intracellular Ca2+ transients in COS-7 cells transfected with the cDNA encoding skeletal-muscle ryanodine receptor carrying a mutation associated with malignant hyperthermia. Biochemical Journal. 301 (3), 661-665 (1994).
- Nakai, J., et al. Enhanced dihydropyridine receptor channel activity in the presence of ryanodine receptor. Nature. 389 (6569), 72-75 (1996).
- Durham, W. J., et al. RyR1 S-nitrosylation underlies environmental heat stroke and sudden death in Y522S RyR1 knockin mice. Cell. 133 (81), 53-65 (2008).
- Zvaritch, E., et al. Ca2+ dysregulation in Ryr1(I4895T/wt) mice causes congenital myopathy with progressive formation of minicores, cores, and nemaline rods. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (51), 21813-21818 (2009).
- Elbaz, M., et al. Bi-allelic expression of the RyR1 p.A4329D mutation decreases muscle strength in slow-twitch muscles in mice. Journal of Biological Chemistry. 295, 10331-10339 (2020).
- Censier, K., Urwyler, A., Zorzato, F., Treves, S. Intracellular calcium homeostasis in human primary muscle cells from malignant hyperthermia susceptible and normal individuals. Journal of Clinical Investigations. 101 (6), 1233-1242 (1998).
- Girard, T., et al. B-lymphocytes from Malignant Hyperthermia-Susceptible patients have an increased sensitivity to skeletal muscle ryanodine receptor activators. Journal of Biological Chemistry. 276 (51), 48077 (2001).
- Ducreux, S., et al. Effect of ryanodine receptor mutations on interleukin-6 release and intracellular calcium homeostasis in human myotubes from Malignant Hyperthermia- Susceptible individuals and patients affected by Central Core Disease. Journal of Biological Chemistry. 279 (42), 43838-43846 (2004).
- Ducreux, S., et al. Functional properties of ryanodine receptors carrying three amino acid substitutions identified in patients affected by multi-minicore disease and central core disease, expressed in immortalized lymphocytes. Biochemical Journal. 395, 259-266 (2006).
- Tilgen, N., et al. Identification of four novel mutations in the C-terminal membrane spanning domain of the ryanodine receptor 1: association with central core disease and alteration of calcium homeostasis. Human Molecular Genetics. 10 (25), 2879-2887 (2001).
- Treves, S., et al. Enhanced excitation-coupled Ca2+ entry induces nuclear translocation of NFAT and contributes to IL-6 release from myotubes from patients with central core disease. Human Molecular Genetics. 20 (3), 589-600 (2011).
- Yasuda, T., et al. JP-45/JSRP1 variants affect skeletal muscle excitation contraction coupling by decreasing the sensitivity of the dihydropyridine receptor. Human Mutation. 34, 184-190 (2013).
- Sei, Y., Gallagher, K. L., Basile, A. S. Skeletal muscle ryanodine receptor is involved in calcium signaling in human B lymphocytes. Journal of Biological Chemistry. 274 (9), 5995-6062 (1999).
- Tegazzin, V., Scutari, E., Treves, S., Zorzato, F. Chlorocresol, an additive to commercial succinylcholine, induces contracture of human malignant Hyperthermia Susceptible muscles via activation of the ryanodine receptor Ca2+ channel. Anesthesiology. 84, 1275-1279 (1996).
- Kushnir, A., et al. Ryanodine receptor calcium leak in circulating B-lymphocytes as a biomarker for heart failure. Circulation. 138 (11), 1144-1154 (2018).
- Zullo, A., et al. Functional characterization of ryanodine receptor sequence variants using a metabolic assay in immortalized B-lymphocytes. Human Mutation. 30 (4), 575-590 (2009).
- Hoppe, K., et al. Hypermetabolism in B-lymphocytes from malignant hyperthermia susceptible individuals. Scientific Reports. 6, 33372 (2016).
- Monnier, N., et al. A homozygous splicing mutation causing a depletion of skeletal muscle RYR1 is associated with multi-minicore disease congenital myopathy with ophthalmoplegia. Human Molecular Genetics. 12, 1171-1178 (2003).
- Schartner, V., et al. Dihydropyridine receptor (DHPR, CACNA1S) congenital myopathy. Acta Neuropathologica. 133, 517-533 (2017).
- Ullrich, N. D., et al. Alterations of excitation-contraction coupling and excitation coupled Ca2+ entry in human myotubes carrying CAV3 mutations linked to rippling muscle disease. Human Mutation. 32, 1-9 (2010).
- Rokach, O., et al. Characterization of a human skeletal muscle- derived cell line: biochemical, cellular and electrophysiological characterization. Biochemical Journal. 455, 169-177 (2013).
- Zhou, H., et al. Characterization of RYR1 mutations in core myopathies. Human Molecular Genetics. 15, 2791-2803 (2006).
- Klinger, W., Baur, C., Georgieff, M., Lehmann-Horn, F., Melzer, W. Detection of proton release from cultured human myotubes to identify malignant hyperthermia susceptibility. Anesthesiology. 97, 1043-1056 (2002).
