Burada Epstein Barr Virüs ölümsüzleştirilmiş insan B-lenfositler ve miyotubes içine farklılaştırılmış kas biyopsisi türetilmiş uydu hücreleri endojen olarak ifade edilen RYR1 mutasyonlarının fonksiyonel etkisini incelemek için kullanılan yöntemler açıklanmıştır.
Malign hipertermi duyarlılığı, çekirdek miyopatiler ve merkezkonükleer miyopati gibi farklı nöromüsküler bozuklukları olan hastalarda RYR1 geninde 700’den fazla varyant tanımlanmıştır. RYR1 mutasyonlarına bağlı çeşitli fenotipler nedeniyle, gelecekteki terapötik müdahaleler için hastalar tarafından taşınan varyantları sınıflandırmak ve patojenik olmayan varyantları tanımlamak için fonksiyonel etkilerini karakterize etmek esastır. Birçok laboratuvar, hastaların hücrelerinde ifade edilen RYR1 mutasyonlarını işlevsel olarak karakterize etmek için yöntemler geliştirmekle ilgilenmiştir. Bu yaklaşımın çok sayıda avantajı vardır: mutasyonlar endojen olarak ifade edilir, RyR1 aşırı ifade edilir, heterolog RyR1 eksprese hücrelerinin kullanımından kaçınılır. Bununla birlikte, hastalar RYR1 dışında farklı genlerde mutasyonlar sunabileceğinden, aynı mutasyonu barındıran bireylerden elde edilen biyolojik materyalin sonuçlarını farklı genetik geçmişlerle karşılaştırmak önemlidir. Bu makale, endojen olarak ifade edilen RYR1 varyantlarının fonksiyonel etkilerini incelemek için geliştirilen yöntemleri açıklar: (a) Epstein Barr virüsü, kas biyopsilerinden elde edilen ve miyotüplere farklılaşan insan B-lenfositlerini ve (b) uydu hücrelerini ölümsüzleştirmiştir. Daha sonra farmakolojik RyR1 aktivatörlerinin eklenmesiyle tetiklenen hücre içi kalsiyum konsantrasyonundaki değişiklikler izlenir. Seçilen hücre tipi bir oranmetrik floresan kalsiyum göstergesi ile yüklenir ve hücre içi [Ca2+] değişiklikler floresan mikroskopi ile tek hücre düzeyinde veya spektrofluorometre kullanılarak hücre popülasyonlarında izlenir. Dinlenme [Ca2+], agonist doz yanıt eğrileri daha sonra sağlıklı kontrollerden gelen hücreler ile belirli bir varyantın işlevsel etkisi hakkında fikir veren RYR1 varyantlarını barındıran hastalar arasında karşılaştırılır.
Bugüne kadar insan popülasyonunda 700’den fazla RYR1 varyantı tanımlanmış ve malign hipertermi duyarlılığı (MHS), egzersize bağlı rabdomiyoliz, merkezi çekirdek hastalığı (CCD), çoklu minicore hastalığı (MMD), merkezkronükleer miyopati (CNM)1,2,3 dahil olmak üzere çeşitli nöromüsküler bozukluklarla bağlantılıdır. ; bununla birlikte, fonksiyonel etkilerini karakterize etme çalışmaları gecikmektedir ve mutasyonların sadece yaklaşık% 10’unu işlevsel olarak test edilmiştir. Belirli bir RyR1 varyantının etkisini değerlendirmek için farklı deneysel yaklaşımlar kullanılabilir, HEK293 ve COS-7 hücreleri gibi heterolog hücrelerin WT ve mutant RYR1 cDNA4,5,dispedik fare fibroblastlarının WT ve mutant RYR1 cDNA için kodlanmış plazmidler ve vektörler ile transdüksiyonu dahil olmak üzere, ardından myo-D ile transdüksiyon ve miyotubes6’ya farklılaşma , mutant taşıyan transgenik hayvan modellerinin üretimi RyR1s7,8,9, RYR1 varyantını endojen olarak ifade eden hastalardan hücrelerin karakterizasyonu10,11,12. Bu tür yöntemler, farklı mutasyonların RyR1 Ca2+ kanalını işlevsel olarak nasıl etkilediğini belirlemeye yardımcı oldu.
Burada RYR1 mutasyonlarının fonksiyonel etkilerini değerlendirmek için geliştirilen yöntemler açıklanmıştır. Hücre içi kalsiyum homeostazın çeşitli parametreleri, miyotüpler ve Epstein Barr Virüsü (EBV) ölümsüzleştirilmiş B-lenfositler de dahil olmak üzere RyR1 kalsiyum kanalını endojen olarak ifade eden insan hücrelerinde araştırılmaktadır. Hücreler hastalardan elde edilir, kültür olarak genişletilir ve Fura-2 veya indo-1 gibi oranmetrik floresan kalsiyum indictors ile yüklenir. Dinlenme [Ca2+] dahil olmak üzere patojenik RYR1 mutasyonları, farklı farmakolojik agonistlere duyarlılık ve hücre içi Ca2+ depolarının büyüklüğü gibi patojenik RYR1 mutasyonları nedeniyle değiştirildiği bildirilen parametreler, floresan mikroskopi kullanılarak veya florometre kullanılarak hücre popülasyonlarında tek hücre düzeyinde ölçülür. Mutasyon taşıyıcılarından hücrelerde elde edilen sonuçlar daha sonra sağlıklı kontrol aile üyelerinden elde edilenlerle karşılaştırılır. Bu yaklaşım göstermiştir ki: (i) MHS ile bağlantılı birçok mutasyon, dinlenmede bir artışa yol açar [Ca2+] ve doz yanıt eğrisinde sola kayarak KCl kaynaklı depolarizasyona veya farmakolojik RyR1 aktivasyonuna 4-kloro-m-cresol10,11,12,13; (ii) CCD’ye bağlı mutasyonlar, RyR1’in farmakolojik aktivasyonu ile salınan zirvede [Ca2+] azalmaya ve hücre içi Ca2+ depolarsa boyutun azalmasına yol açar12,13,14,15; (iii) bazı varyantlar Ca2 + homeostaz13’üetkilemez. Bu deneysel yaklaşımın avantajları şunlardır: RyR1 proteini aşırı ifade değildir ve fizyolojik seviyeler mevcuttur, hücreler mutasyon içeren hücre çizgileri sağlayan ölümsüzleştirilebilir (hem kas hücreleri hem de B-lenfositler). Bazı dezavantajlar, hastaların kalsiyum homeostaz ve/veya heyecan verici kasılma kaplinlerinde (ECC) yer alan birden fazla gen kodlama proteininde mutasyon taşıyabileceği ve bunun deneysel sonuçları zorlaştırabileceği gerçeğiyle ilgilidir. Örneğin, MHS ve kontrol popülasyonunda iki JP-45 varyantı tanımlanmış ve bunların varlığının dihidrohidridin reseptörün (DHPR) aktivasyon16’yaduyarlılığını etkilediği gösterilmiştir. Hastaların mevcut olması, biyolojik materyalin yeni toplanması ve yerel etik kurullardan etik izinler alınması gerekir.
Bu makalede açıklanan protokoller, RYR1 mutasyonlarının kalsiyum homeostaz üzerindeki etkisini incelemek için çeşitli laboratuvarlar tarafından başarıyla kullanılmıştır. Bu makalede özetlenen yaklaşımların kritik adımları sterilite, hücre kültleme becerileri ve teknikleri ve biyolojik materyalin mevcudiyeti ile ilgilenmiştir. Prensip olarak, EBV ölümsüzleştirilmiş B lenfositlerin kullanımı daha basittir ve mutant RyR1 kanalları içeren hücre hatları üretmesine izin verir. Hücreler uzun…
The authors have nothing to disclose.
Bu yazıda açıklanan çalışma, İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (SNF) ve İsviçre Kas Vakfı’nın hibeleriyle desteklendi.
4-chloro-m-cresol | Fluka | 24940 | |
Blood collection tubes | Sarstedt | 172202 | |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
caffeine | Merk | 102584 | |
Cascade 125+ CCD camera | Photometrics | ||
Cascade 128+ CCD | Photometrics | ||
Creatine | Sigma-Aldrich | C-3630 | |
DMEM | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
DMSO | Sigma | 41639 | |
EGTA | Fluka | 3778 | |
Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma-Aldrich | E9644 | |
Ficoll Paque | Cytiva | 17144002 | |
Foetal calf serum | ThermoFisher Scientific | 26140079 | |
Fura-2/AM | Invitrogen Life Sciences | F1201 | |
Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630049 | |
Horse serum | Thermo Fisher Scientific | 16050122 | |
Insulin | ThermoFisher Scientific | A11382II | |
Ionomycin | Sigma | I0634 | |
KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
Laminin | ThermoFisher Scientific | 23017015 | |
Lanthanum | Fluka | 61490 | |
Microperfusion system | ALA-Scientific | DAD VM 12 valve manifold | |
Origin Software | OriginLab Corp | Software | |
Pennicillin/Streptomycin | Gibco Life Sciences | 15140-122 | |
Perfusion chamber POC-R | Pecon | 000000-1116-079 | |
poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P8920 | |
RPMI | ThermoFisher Scientific | 21875091 | |
Spectrofluorimeter | Perkin Elmer | LS50 | |
Thapsigargin | Calbiochem | 586005 | |
Tissue culture dishes | Falcon | 353046 | |
Tissue culture flask | Falcon | 353107 | |
Tissue culture inserts | Falcon | 353090 | |
Trypsin/EDTA solution | ThermoFisher Scientific | 25300054 | |
Visiview | Visitron Systems GmbH | Software | |
Zeiss Axiovert S100 TV microscope | Carl Zeiss AG | ||
Zeiss glass coverslips | Carl Zeiss AG | 0727-016 |