Summary
Dit protocol beschrijft het gebruik van een feedback temperatuurgestuurd verwarmingssysteem om lipide monolayer assemblage en druppel interface bilayer vorming voor lipiden met verhoogde smelttemperaturen te bevorderen, en capaciteitsmetingen om temperatuurgestuurde veranderingen in het membraan te karakteriseren.
Abstract
De druppelinterface bilayer (DIB) methode voor het assembleren van lipide bilayers (d.w.z. DIBs) tussen lipide-gecoate waterige druppels in olie biedt belangrijke voordelen ten opzichte van andere methoden: DIB's zijn stabiel en vaak langdurig, bilayer gebied kan omkeerbaar worden afgestemd, folder asymmetrie is gemakkelijk te controleren via druppelsamenstellingen, en weefsel-achtige netwerken van bilayers kunnen worden verkregen door het aangrenzende van vele druppels. Het vormen van DIBs vereist spontane assemblage van lipiden in lipidemonolagen met hoge dichtheid aan de oppervlakken van de druppels. Hoewel dit gemakkelijk gebeurt bij kamertemperatuur voor veel voorkomende synthetische lipiden, kan zich geen voldoende monolayer of stabiele bilayer vormen onder vergelijkbare omstandigheden voor lipiden met smeltpunten boven kamertemperatuur, waaronder sommige cellulaire lipide-extracten. Dit gedrag heeft waarschijnlijk de samenstellingen - en misschien de biologische relevantie - van DIBs in modelmembraanstudies beperkt. Om dit probleem aan te pakken, wordt een experimenteel protocol gepresenteerd om het oliereservoir met DIB-druppels zorgvuldig te verwarmen en de effecten van temperatuur op het lipidenmembraan te karakteriseren. In het bijzonder laat dit protocol zien hoe u een thermisch geleidende aluminium armatuur en resistieve verwarmingselementen gebruikt die worden bestuurd door een feedbacklus om verhoogde temperaturen voor te schrijven, wat de monolaagassemblage en bilayer-vorming verbetert voor een bredere set lipidentypen. Structurele kenmerken van het membraan, evenals de thermotrope faseovergangen van de lipiden die de tweelaagse vormen, worden gekwantificeerd door de veranderingen in elektrische capaciteit van de DIB te meten. Samen kan deze procedure helpen bij het evalueren van biofysische verschijnselen in modelmembranen over verschillende temperaturen, waaronder het bepalen van een effectieve smelttemperatuur (TM) voor meercomponentenlipidemengsels. Dit vermogen zal dus een nauwere replicatie van natuurlijke faseovergangen in modelmembranen mogelijk maken en de vorming en het gebruik van modelmembranen aanmoedigen uit een breder zwad van membraanbestanddelen, waaronder die welke de heterogeniteit van hun cellulaire tegenhangers beter vangen.
Introduction
Cellulaire membranen zijn selectief doorlatende barrières bestaande uit duizenden lipidetypen1,eiwitten, koolhydraten en sterolen die alle levende cellen inkapselen en onderverdelen. Inzicht in hoe hun samenstellingen hun functies beïnvloeden en onthullen hoe natuurlijke en synthetische moleculen interageren met cellulaire membranen, zich eraan hechten, verstoren en translocate zijn daarom belangrijke onderzoeksgebieden met verstrekkende implicaties in biologie, geneeskunde, chemie, natuurkunde en materiaaltechnologie.
Deze ontdekkingsdoelen profiteren rechtstreeks van bewezen technieken voor het assembleren, manipuleren en bestuderen van modelmembranen - inclusief lipide-tweelagen geassembleerd uit synthetische of natuurlijk voorkomende lipiden - die de samenstelling, structuur en transporteigenschappen van hun cellulaire tegenhangers nabootsen. In de afgelopen jaren heeft de druppelinterface bilayer (DIB)methode2,3,4 voor het construeren van een planaire lipide bilayer tussen lipide-gecoate waterdruppels in olie aanzienlijke aandacht gekregen5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17, 18, 19,20 , 21,2vereist geen geavanceerde fabricage of voorbereiding (bijv. "schilderen") van een substraat om het membraan te ondersteunen, levert consequent membranen op met superieure levensduur, maakt standaard elektrofysiologische metingen mogelijk en vereenvoudigt de vorming van modelmembranen met asymmetrische bijsluitersamenstellingen3. Omdat de tweelaagse vormen spontaan tussen druppels en elke druppel kunnen worden aangepast in positie en make-up, heeft de DIB-techniek ook veel belangstelling getrokken voor het ontwikkelen van celgeïnspireerde materiaalsystemen die voortbouwen op het gebruik van stimuli-responsieve membranen18,24,25,26, 27, 28, 29, evenwichtigecompartimentering en transport14,30,31en weefselachtige materialen17,23,3.
De meeste gepubliceerde experimenten op modelmembranen, waaronder die met DBB's, zijn uitgevoerd bij kamertemperatuur (RT, ~20-25 °C) en met een handvol synthetische lipiden (bijv. DOPC, DPhPC, enz.). Deze praktijk beperkt de reikwijdte van biofysische vragen die kunnen worden bestudeerd in modelmembranen en kan, op basis van observatie, ook de soorten lipiden beperken die kunnen worden gebruikt om DIBs samen te stellen. Een synthetisch lipide zoals DPPC, dat een smelttemperatuur van 42 °C heeft, assembleert bijvoorbeeld geen strak verpakte monolagen of vormt DIBs bij RT37. DIB-vorming bij kamertemperatuur is ook moeilijk gebleken voor natuurlijke extracten, zoals die van zoogdieren (bijv. hersentotaal lipidenextract, BTLE)38 of bacteriën (bijv. Escherichia coli total lipid extract, ETLE)37, die veel verschillende soorten lipiden bevatten en afkomstig zijn van cellen die zich bij verhoogde temperaturen (37 °C) bevinden. Het mogelijk maken van de studie van diverse samenstellingen biedt dus mogelijkheden om membraangemedieerde processen in biologisch relevante omstandigheden te begrijpen.
Het verhogen van de temperatuur van de olie kan twee doelen dienen: het verhoogt de kinetiek van monolaagassemblage en het kan ervoor zorgen dat lipiden een smeltovergang ondergaan om een vloeistof verstoorde fase te bereiken. Beide gevolgen helpen bij eenlaagse assemblage39, een voorwaarde voor een DIB. Naast verwarming voor bilaagvorming kan het koelen van het membraan na de vorming worden gebruikt om thermotrope overgangen in enkelvoudige lipide-tweelagen38te identificeren, inclusief die in natuurlijke lipidenmengsels (bijv. BTLE) die moeilijk te detecteren kunnen zijn met behulp van calorimetrie. Afgezien van het beoordelen van thermotrope overgangen van lipiden, kan het nauwkeurig variëren van de temperatuur van de DIB worden gebruikt om temperatuurgeïnduceerde veranderingen in membraanstructuur38 te bestuderen en te onderzoeken hoe lipidesamenstelling en vloeibaarheid de kinetiek van membraanactieve soorten beïnvloeden (bijv. porievormende peptiden en transmembrane-eiwitten37),inclusief membranen van zoogdieren en bacteriën bij een fysiologisch relevante temperatuur (37 °C).
Hierin wordt een beschrijving gegeven van het monteren van een gemodificeerd DIB-oliereservoir en het bedienen van een feedbacktemperatuurregelaar om monolaagassemblage en bilayervorming mogelijk te maken bij temperaturen hoger dan RT. Onderscheiden van een eerder protocol40, is expliciet detail opgenomen met betrekking tot de integratie van instrumentatie die nodig is voor het meten en regelen van de temperatuur parallel aan de assemblage en karakterisering van de DIB in het oliereservoir. De procedure zal een gebruiker dus in staat stellen deze methode toe te passen voor het vormen en bestuderen van DBI's over een reeks temperaturen in verschillende wetenschappelijke contexten. Bovendien geven de representatieve resultaten specifieke voorbeelden voor de soorten meetbare veranderingen in zowel membraanstructuur als ionentransport die kunnen optreden als de temperatuur gevarieerd is. Deze technieken zijn belangrijke aanvullingen op de vele biofysische studies die effectief kunnen worden ontworpen en uitgevoerd in DIBs, waaronder het bestuderen van de kinetiek van membraanactieve soorten in verschillende membraansamenstellingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van verwarmde armaturen
- Verzamel 2 stukken isolatierubber van 1 mm dik, afgezet tot respectievelijk 25 mm x 40 mm breed en lang, 2 stuks van een rubber van 6 mm dik die ook 25 mm x 40 mm zijn, een voorbereide aluminium basisarmatuur en een acryloliereservoir dat in het kijkvenster van de aluminium basisarmatuur past (zie figuren S1, S2 en S3 voor meer informatie over fabricage en een geëxplodeerd zicht op de montage). Bereid de aluminium armatuur eerst voor door aan de onderkant van het armatuur een glazen afdekraam met UV-uithardbare lijm te bevestigen en 1 resistief verwarmingselement aan de bovenkant van elke 25 mm x 25 mm zijflens van het armatuur te bevestigen.
- Plaats de dunnere rubberen stukken op het podium van de microscoop, zodat de lange rand van elk stuk raaklijnig is aan de podiumopening zoals weergegeven in (Figuur 1).
- Plaats de aluminium basisarmatuur bovenop de isolerende pads met het kijkvenster van het armatuur gecentreerd boven de objectieve lens. Een goede uitlijning is vereist voor het weergeven van de aangesloten druppels.
- Plaats een dikker stuk rubber op elk weerstandsverwarmingselement en gebruik een microscooptrapclip om het op zijn plaats te houden. Deze stukken beschermen de verwarmingselementen tegen schade veroorzaakt door de podiumclips en isoleren tegen onbedoelde elektrische kortsluiting tussen de verwarmingselementen en zowel de aluminium armatuur als het microscoopstadium.
- Buig het meeteinde van een thermokoppel voorzichtig om een hoek van 90° te bereiken op ~ 4 mm van het einde.
- Steek de gebogen punt van het thermokoppel in de linkerbenedenhoek van de aluminium armatuur en zet deze voorzichtig vast met de borgschroef.
- Plaats het acrylreservoir in de put van de aluminium armatuur. Dit wordt gedaan voordat hexadecane-olie aan de put (stap 1.8) van de aluminium armatuur wordt toegevoegd om het risico op het opvangen van luchtbellen tussen het kijkvenster en de bodem van het acrylreservoir te minimaliseren, wat het zicht op de druppels kan belemmeren.
OPMERKING: Olie die aan het kijkcompartiment van het aluminium armatuur wordt toegevoegd, wordt gebruikt om overeen te komen met de brekingsindexen van acryl en glas voor een duidelijker beeld van de druppels in het acrylreservoir. Het is dus vermeldenswaardig dat olie in de put van het aluminium armatuur geen contact maakt met de inhoud van het acrylreservoir en dat rigoureuze reiniging van het aluminium armatuur niet nodig is. - Doseer ~1.000 μL hexaderietolie in de put van aluminium armatuur (d.w.z. tussen de wanden van het acrylreservoir en aluminium armatuur), zorg ervoor dat u niet overvult. Het oliepeil in de put van het aluminium armatuur moet zo hoog zijn als toegestaan om het oppervlak voor warmteoverdracht te maximaliseren, zonder dat olie over de randen van het armatuur op het microscoopstadium of de objectieve lens kan morsen.
- Doseer ~1.000 μL hexaderietolie in het acrylreservoir, terwijl u er rekening mee houdt dat het niet te vol raakt.
OPMERKING: Het acrylreservoir moet altijd grondig worden gereinigd tussen de experimenten door. De gebruiker moet een regiment gebruiken dat bestaat uit opeenvolgende spoelingen met ethylalcohol en gedeioneerd water, gevolgd door het drogen in een desiccatorkom gedurende meer dan 12 uur.
Figuur 1: Verwarmde podiummontage. Afbeeldingen tonen de montage van het thermisch geleidende armatuur en oliereservoir voor DIB-vorming; nummers onder elke afbeelding identificeren de overeenkomstige stap van het protocol. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
2. Instrumentatie voor gelijktijdige feedback temperatuurregeling en elektrische karakterisering van een DIB
OPMERKING: Dit protocol integreert de volgende instrumenten voor het mogelijk maken van feedbacktemperatuurregeling en gelijktijdige elektrische karakterisering van een DIB: een personal computer (PC) met twee beschikbare usb-aansluitingen (Universal Serial Bus), een patch clamp versterker gekoppeld aan een dedicated data acquisition (DAQ-1) systeem, een golfvormgenerator, een tweede programmeerbare DAQ (DAQ-2) met spanningsuitgang en temperatuuringangsmodules, en een voeding/versterker. De volgende stappen beschrijven de noodzakelijke verbindingen van deze instrumenten (zoals geïllustreerd in figuur 2a) die nodig zijn voor het isoleren van de meting en regeling van de temperatuur van gelijktijdige elektrofysiologie van een DIB. Naar behoefte kunnen vervangingen voor gelijkwaardige instrumenten worden gemaakt.
- Maak uitgangs- en ingangsaansluitingen op de DAQ-2 modules.
- Selecteer twee paar schroefklemmen op de spanningsuitgangsmodule voor differentiële spanningsaansluitingen en bevestig draadkabels naar deze locaties. Oneven nummerklemmen zijn gemeenschappelijke massaverbindingen en de even nummerklemmen zijn ongeaarde uitgangen, zoals weergegeven in (Figuur 2c). Sluit elk van deze twee paar looddraden aan op afzonderlijke schroef-terminal-BNC-adapters en sluit vervolgens elke adapter aan op een afzonderlijke BNC-kabel die wordt gebruikt om spanningssignalen naar andere instrumenten te leiden.
OPMERKING: In deze opstelling worden differentiële aansluitingen op de klemmen 0 en 1 toegewezen voor de temperatuurregelaaruitgang naar de eindversterker, terwijl een ander paar aansluitingen op de klemmen 6 en 7 zijn aangewezen voor spanningsuitgangen die via de patchklemversterker naar de druppels moeten worden gestuurd. - Onder verwijzing naar (figuur 2c) selecteert u één set thermokoppelklemmen (bijv. klemmen 2 en 3 worden aangeduid als het TC1-paar) op de thermokoppelingangsmodule en sluit u de thermokoppeldraden aan.
- Selecteer twee paar schroefklemmen op de spanningsuitgangsmodule voor differentiële spanningsaansluitingen en bevestig draadkabels naar deze locaties. Oneven nummerklemmen zijn gemeenschappelijke massaverbindingen en de even nummerklemmen zijn ongeaarde uitgangen, zoals weergegeven in (Figuur 2c). Sluit elk van deze twee paar looddraden aan op afzonderlijke schroef-terminal-BNC-adapters en sluit vervolgens elke adapter aan op een afzonderlijke BNC-kabel die wordt gebruikt om spanningssignalen naar andere instrumenten te leiden.
Figuur 2: Systeembedradingsaansluitingen. Een schema van de apparaten en bedrading die nodig zijn voor het systeem wordt weergegeven in (a), terwijl een gedetailleerde blik op de DAQ-2-aansluitingen wordt gegeven in (b). De afbeelding in (c) toont waterige druppels op hydrogel-gecoate elektroden ondergedompeld in olie voor DIB-vorming. De twee elektroden zijn verbonden met respectievelijk de geaarde en ongeaarde (V+) aansluitingen op de headstage unit van de patch clamp versterker. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
- Nadat elektrische aansluitingen op de DAQ-2 modules zijn gemaakt, sluit u het DAQ-2 chassis aan op een PC via een USB-aansluiting en sluit u deze aan op een elektrische voedingsbron. Bevestig vervolgens de succesvolle installatie van stuurprogramma's en software voordat u deze gebruikt met commerciële software.
- Configureer en sluit een eindversterker aan tussen DAQ-2 en weerstandsverwarmingselementen.
- Configureer de versterker om te werken in de versterkingsmodus met vaste versterking met een versterking van 10X.
- Sluit met behulp van een banana jack-BNC adapter de BNC-kabel afkomstig van de klemmen 0 en 1 op de spanningsuitgangsmodule (figuur 2b) aan op de ingangsaansluitingen op de eindversterker.
- Sluit met behulp van extra BNC-adapters en bekabeling de uitgangsaansluitingen van de eindversterker aan op beide sets verwarmingselementen, die parallel aan elkaar en de versterker zijn aangesloten om ervoor te zorgen dat beide elementen tijdens het gebruik dezelfde spanningsval behouden.
- De nodige aansluitingen voor de elektrofysiologieapparatuur tot stand brengen.
- Sluit een BNC-kabel afkomstig van de klemmen 6 en 7 op de spanningsuitgangsmodule (afbeelding 2b) aan op de achterste geschakelde externe opdracht BNC-connectoren aan de achterzijde van de patchklemversterker.
- Sluit een tweede BNC-kabel aan tussen de uitgang van de golfvormgenerator en de frontschakelaar externe opdrachtaansluiting aan de achterkant van de patchklemversterker.
OPMERKING: Deze twee aansluitingen bieden alternatieve methoden voor het genereren van spanningsgolfvormen die via de patchklemversterker op de druppelelektroden worden aangebracht. De golfvormgenerator is vooral handig voor het genereren van driehoekige golfvormspanningen die worden gebruikt om membraanvermogen te meten. De gebruiker kan beslissen welke, indien nodig, nodig zijn voor zijn eigen toepassing. - Sluit met een derde BNC-kabel de uitgang van de gemeten stroom op het voorpaneel van de patchklemversterker aan op een beschikbare analoge ingang BNC-connector aan de voorzijde van de DAQ-1.
- Sluit met een vierde BNC-kabel de uitgang van de gemeten membraanspanning (aan de achterzijde van de patchklemversterker) aan op een aparte analoge ingangsconnector op de DAQ-1. Dit maakt digitalisering van de spanning over de elektroden mogelijk.
- Sluit de elektrodekabels met de twee druppelelektroden die zijn voorbereid en ondersteund op micromanipulatoren zoals beschreven in stap 7-9 in ref.40aan op de kop van de patchklem, die via een kabel aan de patchklemversterker is bevestigd.
OPMERKING: De rol van de headstage is om de spanning tussen de elektroden te regelen en de resulterende stroom te meten, die wordt omgezet in een proportionele spanning die door de patchklemversterker wordt uitgevoerd op DAQ-1. - Sluit de DAQ-1 aan op een pc via een USB-aansluiting en sluit de bijbehorende voedingskabels aan op zowel de patchklemversterker als de DAQ-1.
- Schakel alle meetapparatuur in.
OPMERKING: Misschien wel het belangrijkste detail in deze opstelling is ervoor te zorgen dat de uitgangsaansluitingen van de eindversterker (mA-A) elektrisch worden geïsoleerd van de headstage-eenheid van de patchklemversterker, die een gevoelig circuit gebruikt om pA-nA-niveaustromen in een DIB te meten.
3. Feedback temperatuurregeling van druppel interface bilayers
OPMERKING: De volgende stappen voor het gebruik van het feedbacktemperatuurregelingssysteem zijn gebaseerd op een aangepaste grafische gebruikersinterface (GUI) die is gemaakt voor het implementeren van proportioneel-integrale (PI) feedbacktemperatuurregeling40,41 (zie Aanvullende coderingsbestanden). In plaats daarvan kunnen andere software- en besturingsalgoritmen worden gebruikt. Een kopie van dit programma wordt aan de lezer verstrekt met de aanvullende informatie voor het papier, maar de gebruiker is verantwoordelijk om het te configureren voor hun eigen apparatuur en behoeften.
- Start de DAQ-2-software op de pc en open het programmabestand voor temperatuurregeling. Zodra de GUI wordt geopend, opent u het programma opnieuw door op het mappictogram in de linkerbenedenhoek van de GUI te klikken en het temperatuurregelingsprogramma te selecteren (figuur 3).
- Voer de juiste numerieke waarden in voor de proportionele regelwinst (KP) en de integrale regelwinst (KI).
OPMERKING: KP- en KI-waarden van respectievelijk 0,598 en 0,00445 bleken goed te werken in de opstelling. Deze waarden werden iteratief bepaald door simulatie met behulp van een systeemmodel dat parameters bevat die zijn verkregen uit gemeten open-lusverwarmingsreacties (zie figuur 4). Tijdens open-loop verwarmingis het voorgeschreven verwarmingsvermogen onafhankelijk van de gemeten temperatuur. Closed-loop verwarming daarentegen bestaat uit het voortdurend aanpassen van het toegepaste vermogen aan de kachels op een manier die helpt de gemeten temperatuur dichter bij de gewenste temperatuur te brengen. Dit wordt hierin bereikt met behulp van een PI-controleschema. - Als u het temperatuurregelingsschema wilt testen, voert u een gewenste ingestelde punttemperatuur (boven kamertemperatuur) in en schakelt u vervolgens de feedbacktemperatuurregeling in de GUI in. Let op het gemeten temperatuursignaal onder de controle van de feedback (closed-loop), dat de komende minuten in de GUI wordt weergegeven. Als de gemeten temperatuur van de olie de gewenste temperatuur sterk overschrijdt, te langzaam reageert op veranderingen of niet convergeert naar het gewenste instelpunt, moet de gebruiker de regelwinsten aanpassen om de gewenste prestaties in de gesloten lus te bereiken.
OPMERKING: Het programma definieert een verzadigingsgrens voor het vermogen (en dus de spanning) die aan de weerstandsverwarmingselementen wordt geleverd. Twee elementen die hierin worden gerapporteerd, verbruiken bijvoorbeeld elk maximaal 5 W stroom. Parallel bekabelen betekent dat het totale stroomverbruik niet hoger mag zijn dan 10 W. De gebruiker wordt geadviseerd om rekening te houden met de maximale hoeveelheid stroom die aan de apparaten moet worden geleverd en te weten dat deze limiet van invloed kan zijn op de snelheid waarmee het gesloten systeem zal reageren op de gewenste temperatuurveranderingen. Hogere verwarmingselementen maken snellere verwarming en hogere instelpunttemperaturen mogelijk, maar vereisen hogere meegeleverde stromen voor verwarming. - Voer met het systeem dat is afgestemd op acceptabele closed-loop-prestaties de gewenste olietemperatuur voor DIB-vorming in als het ingestelde punt in de GUI.
OPMERKING: Een ingestelde punttemperatuur van 60 °C leverde bijvoorbeeld goede resultaten op in experimenten met BTLE-liposomen in de waterige druppels37. De gebruiker wordt eldersverwezen 2,40 voor protocollen die DIB-assemblage verklaren tussen druppels die aan draadelektroden hangen en configuratie van elektrofysiologieapparatuur met behulp van de patchklemversterker, DAQ-1 en elektrofysiologiemeetsoftware. In het bijzonder kan het protocol van Najem, et al.40 op de voet worden gevolgd tot stap 13. Voorbij die stap wordt een iets andere aanpak gebruikt voor succesvolle monolaag- en bilaagvorming bij het gebruik van lipiden die verwarming vereisen om monolaag- of bilayervorming te bevorderen. - Laat de uiteinden van de zilver/zilverchloride (Ag/AgCl) elektroden in de olie zakken totdat ze bijna de bodem van het acrylreservoir raken. Deze positionering van de elektrodepunten is van cruciaal belang om de druppel op de elektrode in verwarmde olie te houden, waar convectieve stromen in de olie zijn waargenomen om druppels los te maken van de hydrogel-gecoate elektroden (Figuur 2c).
- Pipetteer een druppel waterige lipideoplossing van 2 mg/ml BTLE, 100 ml kaliumchloride (KCl) en 10 ml 3-(N-morfolino) propaansulfonzuur (MOPS) op elke elektrodetip en laat ze minimaal 10 minuten in de verwarmde olie incuberen om de vorming van eenlaags te bevorderen.
- Bedek het hoofdpodium en de verwarmde podiuminrichting met een geaarde Kooi van Faraday.
- Breng de druppels langzaam in zacht contact
het manipuleren van de horizontale posities van de elektroden totdat de gebruiker de druppels ziet vervormen door contact of elkaar begint te verplaatsen en een paar minuten wacht tot de bilayer-vorming begint. Als na enkele minuten geen tweelaagse is gevormd, kunnen de druppels meer samen worden gedwongen om de vorming van tweelagen te vergemakkelijken. De vorming van een verdunde interfaciale tweelaagse kan worden bevestigd door visuele inspectie (figuur 5a) of door het meten van de toename van de amplitude van een kwadraatgolfvorm capacitieve stroom veroorzaakt door een golfvormgenerator die een driehoekige spanning van 10 mV, 10 Hz22uitvoert . Laat de tweelaagse minimaal 10 minuten equilibreren om een stabiel interfaciale zone te bereiken, bij de eerste vorming en voorafgaand aan de daaropvolgende karakterisering op het eerste instelpunt.
OPMERKING: Het type olie kan een aanzienlijke invloed hebben op het dunner worden van twee lagen, de dikte van het membraan en de contacthoek tussen druppels. Over het algemeen, hoe kleiner het oliemolecuul, hoe gemakkelijker het in de hydrofobe kern van de tweelaagse kan blijven die wordt ingenomen door lipide acylketens. Olieretentie verhoogt zowel monolaag- als tweelaagse spanningen en dikte en vermindert het gebied en de contacthoek tussen druppels. Deze statistieken duiden op een zwakkere hechtingstoestand. Grotere, omvangrijkere moleculen oefenen het tegenovergestelde effect uit. Squaleen is bijvoorbeeld een omvangrijker molecuul dan alkanen zoals hexaderiet, waardoor het gemakkelijk kan worden uitgesloten van tussen monolagen tijdens het uitdunnen van twee lagen. Als zodanig zijn DIBs gevormd in squaleen dunner, vertonen ze hogere contactgebieden en hoeken en vertonen ze hogere vrije energieën van vorming22,42 (een maat voor de hechting van druppeldruppels).
4. Karakterisering van temperatuurafhankelijk gedrag in DIBs
OPMERKING: Veel fysieke processen kunnen worden bestudeerd in op DIB gebaseerde modelmembranen, waaronder hoe temperatuurveranderingen de structuur en transporteigenschappen van het membraan beïnvloeden. De volgende stappen moeten worden uitgevoerd na succesvolle tweelaagse vorming bij een gewenste temperatuur.
- Meet de nominale capaciteit van het membraan terwijl de temperatuur van het oliebad wordt verlaagd vanaf een vast punt dat bilaagvorming mogelijk maakt om thermotrope faseovergangen van de lipiden in het membraan te identificeren38.
- Klik met de rechtermuisknop op de temperatuurgrafiek op de GUI en wis de weergegeven gegevens. Dit zorgt ervoor dat er voldoende ruimte in de buffer beschikbaar is voor volgende opnames.
- Breng met behulp van de golfvormgenerator die op de patchklemversterker is aangesloten een driehoekige spanningsgolfvorm (bijv. 10 mV, 10 Hz) over de DIB-elektroden en noteer de geïnduceerde stroomrespons via de tweelaagse.
- Koel de bilayer af door de ingestelde punttemperatuur in stappen van 5 °C te verlagen en minimaal 5 minuten te wachten bij de nieuwe steady state temperatuur tussen temperatuurveranderingen totdat de gewenste temperatuur is bereikt. U kunt ook proberen de tweelaags passief te koelen door het feedbackcontrolesysteem uit te schakelen. Houd er echter rekening mee dat experimenten met passieve koeling van 50-60 °C resulteerden in hogere coalescentiesnelheden.
- Nadat het oliebad en de tweelaagse koelt tot de gewenste minimumtemperatuur, klikt u met de rechtermuisknop nogmaals op de temperatuurgrafiek in de GUI en exporteert u de temperatuurgegevens versus tijd naar een spreadsheetsoftware. Stop de huidige opname.
- Bereken op de gemeten stroom de nominale capaciteit van de vierkante golfstroomrespons versus de tijd tijdens de afkoelperiode.
- Zet de nominale capaciteit (C) versus temperatuur (T) in om te observeren hoe de membraanvermogen veranderde. Zoek niet-monotonische veranderingen in C versus T om TMte identificeren .
OPMERKING: Nominale capaciteit kan worden berekend op basis van de amplitude van vierkante golfstroom43 (| Ik |) de relatie | Ik | = C dv/dt, waarbij dv/dt gelijk is aan vier keer het product van de spanningsamplitude (| V|) en frequentie (f) van de toegepaste driehoeksspanning. Uit deze vergelijkingen wordt C = | Ik |/(4| V|f).
- Beoordeel ook de quasistatische specifieke capaciteit (Cm) van de bilaag bij vaste temperaturen door achtereenvolgens de temperatuur van het oliebad en het bilaaggebied te verhogen.
- Wijzig de ingestelde punttemperatuur in stappen van 10 °C met behulp van de GUI en laat het systeem gelijk zijn aan de nieuwe temperatuur.
- Voer stap 4.1.2 uit om de meting van capacitieve stroom en opname te starten.
- Verander het bilayer-gebied door de posities van de elektroden zorgvuldig aan te passen met behulp van de micromanipulatoren (d.w.z. het scheiden van de elektroden vermindert het bilayer-gebied). Laat de vierkante golfstroom een steady state amplitude bereiken en verzamel beelden van de DIB om berekening van membraangebied versus tijd mogelijk te maken door een camera te gebruiken die op de microscoop is gemonteerd om de tweelaagse afbeelding te maken, gezien vanaf het diafragma van het microscoopstadium. Voeg tegelijkertijd een digitale tag toe in de huidige opnamesoftware om het bijbehorende tijdspunt voor het verzamelen van afbeeldingen te markeren.
OPMERKING: Micromanipulatoren zorgen voor een nauwkeurige regeling van de elektroden en dus voor een zacht contact tussen druppeltjes. Grove manipulatie van de druppels kan leiden tot een mislukt experiment door coalescentie van de druppels of door een druppel van de elektrode te laten vallen. Zoals elders besproken22, wordt het tweelaagse gebied berekend op basis van de contactlengte tussen druppels, die verschijnen als overlappende cirkels in een afbeelding onderin. De posities en afmetingen van de druppels en de lengte van de contactlijn kunnen worden berekend met behulp van een beeldverwerkingssoftware of met andere wetenschappelijke programmeertools. - Herhaal stap 4.2.1.2 minimaal 4 keer om in totaal 5 DIB-beelden en steady-state gebieden met tweelaagse stroom te verkrijgen.
- Herhaal stap 4.2.1 bij elke gewenste temperatuur.
- Op de gelabelde tijdspunten die overeenkomen met steady-state bilayer-gebieden voor verworven beelden, analyseert u de huidige opnamen en DIB-afbeeldingen om C- en A-gegevens voor elke temperatuur te extraheren.
- Plot C versus A-gegevens voor elke temperatuur en bereken de helling van een regressie van de eerste orde, die de Cm van de bilayer vertegenwoordigt bij elke temperatuur22.
- Plotwaarden van Cm verkregen uit stap 4.2.4 versus T.
- Onderzoek de Cm versus T-gegevens op niet-monotone variaties om smelttemperaturen te identificeren, TM.
- Wijzig de ingestelde punttemperatuur in stappen van 10 °C met behulp van de GUI en laat het systeem gelijk zijn aan de nieuwe temperatuur.
- Beoordeel de dynamiek van spanningsafhankelijke ionenkanaalvorming door een gelijkspanningsstapingang over de tweelaagse te genereren.
- Stel de beginspanning in op de gewenste stapwaarde in mV (bijv. 100 mV).
- Stel eindspanning en stapgrootte in op een waarde die hoger is dan de gewenste stap (bijv. 110 mV eindspanning en 110 mV stapgrootte).
- Stel een gewenste duurtijd in voor de stapinvoer in seconden (bijv. 90 s).
- Kies de gewenste polariteit voor de stapinvoer (bijv. positief).
- Schakel de patchklemversterker om de opdrachtspanning afkomstig van de GUI/voltage-uitgangsmodule naar de headstage te sturen.
- Start de huidige opnames.
- Schakel de spanning in en noteer de geïnduceerde stroomrespons, die een S-vormige respons op een kritische spanning moet vertonen (bijv. ~ 70 mV voor 1 μg/ml Mz in 2 mg/ml BTLE).
- Afzonderlijk kunnen dynamische stroom-spanningsrelaties voor een membraan worden verkregen bij de gewenste temperaturen om spanningsafhankelijke relaties te onthullen, zoals ionenkanaalgedrag.
- Schakel de patchklemversterker om de commandospanning afkomstig van de golfvormgenerator naar de headstage te sturen en stroomopnamen te starten.
- Op de golfvormgenerator voert u een continue sinusoïdale golfvorm uit met een gewenste amplitude, offset en frequentie.
- Noteer de geïnduceerde huidige respons in één of meerdere cycli.
- Herhaal dit naar wens voor verschillende sinusamplitudes en frequenties en temperaturen.
Figuur 3: De GUI voor temperatuurregeling. Deze afbeelding markeert en labelt de kritieke stappen die nodig zijn om de GUI van het programma te gebruiken om de temperatuur van het oliebad te regelen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figuur 1 laat zien hoe het aluminium armatuur en het acryloliereservoir op het microscoopstadium worden voorbereid op DIB-vorming. Montagestappen 1.2-1.4 dienen om het armatuur vanaf het podium thermisch te isoleren voor efficiëntere verwarming. Stap 1.5-1.7 laat zien hoe u het thermokoppel op de juiste manier aan het armatuur bevestigt en het oliereservoir plaatst, en stap 1.8 -1.9 toont de aanbevolen plaatsen voor het doseren van olie in deze stukken.
Figuur 2 geeft een overzicht van de componenten die worden gebruikt om de temperatuurregeling van de feedback vast te stellen en elektrische metingen uit te voeren op een DIB: een pc, een versterker met vaste versterking, een patchklemversterker en een DAQ-systeem (of een gelijkwaardig instrument voor het toepassen van spanning en het meten van pA-nA-niveaustromen), een tweede DAQ met geschikte analoge in- en uitgangen, een golfvormgenerator en de gemonteerde aluminium armatuur met aangesloten weerstandsverwarmers. DAQ-2 maakt gebruik van twee modules (Figuur 2b). Een 4-kanaals, ±10 V, 16-bits analoge spanningsuitgangsmodule wordt gebruikt om de onafhankelijke spanningen te starten die worden geleverd aan de ingang van de eindversterker (blauwe aansluiting in figuur 2a) en een externe opdrachtingang op de patchklemversterker (groene aansluiting). De spanningsuitgangsmodule wordt beperkt door een maximale uitgangsstroom van 46 mA en een maximale uitgangsspanning van 10 V, terwijl elk hierin gebruikt verwarmingselement maar liefst 5 W vermogen (~ 180 mA max) verbruikt bij een maximale spanning van 28 V. Om deze reden werd de voeding/versterker meegeleverd om de uitgangsspanning voor te versterken en de meegeleverde stroom aan te vullen die nodig is voor het voeden van de verwarmingselementen (parallel bedraad) die aan de aluminium armatuur zijn bevestigd. Een 4-kanaals, 24-bits thermokoppelingang wordt gebruikt om temperatuurmetingen vanuit het oliereservoir in de buurt van de DIB (gele aansluiting) te digitaliseren. Aangezien de module van het thermokoppelingangsapparaat tot 4 thermokoppels toestaat, kan de gebruiker overwegen om de temperaturen op andere plaatsen in het armatuur te controleren. Als dit wordt gedaan, moeten ze ook overwegen welk signaal of combinatie van signalen wordt gebruikt voor vergelijking met de gewenste ingestelde punttemperatuur binnen de feedbacklus.
Deze uitgangen en gemeten signalen worden geregeld via twee software: 1) de aangepaste GUI voor temperatuurregeling; en 2) elektrofysiologie meetsoftware. Figuur 3 toont een schermafbeelding van de GUI en bevat aantekeningen bij de bijbehorende stappen in het protocol. De GUI wordt gebruikt om belangrijke parameters te definiëren (Set Point temperature, PI control gains, voltage limits), de gemeten temperatuur te vergelijken met de ingestelde punttemperatuur en het stuursignaal te berekenen dat aan de versterker en vervolgens de verwarmingselementen wordt geleverd, en gegevens van de temperatuur en toegepaste spanning versus tijd vast te leggen. Dit programma omvat ook de mogelijkheid om de spanning te regelen die wordt toegepast op DIB-elektroden (figuur 2c) via de patchklemversterker. Afzonderlijk wordt meetsoftware gebruikt om metingen te configureren van zowel de spanning die op de DIB-elektroden wordt toegepast als de geïnduceerde stroom door de lipide-bilayer. Een spanning die evenredig is met de DIB-stroom wordt door de patchklemversterker uitgevoerd en via de BNC-kabel naar DAQ-1 gestuurd (aansluiting niet weergegeven).
Figuur 4 geeft een beeld van de verandering in temperatuur en absoluut elektrisch vermogen die naar de kachels wordt gestuurd ten opzichte van de tijd in zowel open-lus- als closed-loop verwarmingsscenario's. Voor de eerste werd een willekeurige ingangsspanning van ~ 5,2 W vermogen op de kachels toegepast, wat resulteerde in een exponentiële temperatuurstijging met een tijdconstante van ~ 125 s en een constante toestand ΔT ≈ 4,5 °C / W na een initiële vertraging van ~ 20 s. Deze kenmerken van het open-loop-systeem werden gebruikt om een model van het closed-loop-systeem te construeren in een simulatiesoftware (zie figuur S4 voor details) die kan worden gebruikt om waarden te bepalen voor de proportionele en integrale regelwinsten. De closed-loop en gesimuleerde modelresponsen in figuur 4 vertegenwoordigen dus de gemeten en gesimuleerde reacties van de afgestemde PI-controller, met KP- en KI-waarden van respectievelijk 0,598 en 0,00445 tot een ingestelde punttemperatuur van 20 °C hoger dan RT. In vergelijking met de open-loop-behuizing bevestigen zowel de simulatie als de metingen de verhoogde reactiesnelheid in het closed-loop-systeem (tijdconstante ~63 s). De verkorting van de verwarmingstijd gaat ten koste van een hoger initieel toegepast vermogen. Toch bleven de gewenste ingestelde punttemperatuur en de gemeten olietemperatuur in constante toestand binnen 0,6 °C, wat geschikt werd geacht voor gebruik. Het totale geleverde vermogen is beperkt binnen het programma tijdens gesloten-lusregeling om de totale vermogenslimiet van 10 W voor de twee kachels niet te overschaduwen.
Het temperatuurregelingssysteem werd gebruikt om de temperatuurafhankelijkheid van oplosmiddelen in een DIB gevormd uit BTLE-lipiden en de impact ervan op de membraancapacitantie te laten zien (figuur 5). BTLE lipiden werden gekozen voor deze meting omdat verwarming nodig is voor DIB-vorming als gevolg van een lipidefaseovergang die optreedt tussen 35-42 °C38. Het hierin beschreven protocol werd uitgevoerd om tweelaagse vorming bij 60 °C te initiëren. Na membraanvorming en equilibratie kan de temperatuur naar behoefte achtereenvolgens worden verlaagd of verhoogd om de reactie van het membraan te karakteriseren. Figuur 5a toont bijvoorbeeld representatieve metingen van ruwe capacitieve stroom (vierkante golfvorm) en temperatuur versus tijd tijdens een verwarmingscyclus van RT tot ~60 °C. Merk op dat de amplitude van de capacitieve stroomgolfvorm met meer dan de helft afneemt naarmate de temperatuur stijgt, wat wordt veroorzaakt door de opname van olie in de hydrofobe kern van het membraan. Deze wijziging verdikt de interface en wijzigt de zijdelingse spanning van de tweelaagse22,37,38.
De gegevens in figuur 5b document veranderen in C (genormaliseerd door de capaciteit bij 27 °C) versus T over één volledige koelverwarmingscyclus na de eerste tweelaagse vorming bij 60 °C. Net als in figuur 5adaalt de capaciteit als de temperatuur stijgt. Wat deze presentatie echter duidelijker laat zien, zijn de niet-monotonische veranderingen die optreden bij temperaturen tussen ~ 30-42 °C, wat de collectieve smelttemperatuur, TM, vertegenwoordigt, waarbij het lipidemengsel overgaat tussen een vloeistofbeorde en een vloeistofgeordeneerde thermotrope fase. De temperatuur waarbij de niet-monotonische verandering in capaciteit optreedt , komt overeen met een verandering in de dikte van de tweelaagse van uitsluiting van olie uit het membraan38. Merk ook op dat de hysterese die wordt weergegeven tussen de verwarmingscyclus en de koelcyclus te wijten is aan onomkeerbare veranderingen in het bilayer-gebied die optreden tussen volgende cycli, die meestal 10 minuten uit elkaar werden uitgevoerd.
Evenzo laat figuur 6a, b zien hoe quasistatische metingen van C m bij verschillende temperaturen kunnen worden gebruikt om TMte identificeren . Hier wordt het gebied van het membraan achtereenvolgens gevarieerd door handmatig de afstand tussen de druppelelektroden te vergroten. Tijdens dit experiment worden de druppels eerst tegen elkaar geschoven om het maximale membraanoppervlak te bevorderen voordat het contactoppervlak vervolgens wordt afneemt met stapsgewijze scheidingen tussen de elektroden. Op elk contactniveau wordt de nominale capaciteit van de tweelaags beoordeeld aan de hand van de geïnduceerde stroom en wordt het gebied bepaald door middel van beeldanalyse. Het plotten van C versus A zorgt voor een lineaire regressie, waarbij de helling de waarde van Cm vertegenwoordigt zoals weergegeven in figuur 6a. Het herhalen van deze procedure bij meerdere temperaturen (figuur 6b) toont aan dat Cm met bijna 50% afneemt bij temperaturen boven TM, wat een toename van de hydrofobe dikte van het membraan bevestigt als gevolg van de opname van hexaderiet door verwarming (zie figuur S5 voor volledige C versus A-gegevens). Bij hogere temperaturen vermindert het extra oplosmiddel in het membraan ook het maximale contactgebied tussen de druppels, en dus de maximale nominale capaciteit. Het verlagen van de temperatuur keert deze effecten om. Het DIB-beeld in figuur 6c laat zien dat wanneer de temperatuur (25 °C) ver onder TMligt, het membraan stabiel een zeer zelfklevende toestand kan aannemen- zelfs onder de spanning van uitgerekt druppels veroorzaakt door goed gescheiden elektroden. Dit is het resultaat van volledige uitsluiting van hexadecane uit de tweelaagse, wat de hechtingsenergie van de druppels verhoogt. In deze toestand kan het bilaaggebied niet betrouwbaar worden gewijzigd door manipulatie van de elektroden en belemmert het de mogelijkheid om de specifieke capaciteit nauwkeurig te meten (zie figuur S5 voor meer informatie).
Ten slotte laten de representatieve gegevens in figuur 7 zien hoe temperatuurveranderingen het gedrag van porievormende soorten kunnen beïnvloeden die iongeleidende kanalen via een DIB creëren. Monazomycine (Mz), een positief geladen antibioticum dat kation selectieve kanalen vormt via de bilayer bij voldoende transmembrane potentialen37,44, werd gekozen om deze relatie aan te tonen. Deze metingen werden uitgevoerd op basis van EEN BTLE (2 mg/ml eindconcentratie in beide druppels) DIB gedoseerd met Mz (1 μg/ml eindconcentratie in beide druppels). De stroom versus spanningssporen in figuur 7a werden verkregen door sinusvormige membraanspanningen toe te passen en de geïnduceerde stroom bij twee verschillende temperaturen te meten; de pijlen en de daaropvolgende getallen in figuur 7a helpen bij het visualiseren van de opeenvolgende kwartalen van de sinusvormige spanning met betrekking tot de tijd. Dit type meting wordt vaak uitgevoerd om de spanningsafhankelijkheid van stroom via ionenkanalen te onderzoeken. Uit de gegevens hier blijkt dat het verhogen van de temperatuur van de DIB van 27 °C naar 45 °C ervoor zorgt dat de drempel voor kanaalvorming stijgt van ~|100 mV| naar ~|110 mV|. Deze verandering, waarschijnlijk veroorzaakt door de hogere membraandikte als gevolg van geabsorbeerde olie, toont aan dat de energiebarrière voor inbrengen is gestegen. De hysterese in deze krommen - wat geheugenweerstand betekent - kan worden veroorzaakt door spanningsgeïnduceerde veranderingen in het tweelaagse gebied of de kinetiek van Mz-kanaalvorming en -inactivatie44.
Om deze factoren in DBB's te helpen scheiden, kunnen voorbijgaande veranderingen in ionenstroom worden gemeten als reactie op een DC-stapspanning. Figuur 7b toont de gemeten stroomdichtheid voor hetzelfde Mz-doped BTLE-membraan bij hetzelfde spanningsniveau (+90 mV) en twee verschillende temperaturen (27 °C en 45 °C). De gegevens laten duidelijk zien dat de kinetiek van de kanaalreacties heel anders is. Met name bij 27 °C vertoont het membraan een snellere, grotere toename van de stroom die vervolgens wordt gevolgd door een voorbijgaand verval (dit laatste is het gevolg van Mz-kanalen die over de tweelaagse naar een inactieve toestand worden verplaatst44). De respons is veel meer gedempt bij 45 °C, waarbij de S-vormige stijging van de stroom niet wordt voortgezet door een volgende daling. Verschillen zoals deze zijn nuttig voor het beoordelen van de kinetiek van kanaalreacties en het begrijpen hoe deze kunnen bijdragen aan de totale dynamische weerstand van het membraan.
Figuur 4: Open-loop versus closed-loop verwarming. Paneel (a) vergelijkt de tijdresponsen voor het gemeten en gesimuleerde (zie SI) gesloten-lussysteem met een temperatuurstap van +20 °C met de open-lus verwarmingsrespons onder vast toegepast vermogen. Paneel (b) geeft het vermogen weer dat door elk systeem wordt afgevoerd. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 5: Meten van capaciteit en wisselende temperatuur. De typische vierkante golfvormstroomrespons op een driehoekige golfvorm van 10 mV en 10 Hz op een BTLE-lipidembraan dat een faseovergang ondergaat, wordt weergegeven in (a). De faseovergang van de lipiden is ook te zien in de oppervlaktemetingsgegevens die boven paneel (a) worden weergegeven. De capaciteit genormaliseerd door initiële capaciteit bij 27 °C wordt weergegeven in paneel (b) uitgezet als functie van de temperatuur voor een verwarmings- en koelcyclus. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 6: Specifieke capaciteitsmetingen Paneel (a) toont de nominale capaciteit versus het bilaagoppervlak dat bij opeenvolgende contactgebieden voor twee verschillende temperaturen is verkregen. Lineaire regressies naar elke verzameling worden gebruikt om hun respectieve waarden van CMte bepalen . Paneel (b) plot CM versus T, terwijl paneel (c) de stabiele capacitieve stroomgolfvorm (links) en het contactgebied (rechts) onder poging tot druppelscheiding bij 25 °C weergeeft. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 7: Spanningsafhankelijke membraanweerstand en Mz ion-kanaal kinetiek versus temperatuur. Paneel (a) laat zien hoe de stroomspanningsverhouding verandert met de temperatuur voor BTLE DIBs gevormd tussen druppels die 1 μg/ml Mz bevatten. De pijlen en getallen vertegenwoordigen de opeenvolgende delen van de toegepaste sinusgolf. De verschillen in deze sporen illustreren hoe de temperatuur de spanningsdrempel voor Mz-invoeging verschuift, wat wordt geïdentificeerd als de grootte van de spanning waar de geïnduceerde stroom sterk toeneemt. Evenzo toont paneel (b) de impacttemperatuur op de transiënte stroomrespons veroorzaakt door een DC-stapspanning van 90 mV. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur S1: Aluminium armatuur. Deze tekening toont de nodige afmetingen en kenmerken voor de fabricage van de aluminium armatuur die de basis is van het verwarmde podium. De vlakke plekken van 25,2 mm X 26 mm naast de oliebron zijn ontworpen om een maximale hoeveelheid contact op het oppervlak tussen het armatuur en de verwarmingselementen voor warmtegeleiding mogelijk te maken. Evenzo werd aluminium gekozen voor het basisarmatuurmateriaal vanwege de hoge thermische geleidbaarheid. Het M3 X 0,5 mm schroefgat dat in de print wordt genoemd, wordt gebruikt om het thermokoppel in de olieput te bevestigen en te plaatsen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Figuur S2: Acryl substraat. Het acrylsubstraat is relatief eenvoudig te fabriceren, zonder kritieke uitstekende kenmerken, behalve het profiel. Het buitenprofiel is ontworpen met Poka -juk in het achterhoofd, zodat het acrylsubstraat alleen zo in het armatuur kan worden georiënteerd dat er voldoende ruimte is voor het thermokoppel om in de olieput te passen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Figuur S3: Verwarmde podiummontage. Een geëxplodeerd beeld van het geassembleerde verwarmde podium is verstrekt om de experimenteerder te helpen tijdens de eerste installatie. Let ook op het gebied dat wordt gemarkeerd door de onderbroken cirkel, omdat dit de ideale positie is om de aluminium armatuur tijdens protocolstap 1.8 met olie te vullen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Figuur S4: Open lusgegevens en Simulink-modelleringspaneel. a) toont de open-lus temperatuurreacties op verschillende dc-vermogensniveaus die werden gebruikt om de vertragingstijd, td, de tijdconstante, τ, en open-loop verwarmingswinst, α, van het systeem te beoordelen. De vertragingstijd vertegenwoordigt de vertraging voordat de temperatuur begint te stijgen (~ 20 s). Elke waarde van τ (gemarkeerd door *, ~125 s) wordt gedefinieerd als de tijd die nodig is om 63,2% van de totale temperatuurstijging te laten plaatsvinden. Paneel (b) toont de steady state verandering in temperatuur (∆T) ten opzichte van het toegepaste vermogen. De helling van de gegevens die in (b) zijn geplot, werd gebruikt om de αte berekenen, wat de verhouding van temperatuurverandering per geleverd vermogen vertegenwoordigt. Deze parameters werden gebruikt in het model dat in paneel (c) wordt weergegeven en als aanvullend bestand geleverd om de PI-controller af te stemmen om een gewenste temperatuurregelingsrespons met gesloten lus te bereiken. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Figuur S5: Aanvullende specifieke capaciteitsgegevens. De percelen in figuur 6ab zijn samengesteld uit deze CM-dataset. Dit perceel toont ook het onvermogen om de capaciteit nauwkeurig te meten bij temperaturen van 25 °C en lager, daarom werd deze meting uitgesloten van de dataset. De gebiedsveranderingen die nodig zijn voor een nauwkeurige Cm-meting vereisen dat er overmatige kracht wordt uitgeoefend op de druppels van de micromanipulatoren, wat een scheiding van de vorm en het contactoppervlak van de druppels veroorzaakt. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende coderingsbestanden. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het hierin beschreven protocol bevat instructies voor het assembleren en bedienen van een experimenteel systeem om de temperatuur van de olie en druppels die worden gebruikt om DIBs te vormen, te regelen. Het is vooral gunstig voor het mogelijk maken van DIB-vorming met behulp van lipiden met smelttemperaturen boven RT. Bovendien kan de tweelaagstemperatuur worden gemanipuleerd door de temperatuur van het oliereservoir nauwkeurig te variëren om de effecten van verhoogde temperaturen op verschillende membraaneigenschappen en -kenmerken te bestuderen, waaronder capaciteit, gebied, dikte, geïnduceerde thermotropische faseveranderingen, kinetiek van membraanactieve soorten en de energetica van adhesie van de bilayer-interface37,38.
Het protocol bestaat uit drie delen voorafgaand aan gebruik in een DIB-studie: 1) voorbereiding en montage van de verwarmde podiumarmatuur; 2) het verbinden van de verschillende instrumenten; en 3) het bevestigen van geschikte temperatuurcontroleprestaties met de gekozen proportionele en integrale controlewinsten. Het belangrijkste in deel 2 is dat de gebruiker ervoor moet zorgen dat er geen gedeelde geleidingspaden zijn tussen de uitgang van de eindversterker (>mA-stromen) en de kop van de patchklem (pA-nA-stromen). Een onbedoelde kortsluiting kan permanente schade aan het hoofdpodium veroorzaken. Bovendien helpt het zorgen dat de pc en alle instrumenten zijn aangesloten op een gemeenschappelijke wisselstroomgrond en het gebruik van een geaarde Faraday-kooi in de buurt van de headstage- en druppelelektroden om ruis te minimaliseren bij tweelaagse stroommetingen. Nadat de installatie in deel 2 is voltooid, moet de gebruiker eerst de open-lusverwarmingsrespons van het oliereservoir beoordelen door een vaste spanning op de verwarmingselementen aan te brengen en de daaropvolgende temperatuurstijging vast te houden (zoals weergegeven in figuur 4a). Dit type exponentiële respons kan worden gebruikt om een eenvoudig model van het closed-loop-systeem te definiëren en te simuleren voor verschillende waarden van controlewinsten (zie figuur S4 voor meer informatie). De hier gerapporteerde regelwinsten stellen het systeem in staat om snel (~ 2 minuten) tot een gewenst temperatuurniveau te verwarmen en met weinig overschrijding de ingestelde puntwaarde nauwkeurig te handhaven. Maar de specifieke winst die nodig is, hangt af van het vermogensniveau van de verwarmingselementen en de geometrie van het armatuur dat het oliereservoir ondersteunt. Zodra geschikte waarden van controlewinsten zijn bepaald en het feedbackcontrolesysteem naar wens werkt, kan de gebruiker dan beginnen met het assembleren en karakteriseren van een DIB.
Het protocol verandert het proces van DIB-vorming of karakterisering niet, maar er zijn beperkingen en overwegingen. Het verhogen van de temperatuur van de olie kan van invloed zijn op hoe druppels aan de elektroden hangen, als gevolg van verminderingen van monolaagspanning en oliedichtheid die druppelverslapping en convectieve stromen in de olie verhogen die de druppels kunnen verplaatsen. Daarom stelt het protocol voor om de uiteinden van de elektroden te verlagen tot in de buurt van het onderste oppervlak van het substraat, zodat druppels worden ondersteund en stilgehouden door het acrylreservoir. De gebruiker moet beoordelen in hoeverre het substraat de druppels kan vervormen (indien te ver verlaagd), en deze vervorming in aanmerking nemen bij de berekening van het gebied van de tweelaagse uit afbeeldingen van DIBs zoals elders besproken22.
Hoewel het beschreven systeem beperkt is tot het verwarmen van het oliebad, kan een Peltier-koelapparaat worden gebruikt in plaats van de resistieve verwarmingselementen als testen bij temperaturen onder RT nodig is. In dit geval moet de gebruiker echter rekening houden met het vriespunt van de oliefase. Veel alkanen bevriezen bij temperaturen hoger dan 0 °C; hexadecane dat hierin wordt beschreven, bevriest bij 18 °C. Als de olie bevriest, kunnen druppels niet meer worden verplaatst en kan een tweelaagse tussen druppeltjes onstabiel of gescheurd worden.
Voor een voorheen niet-geteste lipidesamenstelling zijn de belangrijkste onbekenden de incubatietijd en temperatuur die nodig zijn om voldoende monolaagassemblage op de oppervlakken van de druppels mogelijk te maken. De algemene regel is om de olie te verwarmen tot een temperatuur boven TM, waar de lipidemobiliteit wordt verbeterd, waardoor snellere laterale diffusie en strakkere verpakking mogelijk is bij de olie-waterinterface45, en lang genoeg wachten zodat monolayer verpakking op de olie-water interface hoog is. De gebruiker kan gepubliceerde literatuur bekijken of zijn eigen aanvullende metingen overwegen om geschikte tijd- en temperatuurwaarden te bepalen: interfaciale spanningsmetingen op een druppelgoniometer van een hanger kunnen worden gebruikt om de tijd te beoordelen die nodig is voor monolaagassemblage46 en differentiële scanningcalorimetrie wordt vaak gebruikt om thermotrope overgangen van lipiden te identificeren38. Of een iteratieve benadering kan worden nagestreefd om geschikte tijd en temperatuur te identificeren waar de vorming van twee lagen consistent is, het membraan langer dan een paar minuten stabiel is en de weerstand van de tweelaagse >1 GΩ is. In recente studies met E. coli total lipid extract (ETLE)37 en BTLE38,47 leidt een starttemperatuur >50 °C consequent tot stabiele bilayer vorming. Evenzo kan de minimale stabiele temperatuur na DIB voor een bepaald lipidentype ook variëren tussen lipidenselecties. ETLE DIBs kunnen bijvoorbeeld worden afgekoeld tot 25 °C37, terwijl DPPC-DBB 's met één component altijd onder TM~40 °C38samensmelten . Uit observatie is gebleken dat BTLE DIBS aantoont dat 27 °C een veilige minimumtemperatuur is voor het handhaven van een stabiele tweelaagse.
Onze representatieve resultaten laten zien dat temperatuurveranderingen de eigenschappen van de resulterende DIB sterk kunnen beïnvloeden. De gegevens in figuur 5 laten zien dat de nominale capaciteit van het membraan afneemt naarmate de temperatuur stijgt. Omdat capaciteit, C, direct evenredig is met het tweelaagse gebied, A, en omgekeerd evenredig met dikte, d, zoals gegeven door
, (1)
een afname van C kan zich manifesteren door een afname van A, een toename van d, of beide (uitgaande van een vaste diëlektrische permittiviteit, ε). Deze relaties motiveren het gebruik van capaciteitsmetingen en DIB-beelden om veranderingen in C, Aen Cm versus temperatuur te beoordelen om te bepalen welke effecten significant zijn. Uit de gegevens in figuur 5 en figuur 6 voor BTLE DIBs blijkt dat zowel C als Cm (wat de verhouding ε/dvertegenwoordigt ) met bijna 50% dalen naarmate de temperatuur stijgt van 30 C naar 60 C. Samen geven deze aan dat een hogere temperatuur de tweelaags verdikt, als gevolg van een verhoogde oplosbaarheid van de acylketens van de lipiden in hexadecane48. De extra olie in het membraan kan ook van invloed zijn op de interfaciale spanning van de tweelaagse en de contacthoek tussen druppeltjes22,38. Deze effecten kunnen worden gekwantificeerd door afbeeldingen van een DIB te analyseren met door de gebruiker opgegeven tijdsintervallen om het bilaaggebied en de contacthoek tijdens verwarming en koeling te bewaken.
De temperatuurbegunstiging van olie in het membraan kan ook worden gebruikt om thermotrope smelttemperaturen van de lipiden te beoordelen en de kinetiek van het ionkanaal te beïnvloeden. De smelttemperatuur voor een lipidenmengsel kan worden gedefinieerd door niet-monotonische veranderingen in C- versus T-relaties te lokaliseren zoals in figuur 6. Uit de huidige metingen in figuur 7 blijkt verder dat temperatuurgeïnduceerde veranderingen in fase (d.w.z. vloeibaarheid) en dikte van invloed kunnen zijn op de drempelspanning voor het inbrengen van ionoforen zoals Mz. Deze fysieke associaties zijn belangrijk voor het begrijpen van ionenkanaalgedrag in modelmembranen, vooral in scenario's die gericht zijn op het repliceren van lichaamstemperatuuromgevingen. Ze kunnen echter ook nuttig zijn voor het afstemmen van de geleidbaarheid van de tweelaagse in toepassingen zoals neuromorfe computerapparaten47 Verhoogde kanaalkinetiek is bijvoorbeeld een wenselijk kenmerk bij het fabriceren van apparaten met geheugenweerstand die de snelheid, functionaliteit en plasticiteit van de hersenen op korte termijn moeten nabootsen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenverstrengeling.
Acknowledgments
Financiële steun werd verleend door de National Science Foundation Grant CBET-1752197 en de Air Force Office of Scientific Research Grant FA9550-19-1-0213.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 25 mm x 40 mm x 1 mm insulative rubber (x2) | Any | Insulates the bottom of the aluminum fixture from the stage of the microscope | |
| 25 mm x 40 mm x 6 mm insulative rubber (x2) | Any | Protects heating elements from being damaged by the microscope stage clips and insulates the top of the heating elements. | |
| 3-(N-morpholino) propanesulfonic acid | Sigma Aldrich | M3183 | Buffering agent for lipid solution |
| Acrylic substrate | Fabricated in house | HTD_STG_2 | ~1000 uL acrylic well with a poka-yoke exterior profile to fix orientation |
| Aluminum fixture | Fabricated in house | HTD_STG_1 | Base fixture with an oil well that holds the acylic fixture and includes two flat pads adjacent to the oil well for the heating elements |
| Brain Total Lipid Extract | Avanti | 131101C-100mg | 25 mg/mL porcine lipid extract |
| Compact DAQ Chassis (cDAQ) | National Instruments | cDAQ-9174 | Chassis to house multiple types of sensor measurement or output modules |
| Data Acquisition System (DAQ) | Molecular Devices | Digidata 1440A | High resolution analog to digital converter |
| Fixed gain amplifier/power supply | Hewlitt Packard | HP 6826A | Amplifies DC voltage output from the voltage output module |
| Glass Cover Slip | Corning | CLS284525 | Seals bottom of aluminum base and allows for optical characterization of the bilayer |
| Heating element (x2) | Omega | KHLV-101/5 | 25 mm x 25 mm polymide film kapton heating element with a 5 watt power limit. |
| M3 Stainless Steel Screw | McMaster Carr | 90116A150 | Secures thermocouple to aluminum fixture |
| Patch clamp amplifier | Molecular Devices | AxoPatch 200B | Measures current and outputs voltage to the headstage |
| Personal computer | Any | Computer with mulitiple high speed usb ports and a minimum of 6 Gb of ram | |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P3911 | Electrolyte solution of dissociated ions |
| Temperature input module | National Instruments | NI 9211 | Enables open and cold junction thermocouple measurements for the cDAQ chassis |
| Thermocouple | Omega | JMTSS-020U-6 | U-type thermocouple with a diameter of 0.02 inches and 6 inches in length |
| UV Curable Adhesive | Loctite | 19739 | Secures glass coverslip to aluminum base fixture |
| Voltage output module | National Instruments | NI 9263 | Analog voltage output module for use with the cDAQ chassis |
| Waveform generator | Agilent | 33210A | Used to output a 10 mV 10 Hz sinusoidal waveform |
References
- van Meer, G., de Kroon, A. I. P. M.
- Bayley, H., et al.
- Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H.
- Holden, M. A., Needham, D., Bayley, H. Functional bionetworks from nanoliter water droplets. Journal of the American Chemical Society. 129 (27), 8650-8655 (2007).
- Sarles, S. A., Leo, D. J. Physical encapsulation of droplet interface bilayers for durable, portable biomolecular networks. Lab on a Chip. 10 (6), 710-717 (2010).
- Stanley, C. E., et al. A microfluidic approach for high-throughput droplet interface bilayer (DIB) formation. Chemical Communications. 46 (10), 1620-1622 (2010).
- Gross, L. C. M., Heron, A. J., Baca, S. C., Wallace, M. I. Determining membrane capacitance by dynamic control of droplet interface bilayer area. Langmuir. 27 (23), 14335-14342 (2011).
- Huang, J., Lein, M., Gunderson, C., Holden, M. A. Direct quantitation of peptide-mediated protein transport across a droplet, interface bilayer. Journal of the American Chemical Society. 133 (40), 15818-15821 (2011).
- Leptihn, S., Thompson, J. R., Ellory, J. C., Tucker, S. J., Wallace, M. I. In vitro reconstitution of eukaryotic ion channels using droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 133 (24), 9370-9375 (2011).
- Castell, O. K., Berridge, J., Wallace, M. I. Quantification of membrane protein inhibition by optical ion flux in a droplet interface bilayer array. Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3134-3138 (2012).
- Dixit, S. S., Pincus, A., Guo, B., Faris, G. W. Droplet shape analysis and permeability studies in droplet lipid bilayers. Langmuir. 28 (19), 7442-7451 (2012).
- Elani, Y., deMello, A. J., Niu, X., Ces, O. Novel technologies for the formation of 2-D and 3-D droplet interface bilayer networks. Lab on a Chip. 12 (18), 3514-3520 (2012).
- Michalak, Z., Fartash, D., Haque, N., Lee, S. Tunable crystallization via osmosis-driven transport across a droplet interface bilayer. CrystEngComm. 14 (23), 7865-7868 (2012).
- Punnamaraju, S., You, H., Steckl, A. J. Triggered release of molecules across droplet interface bilayer lipid membranes using photopolymerizable lipids. Langmuir. 28 (20), 7657-7664 (2012).
- Boreyko, J. B., Mruetusatorn, P., Sarles, S. A., Retterer, S. T., Collier, C. P. Evaporation-induced buckling and fission of microscale droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 135 (15), 5545-5548 (2013).
- Leptihn, S., et al. Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil. Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).
- Villar, G., Graham, A. D., Bayley, H.
- Barriga, H. M. G., et al. Droplet interface bilayer reconstitution and activity measurement of the mechanosensitive channel of large conductance from Escherichia coli. Journal of The Royal Society Interface. 11 (98), (2014).
- Boreyko, J. B., Polizos, G., Datskos, P. G., Sarles, S. A., Collier, C. P. Air-stable droplet interface bilayers on oil-infused surfaces. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (21), 7588-7593 (2014).
- Mruetusatorn, P., et al. Dynamic morphologies of microscale droplet interface bilayers. Soft Matter. 10 (15), 2530-2538 (2014).
- Najem, J., Dunlap, M., Sukharev, S., Leo, D. J. The gating mechanism of mechanosensitive channels in droplet interface bilayers. MRS Proceedings. , Cambridge University Press. 1755 (2015).
- Taylor, G. J., Venkatesan, G. A., Collier, C. P., Sarles, S. A. Direct in situ measurement of specific capacitance, monolayer tension, and bilayer tension in a droplet interface bilayer. Soft Matter. 11 (38), 7592-7605 (2015).
- Bayley, H., Cazimoglu, I., Hoskin, C. E. G.
- Oliver, A. E., et al. Protecting, patterning, and scaffolding supported lipid membranes using carbohydrate glasses. Lab on a Chip. 8 (6), 892-897 (2008).
- Maglia, G., et al. Droplet networks with incorporated protein diodes show collective properties. Nature Nanotechnology. 4 (7), 437-440 (2009).
- Najem, J. S., et al. Activation of bacterial channel MscL in mechanically stimulated droplet interface bilayers. Scientific Reports. 5, 13726 (2015).
- Freeman, E. C., Najem, J. S., Sukharev, S., Philen, M. K., Leo, D. J. The mechanoelectrical response of droplet interface bilayer membranes. Soft Matter. 12 (12), 3021-3031 (2016).
- Tamaddoni, N., Sarles, S. A. Toward cell-inspired materials that feel: measurements and modeling of mechanotransduction in droplet-based, multi-membrane arrays. Bioinspiration & Biomimetics. 11 (3), 036008 (2016).
- Restrepo Schild, V., et al. Light-patterned current generation in a droplet bilayer array. Scientific Reports. 7, 46585 (2017).
- Milianta, P. J., Muzzio, M., Denver, J., Cawley, G., Lee, S. Water permeability across symmetric and asymmetric droplet interface bilayers: Interaction of cholesterol sulfate with DPhPC. Langmuir. 31 (44), 12187-12196 (2015).
- Mruetusatorn, P., et al. Control of membrane permeability in air-stable droplet interface bilayers. Langmuir. 31 (14), 4224-4231 (2015).
- Wauer, T., et al. Construction and manipulation of functional three-dimensional droplet networks. ACS Nano. 8 (1), 771-779 (2013).
- Bayley, H. Building blocks for cells and tissues: Beyond a game. Emerging Topics in Life Sciences. 3 (5), 433-434 (2019).
- Booth, M., Restrepo Schild, V., Downs, F., Bayley, J. Droplet network, from lipid bilayer to synthetic tissues. Encyclopedia of Biophysics. , Springer. (2019).
- Booth, M. J., Cazimoglu, I., Bayley, H. Controlled deprotection and release of a small molecule from a compartmented synthetic tissue module. Communications Chemistry. 2 (1), 142 (2019).
- Gobbo, P., et al. Programmed assembly of synthetic protocells into thermoresponsive prototissues. Nature Materials. 17 (12), 1145-1153 (2018).
- Taylor, G. J., Sarles, S. A. Heating-enabled formation of droplet interface bilayers using escherichia coli total lipid extract. Langmuir. 31 (1), 325-337 (2015).
- Taylor, G. J., et al. Capacitive detection of low-enthalpy, higher-order phase transitions in synthetic and natural composition lipid membranes. Langmuir. 33 (38), 10016-10026 (2017).
- Lee, S., Kim, D. H., Needham, D. Equilibrium and dynamic interfacial tension measurements at microscopic interfaces using a micropipet technique. 2. Dynamics of phospholipid monolayer formation and equilibrium tensions at the water-air interface. Langmuir. 17 (18), 5544-5550 (2001).
- Najem, J. S., et al. Assembly and characterization of biomolecular memristors consisting of ion channel-doped lipid membranes. Journal of Visualized Experiments. (145), e58998 (2019).
- Wang, Y. G., Shao, H. H. Optimal tuning for PI controller. Automatica. 36 (1), 147-152 (2000).
- Needham, D., Haydon, D. A. Tensions and free energies of formation of "solventless" lipid bilayers. Measurement of high contact angles. Biophysical Journal. 41 (3), 251-257 (1983).
- Sarles, S. A., Leo, D. J. Physical Encapsulation of Interface Bilayers for durable portable biolayer network. Lab on a Chip. 10 (6), 710-717 (2010).
- Muller, R. U., Peskin, C. S. The kinetics of monazomycin-induced voltage-dependent conductance. II. Theory and a demonstration of a form of memory. The Journal of General Physiology. 78 (2), 201-229 (1981).
- Nenninger, A., et al. Independent mobility of proteins and lipids in the plasma membrane of Escherichia coli. Molecular Microbiology. 92 (5), 1142-1153 (2014).
- Venkatesan, G. A., et al. Adsorption kinetics dictate monolayer self-assembly for both lipid-in and lipid-out approaches to droplet interface bilayer formation. Langmuir. 31 (47), 12883-12893 (2015).
- Najem, J. S., et al. Memristive ion channel-doped biomembranes as synaptic mimics. ACS Nano. 12 (5), 4702-4711 (2018).
- Tamaddoni, N., Taylor, G., Hepburn, T., Michael Kilbey, S., Sarles, S. A. Reversible, voltage-activated formation of biomimetic membranes between triblock copolymer-coated aqueous droplets in good solvents. Soft Matter. 12, 5096-5109 (2016).
