JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengenharia

הרכבה ואפיון מבוקרי טמפרטורה של Bilayer ממשק טיפה

Published: April 19, 2021
doi:
10.3791/62362
,
1Department of Mechanical, Aerospace and Biomedical Engineering,University of Tennessee

Summary

פרוטוקול זה מפרט את השימוש במערכת חימום מבוקרת טמפרטורת משוב כדי לקדם הרכבה מונולאייר השומנים ואת היווצרות bilayer ממשק טיפה עבור שומנים עם טמפרטורות התכה גבוהות, ומדידות קיבוליות לאפיון שינויים מונחי טמפרטורה בקרום.

Abstract

שיטת bilayer ממשק טיפה (DIB) להרכבת bilayers השומנים (כלומר, DIBs) בין טיפות מימיות מצופות שומנים בשמן מציע יתרונות מרכזיים לעומת שיטות אחרות: DIBs הם יציבים ולעתים קרובות לאורך זמן, אזור bilayer ניתן לכוונן באופן הפיך, אסימטריה עלון נשלטת בקלות באמצעות קומפוזיציות טיפה, רשתות כמו רקמות של bilayers ניתן להשיג על ידי הסמוך טיפות רבות. יצירת DIBs דורש הרכבה ספונטנית של שומנים לתוך monolayers השומנים בצפיפות גבוהה על פני השטח של טיפות. בעוד זה קורה בקלות בטמפרטורת החדר עבור שומנים סינתטיים נפוצים, monolayer מספיק או bilayer יציב אינו מצליח להיווצר בתנאים דומים עבור שומנים עם נקודות התכה מעל טמפרטורת החדר, כולל כמה תמציות שומנים הסלולר. התנהגות זו הגבילה ככל הנראה את ההרכבים – ואולי גם את הרלוונטיות הביולוגית – של DIBs במחקרי קרום מודל. כדי לטפל בבעיה זו, פרוטוקול ניסיוני מוצג כדי לחמם בזהירות את מאגר הנפט המארח טיפות DIB ולאפיין את ההשפעות של הטמפרטורה על קרום השומנים. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מראה כיצד להשתמש גוף אלומיניום מוליך תרמית ואלמנטים חימום התנגדותי נשלט על ידי לולאת משוב לרשום טמפרטורות גבוהות, אשר משפר הרכבה monolayer היווצרות bilayer עבור קבוצה רחבה יותר של סוגי שומנים. מאפיינים מבניים של הממברנה, כמו גם את המעברים שלב תרמוטרופי של השומנים המרכיבים את bilayer, הם מכמתים על ידי מדידת השינויים קיבוליות חשמלית של DIB. יחד, הליך זה יכול לסייע בהערכת תופעות ביופיזיות בקרומי מודל על פני טמפרטורות שונות, כולל קביעת טמפרטורת התכה יעילה (TM) עבור תערובות שומנים רב רכיבים. יכולת זו תאפשר כך שכפול קרוב יותר של מעברי פאזה טבעיים בקרומי מודל ותעודד היווצרות ושימוש בקרומי מודל ממגוון רחב יותר של מרכיבי קרום, כולל אלה הלוכדים טוב יותר את ההטרוגניות של עמיתיהם התאיים.

Introduction

ממברנות הסלולר הן מחסומים חדירים באופן סלקטיבי המורכבים מאלפי סוגי שומנים1, חלבונים, פחמימות וטרולים העוטפים ומחלקים את כל התאים החיים. הבנת האופן שבו הרכביהם משפיעים על תפקודיהם וחושפים כיצד מולקולות טבעיות וסינתטיות מתקשרות, דבקות, משבשות ומשתנות קרום תאי, ולכן תחומי מחקר חשובים בעלי השלכות רחבות היקף בביולוגיה, רפואה, כימיה, פיזיקה והנדסת חומרים.

מטרות אלה לגילוי נהנות ישירות מטכניקות מוכחות להרכבה, מניפולציה ולימוד של ממברנות מודל – כולל ביליאריות שומנים המורכבות משומנים סינתטיים או טבעיים – המחקות את ההרכב, המבנה ותכונות ההובלה של מקביליהם התאיים. בשנים האחרונות, ממשק טיפה bilayer (DIB) שיטה2,3,4 לבניית bilayer השומנים מישורי בין טיפות מים מצופות שומנים בשמן קיבל תשומת לב משמעותית 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23, והפגין יתרונות מעשיים על פני גישות אחרות עבור היווצרות קרום מודל: שיטת DIB היא פשוטה לביצוע, לא דורש ייצור או הכנה מתוחכמים (למשל, “ציור”) של מצע לתמיכה בקרום, מניב באופן עקבי ממברנות עם מעולה אריכות ימים, מאפשר מדידות אלקטרופיזיולוגיות סטנדרטיות, ומפשט את היווצרותם של קרום מודל עם קומפוזיציות עלון אסימטרי3. מכיוון שהדו-שכבה נוצרת באופן ספונטני בין טיפות וכל טיפה יכולה להיות מותאמת במיקום ובאיפור, טכניקת DIB משכה גם עניין רב בפיתוח מערכות חומר בהשראת תאים המתבססות על שימוש בקרומים מגיביםלגירויים 18,24,25,26,27,28,29,מידור מאוזן והובלה14,30,31, וחומרים דמויירקמות 17,23,32,33,34,35,36.

רוב הניסויים שפורסמו על קרום המודל, כולל אלה עם DIBs, בוצעו בטמפרטורת החדר (RT, ~ 20-25 מעלות צלזיוס) ועם קומץ שומנים סינתטיים (למשל, DOPC, DPhPC, וכו ‘). תרגול זה מגביל את היקף השאלות הביופיזיות שניתן ללמוד בקרומי מודל, ובהתבסס על התבוננות, הוא יכול גם להגביל את סוגי השומנים שניתן להשתמש בהם להרכבת DIBs. לדוגמה, שומנים סינתטיים כגון DPPC, אשר יש טמפרטורת התכה של 42 °C (69 °F), אינו להרכיב monolayers ארוז היטב או טופס DIBs ב RT37. היווצרות DIB בטמפרטורת החדר הוכיחה גם קשה עבור תמציות טבעיות, כגון אלה מיונקים (למשל, תמצית השומנים הכוללת במוח, BTLE)38 או חיידקים (למשל, תמצית השומנים הכוללת Escherichia coli, ETLE)37, אשר מכילים סוגים רבים ושונים של שומנים ומקורם תאים המתגוררים בטמפרטורות גבוהות (37 °C (37 °F). מתן אפשרות ללמוד קומפוזיציות מגוונות ובכך מספק הזדמנויות להבנת תהליכים בתיווך ממברנה בתנאים רלוונטיים ביולוגית.

העלאת הטמפרטורה של השמן יכולה לשרת שתי מטרות: זה מגביר את הקינטיקה של הרכבה monolayer וזה יכול לגרום שומנים לעבור מעבר נמס להגיע לשלב מופרע נוזלי. שתי ההשלכות מסייעות בהרכבה חד שכבתית39, דרישה מוקדמת עבור DIB. בנוסף לחימום להיווצרות bilayer, קירור הממברנה לאחר היווצרות יכול לשמש כדי לזהות מעברים תרמוטרופיים bilayers השומנים יחיד38, כולל אלה תערובות השומנים הטבעיות (למשל, BTLE) זה יכול להיות קשה לזהות באמצעות קלורימטריה. מלבד הערכת מעברים תרמוטרופיים של שומנים, דווקא שינוי הטמפרטורה של DIB יכול לשמש כדי לחקור שינויים הנגרמים על ידי טמפרטורה במבנה קרום38 ולבחון כיצד הרכב השומנים ונזילות להשפיע על קינטיקה של מינים פעילים קרום (למשל, פפטידים יוצרי נקבוביות וחלבונים transmembrane37), כולל קרום מודל יונקים וחיידקים בטמפרטורה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית (37 מעלות צלזיוס).

להלן, תיאור של כיצד להרכיב מאגר שמן DIB שונה ולהפעיל בקר משוב טמפרטורה כדי לאפשר הרכבה monolayer היווצרות bilayer בטמפרטורות גבוהות יותר RT יוסבר. בהבדיל מפרוטוקול40הקודם , נכלל פרט מפורש לגבי שילוב המכשור הדרוש למדידה ובקרה של הטמפרטורה במקביל להרכבה ואפיון של ה- DIB במאגר הנפט. ההליך יאפשר למשתמש ליישם שיטה זו לגיבוש ולימוד DIBs על פני מגוון טמפרטורות במגוון הקשרים מדעיים. יתר על כן, התוצאות הייצוגיות מספקות דוגמאות ספציפיות לסוגי השינויים הניתנים מדידה הן במבנה הממברנה והן בהובלת היונים שיכולים להתרחש מכיוון שהטמפרטורה מגוונת. טכניקות אלה הן תוספות חשובות למחקרים הביופיזיים הרבים שניתן לתכנן ולבצע ביעילות ב- DIBs, כולל לימוד הקינטיקה של מינים פעילים בקרום בהרכבי קרום שונים.

Protocol

1. הכנת מתקן מחומם לאסוף 2 חתיכות של גומי מבודד בעובי 1 מ”מ קצוץ ל 25 מ”מ x 40 מ”מ רוחב ואורך, בהתאמה, 2 חתיכות של גומי 6 מ”מ עבה כי הם גם 25 מ”מ x 40 מ”מ, מכלול בסיס אלומיניום מוכן, מאגר שמן אקרילי שמתאים בחלון הצפייה של גוף בסיס אלומיניום (ראה איורים S1, S2, ו S3 לפרטים על ייצור תצוגה מתפוצצת של …

Representative Results

איור 1 מראה כיצד גוף האלומיניום ומאגר הנפט האקרילי מוכנים על במת המיקרוסקופ להיווצרות DIB. שלבי ההרכבה 1.2-1.4 משמשים לבידוד תרמי של המתקן מהבמה לחימום יעיל יותר. שלבים 1.5-1.7 מראים כיצד לחבר כראוי את התרמופול למתקן ולמקם את מאגר הנפט, וצעדים 1.8-1.9 מראים מיקומים מומלצים לחלוקת שמן ?…

Discussion

הפרוטוקול המתואר בזאת מספק הוראות להרכבה ותפעול של מערכת ניסיונית לשליטה בטמפרטורת השמן והטיפות המשמשות ליצירת DIBs. זה מועיל במיוחד עבור הפעלת היווצרות DIB באמצעות שומנים כי יש טמפרטורות נמס מעל RT. יתר על כן, על ידי שינוי מדויק של הטמפרטורה של מאגר הנפט, טמפרטורת bilayer ניתן לתפעל כדי ללמוד את ?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

תמיכה כספית ניתנה על ידי הקרן הלאומית למדע גרנט CBET-1752197 ומשרד חיל האוויר של מענק מחקר מדעי FA9550-19-1-0213.

Materials

25 mm x 40 mm x 1 mm insulative rubber (x2) Any Insulates the bottom of the aluminum fixture from the stage of the microscope
25 mm x 40 mm x 6 mm insulative rubber (x2) Any Protects heating elements from being damaged by the microscope stage clips and insulates the top of the heating elements.
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid  Sigma Aldrich M3183 Buffering agent for lipid solution
Acrylic substrate Fabricated in house HTD_STG_2 ~1000 uL acrylic well with a poka-yoke exterior profile to fix orientation
Aluminum fixture Fabricated in house HTD_STG_1 Base fixture with an oil well that holds the acylic fixture and includes two flat pads adjacent to the oil well for the heating elements 
Brain Total Lipid Extract Avanti 131101C-100mg 25 mg/mL porcine lipid extract 
Compact DAQ Chassis (cDAQ) National Instruments  cDAQ-9174  Chassis to house multiple types of sensor measurement or output modules
Data Acquisition System (DAQ) Molecular Devices  Digidata 1440A  High resolution analog to digital converter
Fixed gain amplifier/power supply Hewlitt Packard HP 6826A Amplifies DC voltage output from the voltage output module
Glass Cover Slip Corning CLS284525 Seals bottom of aluminum base and allows for optical characterization of the bilayer
Heating element (x2) Omega KHLV-101/5 25 mm x 25 mm polymide film kapton heating element with a 5 watt power limit. 
M3 Stainless Steel Screw McMaster Carr 90116A150 Secures thermocouple to aluminum fixture
Patch clamp amplifier Molecular Devices  AxoPatch 200B  Measures current and outputs voltage to the headstage
Personal computer Any Computer with mulitiple high speed usb ports and a minimum of 6 Gb of ram
Potassium Chloride Sigma Aldrich P3911 Electrolyte solution of dissociated ions
Temperature input module National Instruments  NI 9211 Enables open and cold junction thermocouple measurements for the cDAQ chassis
Thermocouple Omega JMTSS-020U-6  U-type thermocouple with a diameter of 0.02 inches and 6 inches in length
UV Curable Adhesive Loctite 19739 Secures glass coverslip to aluminum base fixture
Voltage output module National Instruments  NI 9263 Analog voltage output module for use with the cDAQ chassis
Waveform generator Agilent 33210A  Used to output a 10 mV 10 Hz sinusoidal waveform
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. van Meer, G., de Kroon, A. I. P. M. Lipid map of the mammalian cell. Journal of Cell Science. 124 (1), 5-8 (2011).
  2. Bayley, H., et al. Droplet interface bilayers. Molecular BioSystems. 4 (12), 1191-1208 (2008).
  3. Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 130 (18), 5878-5879 (2008).
  4. Holden, M. A., Needham, D., Bayley, H. Functional bionetworks from nanoliter water droplets. Journal of the American Chemical Society. 129 (27), 8650-8655 (2007).
  5. Sarles, S. A., Leo, D. J. Physical encapsulation of droplet interface bilayers for durable, portable biomolecular networks. Lab on a Chip. 10 (6), 710-717 (2010).
  6. Stanley, C. E., et al. A microfluidic approach for high-throughput droplet interface bilayer (DIB) formation. Chemical Communications. 46 (10), 1620-1622 (2010).
  7. Gross, L. C. M., Heron, A. J., Baca, S. C., Wallace, M. I. Determining membrane capacitance by dynamic control of droplet interface bilayer area. Langmuir. 27 (23), 14335-14342 (2011).
  8. Huang, J., Lein, M., Gunderson, C., Holden, M. A. Direct quantitation of peptide-mediated protein transport across a droplet, interface bilayer. Journal of the American Chemical Society. 133 (40), 15818-15821 (2011).
  9. Leptihn, S., Thompson, J. R., Ellory, J. C., Tucker, S. J., Wallace, M. I. In vitro reconstitution of eukaryotic ion channels using droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 133 (24), 9370-9375 (2011).
  10. Castell, O. K., Berridge, J., Wallace, M. I. Quantification of membrane protein inhibition by optical ion flux in a droplet interface bilayer array. Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3134-3138 (2012).
  11. Dixit, S. S., Pincus, A., Guo, B., Faris, G. W. Droplet shape analysis and permeability studies in droplet lipid bilayers. Langmuir. 28 (19), 7442-7451 (2012).
  12. Elani, Y., deMello, A. J., Niu, X., Ces, O. Novel technologies for the formation of 2-D and 3-D droplet interface bilayer networks. Lab on a Chip. 12 (18), 3514-3520 (2012).
  13. Michalak, Z., Fartash, D., Haque, N., Lee, S. Tunable crystallization via osmosis-driven transport across a droplet interface bilayer. CrystEngComm. 14 (23), 7865-7868 (2012).
  14. Punnamaraju, S., You, H., Steckl, A. J. Triggered release of molecules across droplet interface bilayer lipid membranes using photopolymerizable lipids. Langmuir. 28 (20), 7657-7664 (2012).
  15. Boreyko, J. B., Mruetusatorn, P., Sarles, S. A., Retterer, S. T., Collier, C. P. Evaporation-induced buckling and fission of microscale droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 135 (15), 5545-5548 (2013).
  16. Leptihn, S., et al. Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil. Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).
  17. Villar, G., Graham, A. D., Bayley, H. A Tissue-like printed material. Science. 340 (6128), 48-52 (2013).
  18. Barriga, H. M. G., et al. Droplet interface bilayer reconstitution and activity measurement of the mechanosensitive channel of large conductance from Escherichia coli. Journal of The Royal Society Interface. 11 (98), (2014).
  19. Boreyko, J. B., Polizos, G., Datskos, P. G., Sarles, S. A., Collier, C. P. Air-stable droplet interface bilayers on oil-infused surfaces. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (21), 7588-7593 (2014).
  20. Mruetusatorn, P., et al. Dynamic morphologies of microscale droplet interface bilayers. Soft Matter. 10 (15), 2530-2538 (2014).
  21. Najem, J., Dunlap, M., Sukharev, S., Leo, D. J. The gating mechanism of mechanosensitive channels in droplet interface bilayers. MRS Proceedings. , 1755 (2015).
  22. Taylor, G. J., Venkatesan, G. A., Collier, C. P., Sarles, S. A. Direct in situ measurement of specific capacitance, monolayer tension, and bilayer tension in a droplet interface bilayer. Soft Matter. 11 (38), 7592-7605 (2015).
  23. Bayley, H., Cazimoglu, I., Hoskin, C. E. G. Synthetic tissues. Emerging Topics in Life Sciences. 3 (5), 615-622 (2019).
  24. Oliver, A. E., et al. Protecting, patterning, and scaffolding supported lipid membranes using carbohydrate glasses. Lab on a Chip. 8 (6), 892-897 (2008).
  25. Maglia, G., et al. Droplet networks with incorporated protein diodes show collective properties. Nature Nanotechnology. 4 (7), 437-440 (2009).
  26. Najem, J. S., et al. Activation of bacterial channel MscL in mechanically stimulated droplet interface bilayers. Scientific Reports. 5, 13726 (2015).
  27. Freeman, E. C., Najem, J. S., Sukharev, S., Philen, M. K., Leo, D. J. The mechanoelectrical response of droplet interface bilayer membranes. Soft Matter. 12 (12), 3021-3031 (2016).
  28. Tamaddoni, N., Sarles, S. A. Toward cell-inspired materials that feel: measurements and modeling of mechanotransduction in droplet-based, multi-membrane arrays. Bioinspiration & Biomimetics. 11 (3), 036008 (2016).
  29. Restrepo Schild, V., et al. Light-patterned current generation in a droplet bilayer array. Scientific Reports. 7, 46585 (2017).
  30. Milianta, P. J., Muzzio, M., Denver, J., Cawley, G., Lee, S. Water permeability across symmetric and asymmetric droplet interface bilayers: Interaction of cholesterol sulfate with DPhPC. Langmuir. 31 (44), 12187-12196 (2015).
  31. Mruetusatorn, P., et al. Control of membrane permeability in air-stable droplet interface bilayers. Langmuir. 31 (14), 4224-4231 (2015).
  32. Wauer, T., et al. Construction and manipulation of functional three-dimensional droplet networks. ACS Nano. 8 (1), 771-779 (2013).
  33. Bayley, H. Building blocks for cells and tissues: Beyond a game. Emerging Topics in Life Sciences. 3 (5), 433-434 (2019).
  34. Booth, M., Restrepo Schild, V., Downs, F., Bayley, J. Droplet network, from lipid bilayer to synthetic tissues. Encyclopedia of Biophysics. , (2019).
  35. Booth, M. J., Cazimoglu, I., Bayley, H. Controlled deprotection and release of a small molecule from a compartmented synthetic tissue module. Communications Chemistry. 2 (1), 142 (2019).
  36. Gobbo, P., et al. Programmed assembly of synthetic protocells into thermoresponsive prototissues. Nature Materials. 17 (12), 1145-1153 (2018).
  37. Taylor, G. J., Sarles, S. A. Heating-enabled formation of droplet interface bilayers using escherichia coli total lipid extract. Langmuir. 31 (1), 325-337 (2015).
  38. Taylor, G. J., et al. Capacitive detection of low-enthalpy, higher-order phase transitions in synthetic and natural composition lipid membranes. Langmuir. 33 (38), 10016-10026 (2017).
  39. Lee, S., Kim, D. H., Needham, D. Equilibrium and dynamic interfacial tension measurements at microscopic interfaces using a micropipet technique. 2. Dynamics of phospholipid monolayer formation and equilibrium tensions at the water-air interface. Langmuir. 17 (18), 5544-5550 (2001).
  40. Najem, J. S., et al. Assembly and characterization of biomolecular memristors consisting of ion channel-doped lipid membranes. Journal of Visualized Experiments. (145), e58998 (2019).
  41. Wang, Y. G., Shao, H. H. Optimal tuning for PI controller. Automatica. 36 (1), 147-152 (2000).
  42. Needham, D., Haydon, D. A. Tensions and free energies of formation of "solventless" lipid bilayers. Measurement of high contact angles. Biophysical Journal. 41 (3), 251-257 (1983).
  43. Sarles, S. A., Leo, D. J. Physical Encapsulation of Interface Bilayers for durable portable biolayer network. Lab on a Chip. 10 (6), 710-717 (2010).
  44. Muller, R. U., Peskin, C. S. The kinetics of monazomycin-induced voltage-dependent conductance. II. Theory and a demonstration of a form of memory. The Journal of General Physiology. 78 (2), 201-229 (1981).
  45. Nenninger, A., et al. Independent mobility of proteins and lipids in the plasma membrane of Escherichia coli. Molecular Microbiology. 92 (5), 1142-1153 (2014).
  46. Venkatesan, G. A., et al. Adsorption kinetics dictate monolayer self-assembly for both lipid-in and lipid-out approaches to droplet interface bilayer formation. Langmuir. 31 (47), 12883-12893 (2015).
  47. Najem, J. S., et al. Memristive ion channel-doped biomembranes as synaptic mimics. ACS Nano. 12 (5), 4702-4711 (2018).
  48. Tamaddoni, N., Taylor, G., Hepburn, T., Michael Kilbey, S., Sarles, S. A. Reversible, voltage-activated formation of biomimetic membranes between triblock copolymer-coated aqueous droplets in good solvents. Soft Matter. 12, 5096-5109 (2016).

Tags

Keywords: Droplet Interface BilayerDIBTemperature-controlled AssemblyCharacterizationMembraneHeat TransferThermocoupleAluminum FixtureAcrylic ReservoirHexadecane OilInsulative RubberResistive Heating ElementsElectrical/optical CharacterizationTemperature-related EffectsCellular EnvironmentsTransport And Signaling PropertiesMembrane ConstituentsNatural Cellular Extracts
check_url/pt/62362?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Ringley, J. D., Sarles, S. A. Temperature-Controlled Assembly and Characterization of a Droplet Interface Bilayer. J. Vis. Exp. (170), e62362, doi:10.3791/62362 (2021).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image