Montaje con temperatura controlada y caracterización de una bicapa de interfaz de gota

Summary

Este protocolo detalla el uso de un sistema de calentamiento de temperatura controlada de retroalimentación para promover el ensamblaje de monocapas lipídicas y la formación de bicapas de interfaz de gotitas para lípidos con temperaturas de fusión elevadas, y mediciones de capacitancia para caracterizar los cambios impulsados por la temperatura en la membrana.

Abstract

El método de la bicapa de interfaz de gotitas (DIB) para ensamblar bicapas lipídicas (es decir, DIB) entre gotitas acuosas recubiertas de lípidos en aceite ofrece beneficios clave en comparación con otros métodos: los DIB son estables y a menudo duraderos, el área de la bicapa se puede ajustar reversiblemente, la asimetría de las valvas se controla fácilmente a través de composiciones de gotitas, y las redes de bicapas similares a tejidos se pueden obtener al contiguas muchas gotitas. La formación de DIBs requiere el ensamblaje espontáneo de lípidos en monocapas lipídicas de alta densidad en las superficies de las gotitas. Mientras que esto ocurre fácilmente a temperatura ambiente para los lípidos sintéticos comunes, una monocapa suficiente o bicapa estable no puede formarse en condiciones similares para los lípidos con puntos de fusión por encima de la temperatura ambiente, incluyendo algunos extractos celulares del lípido. Este comportamiento probablemente ha limitado las composiciones y quizás la relevancia biológica de los DIB en los estudios de membranas modelo. Para abordar este problema, se presenta un protocolo experimental para calentar cuidadosamente el depósito de aceite que alberga gotas dib y caracterizar los efectos de la temperatura sobre la membrana lipídica. Específicamente, este protocolo muestra cómo utilizar un accesorio de aluminio térmicamente conductor y elementos de calentamiento resistivos controlados por un bucle de retroalimentación para prescribir temperaturas elevadas, lo que mejora el ensamblaje de monocapas y la formación de bicapas para un conjunto más amplio de tipos de lípidos. Las características estructurales de la membrana, así como las transiciones de fase termotrópicas de los lípidos que componen la bicapa, se cuantifican midiendo los cambios en la capacitancia eléctrica del DIB. En conjunto, este procedimiento puede ayudar en la evaluación de fenómenos biofísicos en membranas modelo a lo largo de varias temperaturas, incluida la determinación de una temperatura de fusión efectiva(T_M)para mezclas de lípidos multicomponente. Por lo tanto, esta capacidad permitirá una replicación más cercana de las transiciones de fase naturales en las membranas modelo y fomentará la formación y el uso de membranas modelo de una franja más amplia de componentes de la membrana, incluidos aquellos que capturan mejor la heterogeneidad de sus contrapartes celulares.

Introduction

Las membranas celulares son barreras selectivamente permeables compuestas por miles de lípidos tipo^1,proteínas, carbohidratos y esteroles que encapsulan y subdividen todas las células vivas. Comprender cómo sus composiciones afectan sus funciones y revelar cómo las moléculas naturales y sintéticas interactúan, se adhieren, interrumpen y translocan las membranas celulares son, por lo tanto, áreas importantes de investigación con implicaciones de amplio alcance en biología, medicina, química, física e ingeniería de materiales.

Estos objetivos para el descubrimiento se benefician directamente de las técnicas probadas para ensamblar, manipular y estudiar las membranas modelo, incluidas las bicapas lipídicas ensambladas a partir de lípidos sintéticos o naturales, que imitan la composición, la estructura y las propiedades de transporte de sus contrapartes celulares. En los últimos años, el método^2,3,4 de la bicapa de interfaz de gotitas (DIB) para construir una bicapa lipídica plana entre gotas de agua recubiertas de lípidos en aceite ha recibido una atención significativa^{5,6,7,8,9,10, 11,12,13, 14,15, 16,17, 18,19,20,21,22,23,}y ha demostrado ventajas prácticas sobre otros enfoques para la formación de membranas modelo: el método DIB es fácil de realizar, no requiere fabricación o preparación sofisticada (por ejemplo, “pintura”) de un sustrato para soportar la membrana, produce consistentemente membranas con membranas superiores longevidad, permite mediciones electrofisiología estándar, y simplifica la formación de membranas modelo con composiciones asimétricas de foliolos^3. Debido a que la bicapa se forma espontáneamente entre las gotitas y cada gotita se puede adaptar en posición y composición, la técnica DIB también ha atraído un interés considerable en el desarrollo de sistemas de materiales inspirados en las células que se basan en el uso de membranas sensibles a losestímulos^{18,24,25, 26,27, 28,29,}compartimentación y transporte^{equilibrados 14,30, 31,}y materiales similares a los tejidos^{17,23,32,33,34,35,36.}

La mayoría de los experimentos publicados en membranas modelo, incluidas aquellas con DIBs, se han realizado a temperatura ambiente (RT, ~ 20-25 ° C) y con un puñado de lípidos sintéticos (por ejemplo, DOPC, DPhPC, etc.). Esta práctica limita el alcance de las preguntas biofísicas que se pueden estudiar en membranas modelo y, basándose en la observación, también puede restringir los tipos de lípidos que se pueden utilizar para ensamblar DIBs. Por ejemplo, un lípido sintético como dppc, que tiene una temperatura de fusión de 42 °C, no ensambla monocapas apretadas ni forma DIBs a^{RT 37.} La formación de DIB a temperatura ambiente también ha resultado difícil para los extractos naturales, como los de mamíferos (por ejemplo, extracto lipídico total cerebral, BTLE)³⁸ o bacterias (por ejemplo, extracto lipídico total de Escherichia coli, ETLE)^37,que contienen muchos tipos diferentes de lípidos y se originan en células que residen a temperaturas elevadas (37 °C). Por lo tanto, permitir el estudio de diversas composiciones brinda oportunidades para comprender los procesos mediados por membranas en condiciones biológicamente relevantes.

Elevar la temperatura del aceite puede servir para dos propósitos: aumenta la cinética del ensamblaje de monocapas y puede hacer que los lípidos se sometan a una transición de fusión para alcanzar una fase desordenada líquida. Ambas consecuencias ayudan en el montaje monocapa³⁹, un requisito previo para un DIB. Además del calentamiento para la formación de bicapas, el enfriamiento de la membrana después de la formación se puede utilizar para identificar transiciones dermatotrópicas en bicapas lipídicas individuales^38,incluidas las de mezclas lipídicas naturales (por ejemplo, BTLE) que pueden ser difíciles de detectar mediante calorimetría. Además de evaluar las transiciones termotrópicas de los lípidos, la variación precisa de la temperatura del DIB se puede utilizar para estudiar los cambios inducidos por la temperatura en la estructura de la membrana³⁸ y examinar cómo la composición lipídica y la fluidez afectan a la cinética de las especies activas en la membrana (por ejemplo, péptidos formadores de poros y proteínas transmembrana^37),incluidas las membranas modelo de mamíferos y bacterias a una temperatura fisiológicamente relevante (37 °C).

Aquí, se explicará una descripción de cómo ensamblar un depósito de aceite DIB modificado y operar un controlador de temperatura de retroalimentación para permitir el ensamblaje de monocapas y la formación de bicapas a temperaturas superiores a RT. A diferencia de un protocolo anterior^40,se incluye detalle explícito respecto a la integración de la instrumentación necesaria para medir y controlar la temperatura en paralelo al montaje y caracterización del DIB en el depósito de aceite. Por lo tanto, el procedimiento permitirá a un usuario aplicar este método para formar y estudiar DIBs en un rango de temperaturas en una variedad de contextos científicos. Además, los resultados representativos proporcionan ejemplos específicos para los tipos de cambios medibles tanto en la estructura de la membrana como en el transporte de iones que pueden ocurrir a medida que se varía la temperatura. Estas técnicas son adiciones importantes a los muchos estudios biofísicos que se pueden diseñar y realizar con eficacia en DIBs, incluyendo el estudio de la cinética de especies membrana-activas en diversas composiciones de la membrana.

Protocol

1. Preparación del accesorio calentado Reúna 2 piezas de caucho aislante de 1 mm de espesor recortadas a 25 mm x 40 mm de ancho y largo, respectivamente, 2 piezas de una goma de 6 mm de espesor que también son de 25 mm x 40 mm, un conjunto de accesorio de base de aluminio preparado y un depósito de aceite acrílico que cabe en la ventana de visualización del accesorio de base de aluminio (consulte las figuras S1, S2 y S3 para obtener detalles sobre la fabricación y una vista explotada del…

Representative Results

La Figura 1 muestra cómo el accesorio de aluminio y el depósito de aceite acrílico se preparan en la etapa de microscopio para la formación de DIB. Los pasos de montaje 1.2-1.4 sirven para aislar térmicamente el accesorio del escenario para una calefacción más eficiente. Los pasos 1.5-1.7 muestran cómo conectar correctamente el termopar al accesorio y colocar el depósito de aceite, y los pasos 1.8-1.9 muestran las ubicaciones recomendadas para dispensar aceite en estos pedazos. …

Discussion

El protocolo descrito aquí proporciona instrucciones para ensamblar y operar un sistema experimental para controlar la temperatura del aceite y las gotas utilizadas para formar DIBs. Es especialmente beneficioso para permitir la formación de DIB utilizando lípidos que tienen temperaturas de fusión por encima de RT. Por otra parte, variando con precisión la temperatura del depósito de aceite, la temperatura de la bicapa puede ser manipulada para estudiar los efectos de las temperaturas elevadas sobre diversas propie…

Materials

25 mm x 40 mm x 1 mm insulative rubber (x2)	Any		Insulates the bottom of the aluminum fixture from the stage of the microscope
25 mm x 40 mm x 6 mm insulative rubber (x2)	Any		Protects heating elements from being damaged by the microscope stage clips and insulates the top of the heating elements.
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid	Sigma Aldrich	M3183	Buffering agent for lipid solution
Acrylic substrate	Fabricated in house	HTD_STG_2	~1000 uL acrylic well with a poka-yoke exterior profile to fix orientation
Aluminum fixture	Fabricated in house	HTD_STG_1	Base fixture with an oil well that holds the acylic fixture and includes two flat pads adjacent to the oil well for the heating elements
Brain Total Lipid Extract	Avanti	131101C-100mg	25 mg/mL porcine lipid extract
Compact DAQ Chassis (cDAQ)	National Instruments	cDAQ-9174	Chassis to house multiple types of sensor measurement or output modules
Data Acquisition System (DAQ)	Molecular Devices	Digidata 1440A	High resolution analog to digital converter
Fixed gain amplifier/power supply	Hewlitt Packard	HP 6826A	Amplifies DC voltage output from the voltage output module
Glass Cover Slip	Corning	CLS284525	Seals bottom of aluminum base and allows for optical characterization of the bilayer
Heating element (x2)	Omega	KHLV-101/5	25 mm x 25 mm polymide film kapton heating element with a 5 watt power limit.
M3 Stainless Steel Screw	McMaster Carr	90116A150	Secures thermocouple to aluminum fixture
Patch clamp amplifier	Molecular Devices	AxoPatch 200B	Measures current and outputs voltage to the headstage
Personal computer	Any		Computer with mulitiple high speed usb ports and a minimum of 6 Gb of ram
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P3911	Electrolyte solution of dissociated ions
Temperature input module	National Instruments	NI 9211	Enables open and cold junction thermocouple measurements for the cDAQ chassis
Thermocouple	Omega	JMTSS-020U-6	U-type thermocouple with a diameter of 0.02 inches and 6 inches in length
UV Curable Adhesive	Loctite	19739	Secures glass coverslip to aluminum base fixture
Voltage output module	National Instruments	NI 9263	Analog voltage output module for use with the cDAQ chassis
Waveform generator	Agilent	33210A	Used to output a 10 mV 10 Hz sinusoidal waveform