JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengenharia

Damlacık Arayüzü Bilayer'in Sıcaklık Kontrollü Montajı ve Karakterizasyonu

Published: April 19, 2021
doi:
10.3791/62362
,
1Department of Mechanical, Aerospace and Biomedical Engineering,University of Tennessee

Summary

Bu protokol, yüksek erime sıcaklıklarına sahip lipitler için lipid monolayer montajını ve damlacık arayüzü bilayer oluşumunu teşvik etmek için geri bildirim sıcaklığı kontrollü bir ısıtma sisteminin kullanımını ve membrandaki sıcaklık odaklı değişiklikleri karakterize etmek için kapasitans ölçümlerini detaylandırıyor.

Abstract

Lipid bilayerlerin montajı için damlacık arayüzü bilayer (DIB) yöntemi (örn. DİB’ler) yağdaki lipid kaplı sulu damlacıklar arasında diğer yöntemlere göre önemli faydalar sunar: DİB’ler kararlı ve genellikle uzun ömürlüdür, bilayer alanı ters yönde ayarlanabilir, broşür asimetrisi damlacık bileşimleri ile kolayca kontrol edilebilir ve doku benzeri çift katman ağları birçok damlacığın bitişik olmasıyla elde edilebilir. DiB’lerin oluşturulması, lipitlerin damlacıkların yüzeylerinde yüksek yoğunluklu lipid monolayerlere kendiliğinden bir şekilde bireyi gerektirmektedir. Bu, yaygın sentetik lipitler için oda sıcaklığında kolayca meydana gelse de, bazı hücresel lipit özleri de dahil olmak üzere oda sıcaklığının üzerinde erime noktalarına sahip lipitler için benzer koşullarda yeterli bir monolayer veya stabil iki katmanlı oluşmaz. Bu davranış, model membran çalışmalarındaKI DDB’lerin bileşimlerini ve belki de biyolojik alaka düzeyini sınırlamıştır. Bu sorunu gidermek için, DIB damlacıklarını barındıran yağ rezervuarını dikkatlice ısıtmak ve sıcaklığın lipid zarı üzerindeki etkilerini karakterize etmek için deneysel bir protokol sunulmaktadır. Özellikle, bu protokol, daha geniş bir lipit tipi kümesi için monolayer montajını ve bilayer oluşumunu iyileştiren yüksek sıcaklıkları reçete etmek için bir geri bildirim döngüsü tarafından kontrol edilen termal iletken alüminyum fikstürün ve dirençli ısıtma elemanlarının nasıl kullanılacağını göstermektedir. Zarın yapısal özellikleri ve bilayerden oluşan lipitlerin termotropik faz geçişleri, DIB’nin elektrik kapasitansındaki değişiklikler ölçülerek ölçülür. Birlikte, bu prosedür, çok bileşenli lipit karışımları için etkili bir erime sıcaklığı(TM)belirlemek de dahil olmak üzere çeşitli sıcaklıklarda model membranlarındaki biyofiziksel olayların değerlendirilmesinde yardımcı olabilir. Bu özellik, model membranlarında doğal faz geçişlerinin daha yakın bir şekilde çoğaltilmesine izin verecek ve hücresel meslektaşlarının heterojenliğini daha iyi yakalayanlar da dahil olmak üzere daha geniş bir membran bileşenlerinden model membranların oluşumunu ve kullanımını teşvik edecektir.

Introduction

Hücresel zarlar, tüm canlı hücreleri kapsülleyen ve alt bölümlere ayıran binlerce lipit tip1,protein, karbonhidrat ve sterolden oluşan seçici geçirgen bariyerlerdir. Kompozisyonlarının işlevlerini nasıl etkilediğini anlamak ve doğal ve sentetik moleküllerin hücresel zarlarla nasıl etkileşime girdiğini, bunlara nasıl yapıştığını, bozulduğunu ve yer değiştirmesini, bu nedenle biyoloji, tıp, kimya, fizik ve malzeme mühendisliğinde geniş kapsamlı etkileri olan önemli araştırma alanlarıdır.

Bunlar, hücresel karşılıklarının bileşimini, yapısını ve taşıma özelliklerini taklit eden sentetik veya doğal olarak oluşan lipitlerden birleştirilmiş lipid bilayerleri de dahil olmak üzere model membranlarının montajı, manipüle edilmesi ve incelenmesi için kanıtlanmış tekniklerden doğrudan yararlanmayı amaçlamaktadır. Son yıllarda, yağdaki lipid kaplı su damlacıkları arasında düzlemsal lipid bilayer inşa etmek için damlacık arayüzü bilayer (DIB) yöntemi2,3,4 önemli ilgi gördü5,6,7,8 ,9,10,11 ,1112,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23, ve model membran oluşumu için diğer yaklaşımlara göre pratik avantajlar göstermiştir: DIB yönteminin gerçekleştirilmesi kolaydır, sofistike bir imalat veya hazırlık gerektirmez (örn. “boyama”) membranını desteklemek için bir substratın, sürekli olarak üstün membranlar verir uzun ömürlülük, standart elektrofizyoloji ölçümlerine izin verir ve asimetrik broşür bileşimleri ile model membranlarının oluşumunu kolaylaştırır3. Bilayer damlacıklar arasında kendiliğinden oluştuğundan ve her damlacık pozisyon ve makyajda uyarlanabildiğinden, DIB tekniği, uyaranlara duyarlı membranlar 18 , 24 , 25 ,26,27,28’inkullanımı üzerine inşa edilen hücreden ilham alan malzeme sistemleri geliştirmeye de büyük ilgi çekmiştir. ,29, dengeli bölmeleme ve taşıma14,30,31ve doku benzeri malzemeler17,23,32,33,34,35,36.

DDB’li olanlar da dahil olmak üzere model membranlar üzerinde yayınlanan deneylerin çoğu oda sıcaklığında (RT, ~20-25 °C) ve bir avuç sentetik lipitle (örneğin, DOPC, DPhPC, vb.) gerçeklenmiştir. Bu uygulama, model zarlarında çalışılabilen biyofiziksel soruların kapsamını sınırlar ve gözleme dayanarak, DIB’leri birleştirmek için kullanılabilecek lipit türlerini de kısıtlayabilir. Örneğin, 42 °C erime sıcaklığına sahip DPPC gibi sentetik bir lipit, sıkıca paketlenmiş monolayerleri bir araya getirmez veya RT37’deDIB oluşturmaz. Oda sıcaklığında DIB oluşumu, memelilerden (örneğin, beyin toplam lipid özü, BTLE)38 veya bakteriler (örneğin, Escherichia coli total lipid özü, ETLE)37, birçok farklı lipit türü içeren ve yüksek sıcaklıklarda (37 °C) bulunan hücrelerden kaynaklanan doğal özler için de zor olmuştur. Böylece çeşitli bileşimlerin incelenmesini sağlamak, membran aracılı süreçleri biyolojik olarak ilgili koşullarda anlama fırsatları sağlar.

Yağın sıcaklığını yükseltmek iki amaca hizmet edebilir: monolayer montajın kinetiğini arttırır ve lipitlerin sıvı düzensiz bir faza ulaşmak için erime geçişine neden olabilir. Her iki sonuç da dib için bir ön koşul olan monolayer derleme39’ayardımcı olur. Bilayer oluşumu için ısıtmaya ek olarak, oluşumdan sonra zarın soğutulmasının soğutulmasının tek lipid bilayerlerinde termotropik geçişleri tanımlamak için kullanılabilir38Kalorimetre kullanarak tespit edilmesi zor olabilecek doğal lipit karışımlarındakiler (örneğin BTLE) dahil. Lipitlerin termotropik geçişlerini değerlendirmenin yanı sıra, DIB’nin sıcaklığını kesin olarak değiştirmek, membran yapısı38’deki sıcaklık kaynaklı değişiklikleri incelemek ve lipid bileşiminin ve akışkanlığının, fizyolojik olarak ilgili bir sıcaklıkta (37 °C) memeli ve bakteriyel model zarları da dahil olmak üzere membran aktif türlerin (örneğin, gözenek oluşturan peptitler ve transmembran proteinleri37)kinetiğini nasıl etkilediğini incelemek için kullanılabilir.

Burada, rt’den daha yüksek sıcaklıklarda monolayer montajı ve çift katmanlı oluşumu etkinleştirmek için modifiye edilmiş bir DIB yağ rezervuarının nasıl monte edileceğinin ve geri bildirim sıcaklığı denetleyicisinin nasıl çalıştırılacağının açıklaması açıklanacaktır. Önceki bir protokolden ayırtedilen 40, dib’nin yağ rezervuarındaki montajına ve karakterizasyonuna paralel olarak sıcaklığı ölçmek ve kontrol etmek için gereken enstrümantasyonun entegrasyonu ile ilgili açık ayrıntı dahildir. Bu nedenle prosedür, bir kullanıcının çeşitli bilimsel bağlamlarda çeşitli sıcaklıklarda DIB’leri oluşturmak ve incelemek için bu yöntemi uygulamasına olanak sağlayacaktır. Ayrıca, temsili sonuçlar, sıcaklık çeşitli olduğunda ortaya çıkabilecek hem membran yapısında hem de iyon taşınımında ölçülebilir değişiklik türleri için özel örnekler sağlar. Bu teknikler, farklı membran bileşimlerinde membran aktif türlerin kinetiğini incelemek de dahil olmak üzere DBS’lerde etkili bir şekilde tasarlanabilecek ve gerçekleştirilebilecek birçok biyofiziksel çalışmaya önemli eklemelerdir.

Protocol

1. Isıtmalı fikstür hazırlığı Genişlik ve uzunluk olarak 25 mm x 40 mm’ye kesilmiş 1 mm kalınlığında 2 adet yalıtımlı kauçuk toplayın, sırasıyla, 25 mm x 40 mm olan 6 mm kalınlığında bir kauçuğun 2 parçası, hazırlanmış bir alüminyum taban fikstür tertibatı ve alüminyum taban fikstürünün görüntüleme penceresine sığan akrilik bir yağ haznesi (imalat ve patlayan montaj görünümü hakkında ayrıntılar için S1, S2 ve S3 şekillerine bakın). Alüminyu…

Representative Results

Şekil 1, dib oluşumu için mikroskop aşamasında alüminyum fikstürün ve akrilik yağ rezervuarın nasıl hazırlandığını göstermektedir. Montaj adımları 1.2-1.4, fikstürü daha verimli ısıtma için sahneden termal olarak yalıtmaya yarar. 1.5-1.7 arası adımlar termokuplün fikstüre nasıl düzgün bir şekilde takılacağını ve yağ haznesinin nasıl konumlandırılacağını gösterir ve 1.8 -1.9 adımları bu parçalara yağ dağıtmak için önerilen yerleri gösterir…

Discussion

Burada açıklanan protokol, DIB oluşturmak için kullanılan yağ ve damlacıkların sıcaklığını kontrol etmek için deneysel bir sistemin montajı ve işletilme talimatları sağlar. Özellikle RT’nin üzerinde erime sıcaklıklarına sahip lipitler kullanılarak DIB oluşumunu sağlamak için faydalıdır. Ayrıca, yağ rezervuarının sıcaklığını tam olarak değiştirerek, bilayer sıcaklığı, yüksek sıcaklıkların kapasitans, alan, kalınlık, indüklenmiş termotropik faz değişiklikleri, membran a…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ulusal Bilim Vakfı Hibe CBET-1752197 ve Hava Kuvvetleri Bilimsel Araştırma Ofisi Hibe FA9550-19-1-0213 tarafından finansal destek sağlanmıştır.

Materials

25 mm x 40 mm x 1 mm insulative rubber (x2) Any Insulates the bottom of the aluminum fixture from the stage of the microscope
25 mm x 40 mm x 6 mm insulative rubber (x2) Any Protects heating elements from being damaged by the microscope stage clips and insulates the top of the heating elements.
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid  Sigma Aldrich M3183 Buffering agent for lipid solution
Acrylic substrate Fabricated in house HTD_STG_2 ~1000 uL acrylic well with a poka-yoke exterior profile to fix orientation
Aluminum fixture Fabricated in house HTD_STG_1 Base fixture with an oil well that holds the acylic fixture and includes two flat pads adjacent to the oil well for the heating elements 
Brain Total Lipid Extract Avanti 131101C-100mg 25 mg/mL porcine lipid extract 
Compact DAQ Chassis (cDAQ) National Instruments  cDAQ-9174  Chassis to house multiple types of sensor measurement or output modules
Data Acquisition System (DAQ) Molecular Devices  Digidata 1440A  High resolution analog to digital converter
Fixed gain amplifier/power supply Hewlitt Packard HP 6826A Amplifies DC voltage output from the voltage output module
Glass Cover Slip Corning CLS284525 Seals bottom of aluminum base and allows for optical characterization of the bilayer
Heating element (x2) Omega KHLV-101/5 25 mm x 25 mm polymide film kapton heating element with a 5 watt power limit. 
M3 Stainless Steel Screw McMaster Carr 90116A150 Secures thermocouple to aluminum fixture
Patch clamp amplifier Molecular Devices  AxoPatch 200B  Measures current and outputs voltage to the headstage
Personal computer Any Computer with mulitiple high speed usb ports and a minimum of 6 Gb of ram
Potassium Chloride Sigma Aldrich P3911 Electrolyte solution of dissociated ions
Temperature input module National Instruments  NI 9211 Enables open and cold junction thermocouple measurements for the cDAQ chassis
Thermocouple Omega JMTSS-020U-6  U-type thermocouple with a diameter of 0.02 inches and 6 inches in length
UV Curable Adhesive Loctite 19739 Secures glass coverslip to aluminum base fixture
Voltage output module National Instruments  NI 9263 Analog voltage output module for use with the cDAQ chassis
Waveform generator Agilent 33210A  Used to output a 10 mV 10 Hz sinusoidal waveform
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. van Meer, G., de Kroon, A. I. P. M. Lipid map of the mammalian cell. Journal of Cell Science. 124 (1), 5-8 (2011).
  2. Bayley, H., et al. Droplet interface bilayers. Molecular BioSystems. 4 (12), 1191-1208 (2008).
  3. Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 130 (18), 5878-5879 (2008).
  4. Holden, M. A., Needham, D., Bayley, H. Functional bionetworks from nanoliter water droplets. Journal of the American Chemical Society. 129 (27), 8650-8655 (2007).
  5. Sarles, S. A., Leo, D. J. Physical encapsulation of droplet interface bilayers for durable, portable biomolecular networks. Lab on a Chip. 10 (6), 710-717 (2010).
  6. Stanley, C. E., et al. A microfluidic approach for high-throughput droplet interface bilayer (DIB) formation. Chemical Communications. 46 (10), 1620-1622 (2010).
  7. Gross, L. C. M., Heron, A. J., Baca, S. C., Wallace, M. I. Determining membrane capacitance by dynamic control of droplet interface bilayer area. Langmuir. 27 (23), 14335-14342 (2011).
  8. Huang, J., Lein, M., Gunderson, C., Holden, M. A. Direct quantitation of peptide-mediated protein transport across a droplet, interface bilayer. Journal of the American Chemical Society. 133 (40), 15818-15821 (2011).
  9. Leptihn, S., Thompson, J. R., Ellory, J. C., Tucker, S. J., Wallace, M. I. In vitro reconstitution of eukaryotic ion channels using droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 133 (24), 9370-9375 (2011).
  10. Castell, O. K., Berridge, J., Wallace, M. I. Quantification of membrane protein inhibition by optical ion flux in a droplet interface bilayer array. Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3134-3138 (2012).
  11. Dixit, S. S., Pincus, A., Guo, B., Faris, G. W. Droplet shape analysis and permeability studies in droplet lipid bilayers. Langmuir. 28 (19), 7442-7451 (2012).
  12. Elani, Y., deMello, A. J., Niu, X., Ces, O. Novel technologies for the formation of 2-D and 3-D droplet interface bilayer networks. Lab on a Chip. 12 (18), 3514-3520 (2012).
  13. Michalak, Z., Fartash, D., Haque, N., Lee, S. Tunable crystallization via osmosis-driven transport across a droplet interface bilayer. CrystEngComm. 14 (23), 7865-7868 (2012).
  14. Punnamaraju, S., You, H., Steckl, A. J. Triggered release of molecules across droplet interface bilayer lipid membranes using photopolymerizable lipids. Langmuir. 28 (20), 7657-7664 (2012).
  15. Boreyko, J. B., Mruetusatorn, P., Sarles, S. A., Retterer, S. T., Collier, C. P. Evaporation-induced buckling and fission of microscale droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 135 (15), 5545-5548 (2013).
  16. Leptihn, S., et al. Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil. Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).
  17. Villar, G., Graham, A. D., Bayley, H. A Tissue-like printed material. Science. 340 (6128), 48-52 (2013).
  18. Barriga, H. M. G., et al. Droplet interface bilayer reconstitution and activity measurement of the mechanosensitive channel of large conductance from Escherichia coli. Journal of The Royal Society Interface. 11 (98), (2014).
  19. Boreyko, J. B., Polizos, G., Datskos, P. G., Sarles, S. A., Collier, C. P. Air-stable droplet interface bilayers on oil-infused surfaces. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (21), 7588-7593 (2014).
  20. Mruetusatorn, P., et al. Dynamic morphologies of microscale droplet interface bilayers. Soft Matter. 10 (15), 2530-2538 (2014).
  21. Najem, J., Dunlap, M., Sukharev, S., Leo, D. J. The gating mechanism of mechanosensitive channels in droplet interface bilayers. MRS Proceedings. , 1755 (2015).
  22. Taylor, G. J., Venkatesan, G. A., Collier, C. P., Sarles, S. A. Direct in situ measurement of specific capacitance, monolayer tension, and bilayer tension in a droplet interface bilayer. Soft Matter. 11 (38), 7592-7605 (2015).
  23. Bayley, H., Cazimoglu, I., Hoskin, C. E. G. Synthetic tissues. Emerging Topics in Life Sciences. 3 (5), 615-622 (2019).
  24. Oliver, A. E., et al. Protecting, patterning, and scaffolding supported lipid membranes using carbohydrate glasses. Lab on a Chip. 8 (6), 892-897 (2008).
  25. Maglia, G., et al. Droplet networks with incorporated protein diodes show collective properties. Nature Nanotechnology. 4 (7), 437-440 (2009).
  26. Najem, J. S., et al. Activation of bacterial channel MscL in mechanically stimulated droplet interface bilayers. Scientific Reports. 5, 13726 (2015).
  27. Freeman, E. C., Najem, J. S., Sukharev, S., Philen, M. K., Leo, D. J. The mechanoelectrical response of droplet interface bilayer membranes. Soft Matter. 12 (12), 3021-3031 (2016).
  28. Tamaddoni, N., Sarles, S. A. Toward cell-inspired materials that feel: measurements and modeling of mechanotransduction in droplet-based, multi-membrane arrays. Bioinspiration & Biomimetics. 11 (3), 036008 (2016).
  29. Restrepo Schild, V., et al. Light-patterned current generation in a droplet bilayer array. Scientific Reports. 7, 46585 (2017).
  30. Milianta, P. J., Muzzio, M., Denver, J., Cawley, G., Lee, S. Water permeability across symmetric and asymmetric droplet interface bilayers: Interaction of cholesterol sulfate with DPhPC. Langmuir. 31 (44), 12187-12196 (2015).
  31. Mruetusatorn, P., et al. Control of membrane permeability in air-stable droplet interface bilayers. Langmuir. 31 (14), 4224-4231 (2015).
  32. Wauer, T., et al. Construction and manipulation of functional three-dimensional droplet networks. ACS Nano. 8 (1), 771-779 (2013).
  33. Bayley, H. Building blocks for cells and tissues: Beyond a game. Emerging Topics in Life Sciences. 3 (5), 433-434 (2019).
  34. Booth, M., Restrepo Schild, V., Downs, F., Bayley, J. Droplet network, from lipid bilayer to synthetic tissues. Encyclopedia of Biophysics. , (2019).
  35. Booth, M. J., Cazimoglu, I., Bayley, H. Controlled deprotection and release of a small molecule from a compartmented synthetic tissue module. Communications Chemistry. 2 (1), 142 (2019).
  36. Gobbo, P., et al. Programmed assembly of synthetic protocells into thermoresponsive prototissues. Nature Materials. 17 (12), 1145-1153 (2018).
  37. Taylor, G. J., Sarles, S. A. Heating-enabled formation of droplet interface bilayers using escherichia coli total lipid extract. Langmuir. 31 (1), 325-337 (2015).
  38. Taylor, G. J., et al. Capacitive detection of low-enthalpy, higher-order phase transitions in synthetic and natural composition lipid membranes. Langmuir. 33 (38), 10016-10026 (2017).
  39. Lee, S., Kim, D. H., Needham, D. Equilibrium and dynamic interfacial tension measurements at microscopic interfaces using a micropipet technique. 2. Dynamics of phospholipid monolayer formation and equilibrium tensions at the water-air interface. Langmuir. 17 (18), 5544-5550 (2001).
  40. Najem, J. S., et al. Assembly and characterization of biomolecular memristors consisting of ion channel-doped lipid membranes. Journal of Visualized Experiments. (145), e58998 (2019).
  41. Wang, Y. G., Shao, H. H. Optimal tuning for PI controller. Automatica. 36 (1), 147-152 (2000).
  42. Needham, D., Haydon, D. A. Tensions and free energies of formation of "solventless" lipid bilayers. Measurement of high contact angles. Biophysical Journal. 41 (3), 251-257 (1983).
  43. Sarles, S. A., Leo, D. J. Physical Encapsulation of Interface Bilayers for durable portable biolayer network. Lab on a Chip. 10 (6), 710-717 (2010).
  44. Muller, R. U., Peskin, C. S. The kinetics of monazomycin-induced voltage-dependent conductance. II. Theory and a demonstration of a form of memory. The Journal of General Physiology. 78 (2), 201-229 (1981).
  45. Nenninger, A., et al. Independent mobility of proteins and lipids in the plasma membrane of Escherichia coli. Molecular Microbiology. 92 (5), 1142-1153 (2014).
  46. Venkatesan, G. A., et al. Adsorption kinetics dictate monolayer self-assembly for both lipid-in and lipid-out approaches to droplet interface bilayer formation. Langmuir. 31 (47), 12883-12893 (2015).
  47. Najem, J. S., et al. Memristive ion channel-doped biomembranes as synaptic mimics. ACS Nano. 12 (5), 4702-4711 (2018).
  48. Tamaddoni, N., Taylor, G., Hepburn, T., Michael Kilbey, S., Sarles, S. A. Reversible, voltage-activated formation of biomimetic membranes between triblock copolymer-coated aqueous droplets in good solvents. Soft Matter. 12, 5096-5109 (2016).

Tags

Droplet Interface BilayerDIBTemperature-controlled AssemblyCharacterizationMembraneHeat TransferThermocoupleAluminum FixtureAcrylic ReservoirHexadecane OilInsulative RubberResistive Heating ElementsElectrical/optical CharacterizationTemperature-related EffectsCellular EnvironmentsTransport And Signaling PropertiesMembrane ConstituentsNatural Cellular Extracts

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Ringley, J. D., Sarles, S. A. Temperature-Controlled Assembly and Characterization of a Droplet Interface Bilayer. J. Vis. Exp. (170), e62362, doi:10.3791/62362 (2021).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image