JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengenharia

Температура контролируемой сборки и характеристики droplet интерфейс Bilayer

Published: April 19, 2021
doi:
10.3791/62362
,
1Department of Mechanical, Aerospace and Biomedical Engineering,University of Tennessee

Summary

В этом протоколе подробно используется система отопления, контролируемая температурой обратной связи, для содействия сборке липидных монослой и формированию бислойного интерфейса капель для липидов с повышенными температурами плавления, а также измерения емкости для характеристики изменений, обусловленных температурой в мембране.

Abstract

Метод капельного интерфейса bilayer (DIB) для сборки липидных двуслойных (т.е. DIBs) между липидными аквестными каплями в масле предлагает ключевые преимущества по сравнению с другими методами: DIBs стабильны и часто долговечны, область билейера может быть обратимо настроена, листовка асимметрия легко контролируется с помощью капельных композиций, и ткани, как сети Формирование DIB требует спонтанной сборки липидов в липидные монослой высокой плотности на поверхностях капель. Хотя это происходит легко при комнатной температуре для общих синтетических липидов, достаточный монослой или стабильный билейер не может сформировать в аналогичных условиях для липидов с точками плавления выше комнатной температуры, в том числе некоторые клеточные липидные экстракты. Такое поведение, вероятно, ограничило составы и, возможно, биологическую значимость DIB в модельных мембранных исследованиях. Для решения этой проблемы представлен экспериментальный протокол для тщательного нагрева нефтяного резервуара, в которого обухотятся капли DIB, и характеризует влияние температуры на липидную мембрану. В частности, этот протокол показывает, как использовать теплопроводящий алюминиевый светильник и резисторные нагревательные элементы, контролируемые циклом обратной связи, чтобы назначать повышенные температуры, что улучшает сборку монослой и образование двухслойных для более широкого набора липидных типов. Структурные характеристики мембраны, а также термотропические фазы переходов липидов, включающих билейер, количественно измеряются путем измерения изменений электрической емкости DIB. Вместе эта процедура может помочь в оценке биофизических явлений в модельных мембранах по различным температурам, включая определение эффективной температуры плавления(ТМ)для многокомпонентных липидных смесей. Таким образом, эта возможность позволит более тесно реплицировать естественные фазовые переходы в модельных мембранах и будет способствовать образованию и использованию модельных мембран из более широкой полосы мембранных компонентов, включая те, которые лучше фиксируют неоднородность их клеточных аналогов.

Introduction

Клеточные мембраны избирательно проницаемые барьеры, состоящие изтысяч липидных типов 1,белков, углеводов и стерий, которые инкапсулируют и субдивидуируют все живые клетки. Понимание того, как их составы влияют на их функции и выявление того, как природные и синтетические молекулы взаимодействуют с, придерживаются, нарушают и транслокируют клеточные мембраны, являются, следовательно, важными областями исследований с широкими последствиями в биологии, медицине, химии, физике и инженерии материалов.

Эти цели для открытия непосредственно выгоду от проверенных методов для сборки, манипулирования и изучения модели мембран, в том числе липидных билейеров, собранных из синтетических или естественных липидов, которые имитируют состав, структуру и транспортные свойства своих клеточных аналогов. В последние годы, капельный интерфейс bilayer (DIB)метод 2,3,4 для построения планар липидного билейера между липидным покрытием капли воды в масле получилзначительное внимание 5,6,7,8,9,10,11 ,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23, ипродемонстрировалпрактические преимущества по сравнению с другими подходами для формирования мембраны модели: метод DIB прост в работе, не требует сложной изготовления или подготовки (например, “Картина”) субстрата для поддержки мембраны, последовательно дает мембраны с долговечность, позволяет проводить стандартные электрофизиологические измерения и упрощает формирование модельных мембран с асимметричными листовочными композициями3. Потому что билайер формируется спонтанно между каплями и каждой капли могут быть адаптированы в положении и макияж, Техника DIB также привлекла значительный интерес к разработке клеточных материальныхсистем,которые опираются на использование стимулов-реакционных мембран18,24,25,26,27,28,29, сбалансированнойразобщенностии транспортировки 14,30,31,итканевых материалов 17,23,32,33,34,35,36.

Большинство опубликованных экспериментов на модельных мембранах, в том числе с ДИБами, проводились при комнатной температуре (RT, 20-25 градусов по Цельсию) и с горсткой синтетических липидов (например, DOPC, DPhPC и т.д.). Эта практика ограничивает сферу биофизических вопросов, которые могут быть изучены в модельных мембранах, и, на основе наблюдения, она также может ограничить типы липидов, которые могут быть использованы для сборки DIBs. Например, синтетический липид, такой как DPPC, который имеет температуру плавления 42 градусов по Цельсию, не собирает плотно упакованные монослои или не формирует DIBs на RT37. Формирование DIB при комнатной температуре также оказалось трудным для натуральных экстрактов, таких как млекопитающие (например, общий липидный экстракт мозга, BTLE)38 или бактерии (например, общий липидный экстракт Escherichia coli, ETLE)37, которые содержат множество различных типов липидов и происходят из клеток, которые находятся при повышенных температурах (37 градусов по Цельсию). Таким образом, включение изучения различных композиций дает возможность понять мембранные процессы в биологически соответствующих условиях.

Повышение температуры масла может служить двум целям: это увеличивает кинетики сборки монослой и это может привести к липидов пройти плавления перехода для достижения жидкой неупорядоченой фазы. Оба последствия помощи в монослойнойсборки 39, предварительно необходимые для DIB. В дополнение к нагреванию для формирования билейера, охлаждение мембраны после образования может быть использовано для выявления термотропных переходов в одиночных липидныхбилейзеров 38, в том числе в естественных липидных смесей (например, BTLE), которые могут быть трудно обнаружить с помощью калорий. Помимо оценки термотропных переходов липидов, точное изменение температуры DIB может быть использовано для изучения температурных изменений вмембранной структуре 38 и изучения того, как липидный состав и текучесть влияют на кинетику мембранно-активных видов (например, порообразующих пептидов и трансмембранныхбелков 37),в том числе млекопитающих и бактериальных мембран модели при физиологически соответствующей температуре (37 С).

В этом случае будет объяснено описание того, как собрать модифицированный нефтяной резервуар DIB и работать контроллер обратной связи-температуры, позволяющий сборку монослой и образование двухслойных при температурах выше РТ. Отличается от предыдущегопротокола 40, явные детали включены в отношении интеграции приборов, необходимых для измерения и контроля температуры параллельно сборки и характеристики DIB в нефтяном резервуаре. Таким образом, эта процедура позволит пользователю применять этот метод для формирования и изучения DIB в различных температурах в различных научных контекстах. Кроме того, репрезентативные результаты дают конкретные примеры типов измеримых изменений как в структуре мембран, так и в ионные транспортные изменения, которые могут происходить по мере изменения температуры. Эти методы являются важным дополнением ко многим биофизическим исследованиям, которые могут быть разработаны и эффективно выполнены в DIBs, в том числе изучение кинетики мембранно-активных видов в различных мембранных композициях.

Protocol

1. Подготовка нагретого арматуры Соберите 2 куска 1 мм толщиной изолятора резины обрезается до 25 мм х 40 мм в ширину и длину, соответственно, 2 части 6 мм толщиной резины, которые также 25 мм х 40 мм, подготовленный алюминиевый базовый прибор сборки, и акриловое масло резервуар, который по?…

Representative Results

На рисунке 1 показано, как на стадии микроскопа готовятся алюминиевые светильники и акриловое масло. Сборка шаги 1.2-1.4 служить для термически изолировать приспособление от сцены для более эффективного отопления. Шаги 1.5-1.7 показывают, как правильно прикрепить термокупл к…

Discussion

В описанном в настоящем протоколе содержатся инструкции по сборке и эксплуатации экспериментальной системы контроля температуры масла и капель, используемых для формирования ДИБ. Это особенно полезно для включения образования DIB с использованием липидов, которые имеют температуру п?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Финансовую поддержку оказали Национальный научный фонд Грант CBET-1752197 и Управление ввс по научным исследованиям Грант FA9550-19-1-0213.

Materials

25 mm x 40 mm x 1 mm insulative rubber (x2) Any Insulates the bottom of the aluminum fixture from the stage of the microscope
25 mm x 40 mm x 6 mm insulative rubber (x2) Any Protects heating elements from being damaged by the microscope stage clips and insulates the top of the heating elements.
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid  Sigma Aldrich M3183 Buffering agent for lipid solution
Acrylic substrate Fabricated in house HTD_STG_2 ~1000 uL acrylic well with a poka-yoke exterior profile to fix orientation
Aluminum fixture Fabricated in house HTD_STG_1 Base fixture with an oil well that holds the acylic fixture and includes two flat pads adjacent to the oil well for the heating elements 
Brain Total Lipid Extract Avanti 131101C-100mg 25 mg/mL porcine lipid extract 
Compact DAQ Chassis (cDAQ) National Instruments  cDAQ-9174  Chassis to house multiple types of sensor measurement or output modules
Data Acquisition System (DAQ) Molecular Devices  Digidata 1440A  High resolution analog to digital converter
Fixed gain amplifier/power supply Hewlitt Packard HP 6826A Amplifies DC voltage output from the voltage output module
Glass Cover Slip Corning CLS284525 Seals bottom of aluminum base and allows for optical characterization of the bilayer
Heating element (x2) Omega KHLV-101/5 25 mm x 25 mm polymide film kapton heating element with a 5 watt power limit. 
M3 Stainless Steel Screw McMaster Carr 90116A150 Secures thermocouple to aluminum fixture
Patch clamp amplifier Molecular Devices  AxoPatch 200B  Measures current and outputs voltage to the headstage
Personal computer Any Computer with mulitiple high speed usb ports and a minimum of 6 Gb of ram
Potassium Chloride Sigma Aldrich P3911 Electrolyte solution of dissociated ions
Temperature input module National Instruments  NI 9211 Enables open and cold junction thermocouple measurements for the cDAQ chassis
Thermocouple Omega JMTSS-020U-6  U-type thermocouple with a diameter of 0.02 inches and 6 inches in length
UV Curable Adhesive Loctite 19739 Secures glass coverslip to aluminum base fixture
Voltage output module National Instruments  NI 9263 Analog voltage output module for use with the cDAQ chassis
Waveform generator Agilent 33210A  Used to output a 10 mV 10 Hz sinusoidal waveform
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. van Meer, G., de Kroon, A. I. P. M. Lipid map of the mammalian cell. Journal of Cell Science. 124 (1), 5-8 (2011).
  2. Bayley, H., et al. Droplet interface bilayers. Molecular BioSystems. 4 (12), 1191-1208 (2008).
  3. Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 130 (18), 5878-5879 (2008).
  4. Holden, M. A., Needham, D., Bayley, H. Functional bionetworks from nanoliter water droplets. Journal of the American Chemical Society. 129 (27), 8650-8655 (2007).
  5. Sarles, S. A., Leo, D. J. Physical encapsulation of droplet interface bilayers for durable, portable biomolecular networks. Lab on a Chip. 10 (6), 710-717 (2010).
  6. Stanley, C. E., et al. A microfluidic approach for high-throughput droplet interface bilayer (DIB) formation. Chemical Communications. 46 (10), 1620-1622 (2010).
  7. Gross, L. C. M., Heron, A. J., Baca, S. C., Wallace, M. I. Determining membrane capacitance by dynamic control of droplet interface bilayer area. Langmuir. 27 (23), 14335-14342 (2011).
  8. Huang, J., Lein, M., Gunderson, C., Holden, M. A. Direct quantitation of peptide-mediated protein transport across a droplet, interface bilayer. Journal of the American Chemical Society. 133 (40), 15818-15821 (2011).
  9. Leptihn, S., Thompson, J. R., Ellory, J. C., Tucker, S. J., Wallace, M. I. In vitro reconstitution of eukaryotic ion channels using droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 133 (24), 9370-9375 (2011).
  10. Castell, O. K., Berridge, J., Wallace, M. I. Quantification of membrane protein inhibition by optical ion flux in a droplet interface bilayer array. Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3134-3138 (2012).
  11. Dixit, S. S., Pincus, A., Guo, B., Faris, G. W. Droplet shape analysis and permeability studies in droplet lipid bilayers. Langmuir. 28 (19), 7442-7451 (2012).
  12. Elani, Y., deMello, A. J., Niu, X., Ces, O. Novel technologies for the formation of 2-D and 3-D droplet interface bilayer networks. Lab on a Chip. 12 (18), 3514-3520 (2012).
  13. Michalak, Z., Fartash, D., Haque, N., Lee, S. Tunable crystallization via osmosis-driven transport across a droplet interface bilayer. CrystEngComm. 14 (23), 7865-7868 (2012).
  14. Punnamaraju, S., You, H., Steckl, A. J. Triggered release of molecules across droplet interface bilayer lipid membranes using photopolymerizable lipids. Langmuir. 28 (20), 7657-7664 (2012).
  15. Boreyko, J. B., Mruetusatorn, P., Sarles, S. A., Retterer, S. T., Collier, C. P. Evaporation-induced buckling and fission of microscale droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 135 (15), 5545-5548 (2013).
  16. Leptihn, S., et al. Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil. Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).
  17. Villar, G., Graham, A. D., Bayley, H. A Tissue-like printed material. Science. 340 (6128), 48-52 (2013).
  18. Barriga, H. M. G., et al. Droplet interface bilayer reconstitution and activity measurement of the mechanosensitive channel of large conductance from Escherichia coli. Journal of The Royal Society Interface. 11 (98), (2014).
  19. Boreyko, J. B., Polizos, G., Datskos, P. G., Sarles, S. A., Collier, C. P. Air-stable droplet interface bilayers on oil-infused surfaces. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (21), 7588-7593 (2014).
  20. Mruetusatorn, P., et al. Dynamic morphologies of microscale droplet interface bilayers. Soft Matter. 10 (15), 2530-2538 (2014).
  21. Najem, J., Dunlap, M., Sukharev, S., Leo, D. J. The gating mechanism of mechanosensitive channels in droplet interface bilayers. MRS Proceedings. , 1755 (2015).
  22. Taylor, G. J., Venkatesan, G. A., Collier, C. P., Sarles, S. A. Direct in situ measurement of specific capacitance, monolayer tension, and bilayer tension in a droplet interface bilayer. Soft Matter. 11 (38), 7592-7605 (2015).
  23. Bayley, H., Cazimoglu, I., Hoskin, C. E. G. Synthetic tissues. Emerging Topics in Life Sciences. 3 (5), 615-622 (2019).
  24. Oliver, A. E., et al. Protecting, patterning, and scaffolding supported lipid membranes using carbohydrate glasses. Lab on a Chip. 8 (6), 892-897 (2008).
  25. Maglia, G., et al. Droplet networks with incorporated protein diodes show collective properties. Nature Nanotechnology. 4 (7), 437-440 (2009).
  26. Najem, J. S., et al. Activation of bacterial channel MscL in mechanically stimulated droplet interface bilayers. Scientific Reports. 5, 13726 (2015).
  27. Freeman, E. C., Najem, J. S., Sukharev, S., Philen, M. K., Leo, D. J. The mechanoelectrical response of droplet interface bilayer membranes. Soft Matter. 12 (12), 3021-3031 (2016).
  28. Tamaddoni, N., Sarles, S. A. Toward cell-inspired materials that feel: measurements and modeling of mechanotransduction in droplet-based, multi-membrane arrays. Bioinspiration & Biomimetics. 11 (3), 036008 (2016).
  29. Restrepo Schild, V., et al. Light-patterned current generation in a droplet bilayer array. Scientific Reports. 7, 46585 (2017).
  30. Milianta, P. J., Muzzio, M., Denver, J., Cawley, G., Lee, S. Water permeability across symmetric and asymmetric droplet interface bilayers: Interaction of cholesterol sulfate with DPhPC. Langmuir. 31 (44), 12187-12196 (2015).
  31. Mruetusatorn, P., et al. Control of membrane permeability in air-stable droplet interface bilayers. Langmuir. 31 (14), 4224-4231 (2015).
  32. Wauer, T., et al. Construction and manipulation of functional three-dimensional droplet networks. ACS Nano. 8 (1), 771-779 (2013).
  33. Bayley, H. Building blocks for cells and tissues: Beyond a game. Emerging Topics in Life Sciences. 3 (5), 433-434 (2019).
  34. Booth, M., Restrepo Schild, V., Downs, F., Bayley, J. Droplet network, from lipid bilayer to synthetic tissues. Encyclopedia of Biophysics. , (2019).
  35. Booth, M. J., Cazimoglu, I., Bayley, H. Controlled deprotection and release of a small molecule from a compartmented synthetic tissue module. Communications Chemistry. 2 (1), 142 (2019).
  36. Gobbo, P., et al. Programmed assembly of synthetic protocells into thermoresponsive prototissues. Nature Materials. 17 (12), 1145-1153 (2018).
  37. Taylor, G. J., Sarles, S. A. Heating-enabled formation of droplet interface bilayers using escherichia coli total lipid extract. Langmuir. 31 (1), 325-337 (2015).
  38. Taylor, G. J., et al. Capacitive detection of low-enthalpy, higher-order phase transitions in synthetic and natural composition lipid membranes. Langmuir. 33 (38), 10016-10026 (2017).
  39. Lee, S., Kim, D. H., Needham, D. Equilibrium and dynamic interfacial tension measurements at microscopic interfaces using a micropipet technique. 2. Dynamics of phospholipid monolayer formation and equilibrium tensions at the water-air interface. Langmuir. 17 (18), 5544-5550 (2001).
  40. Najem, J. S., et al. Assembly and characterization of biomolecular memristors consisting of ion channel-doped lipid membranes. Journal of Visualized Experiments. (145), e58998 (2019).
  41. Wang, Y. G., Shao, H. H. Optimal tuning for PI controller. Automatica. 36 (1), 147-152 (2000).
  42. Needham, D., Haydon, D. A. Tensions and free energies of formation of "solventless" lipid bilayers. Measurement of high contact angles. Biophysical Journal. 41 (3), 251-257 (1983).
  43. Sarles, S. A., Leo, D. J. Physical Encapsulation of Interface Bilayers for durable portable biolayer network. Lab on a Chip. 10 (6), 710-717 (2010).
  44. Muller, R. U., Peskin, C. S. The kinetics of monazomycin-induced voltage-dependent conductance. II. Theory and a demonstration of a form of memory. The Journal of General Physiology. 78 (2), 201-229 (1981).
  45. Nenninger, A., et al. Independent mobility of proteins and lipids in the plasma membrane of Escherichia coli. Molecular Microbiology. 92 (5), 1142-1153 (2014).
  46. Venkatesan, G. A., et al. Adsorption kinetics dictate monolayer self-assembly for both lipid-in and lipid-out approaches to droplet interface bilayer formation. Langmuir. 31 (47), 12883-12893 (2015).
  47. Najem, J. S., et al. Memristive ion channel-doped biomembranes as synaptic mimics. ACS Nano. 12 (5), 4702-4711 (2018).
  48. Tamaddoni, N., Taylor, G., Hepburn, T., Michael Kilbey, S., Sarles, S. A. Reversible, voltage-activated formation of biomimetic membranes between triblock copolymer-coated aqueous droplets in good solvents. Soft Matter. 12, 5096-5109 (2016).

Tags

Droplet Interface BilayerDIBTemperature-controlled AssemblyCharacterizationMembraneHeat TransferThermocoupleAluminum FixtureAcrylic ReservoirHexadecane OilInsulative RubberResistive Heating ElementsElectrical/optical CharacterizationTemperature-related EffectsCellular EnvironmentsTransport And Signaling PropertiesMembrane ConstituentsNatural Cellular Extracts
check_url/pt/62362?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Ringley, J. D., Sarles, S. A. Temperature-Controlled Assembly and Characterization of a Droplet Interface Bilayer. J. Vis. Exp. (170), e62362, doi:10.3791/62362 (2021).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image