Ensemble à température contrôlée et caractérisation d’une bicouche d’interface de gouttelettes

Summary

Ce protocole détaille l’utilisation d’un système de chauffage à température contrôlée par rétroaction pour promouvoir l’assemblage de monocouche lipidique et la formation de bicouches d’interface de gouttelettes pour les lipides avec des températures de fusion élevées, ainsi que des mesures de capacité pour caractériser les changements induits par la température dans la membrane.

Abstract

La méthode de bicouche d’interface de gouttelettes (DIB) pour assembler des bicouches lipidiques (c’est-à-dire des DIB) entre des gouttelettes aqueuses enrobées de lipides dans l’huile offre des avantages clés par rapport à d’autres méthodes: les DIB sont stables et souvent durables, la zone de la bicouche peut être réglée de manière réversible, l’asymétrie des feuillets est facilement contrôlée via des compositions de gouttelettes et des réseaux de bicouches ressemblant à des tissus peuvent être obtenus en attenant de nombreuses gouttelettes. La formation de DIB nécessite l’assemblage spontané de lipides en monocouches lipidiques de haute densité à la surface des gouttelettes. Bien que cela se produise facilement à température ambiante pour les lipides synthétiques courants, une monocouche suffisante ou une bicouche stable ne parvient pas à se former dans des conditions similaires pour les lipides avec des points de fusion au-dessus de la température ambiante, y compris certains extraits lipidiques cellulaires. Ce comportement a probablement limité les compositions — et peut-être la pertinence biologique — des DIB dans les études de membrane de modèle. Pour résoudre ce problème, un protocole expérimental est présenté pour chauffer soigneusement le réservoir d’huile hébergeant des gouttelettes DIB et caractériser les effets de la température sur la membrane lipidique. Plus précisément, ce protocole montre comment utiliser un appareil en aluminium thermoconducteur et des éléments chauffants résistifs contrôlés par une boucle de rétroaction pour prescrire des températures élevées, ce qui améliore l’assemblage monocouche et la formation de bicouche pour un ensemble plus large de types de lipides. Les caractéristiques structurelles de la membrane, ainsi que les transitions de phase thermotrope des lipides composant la bicouche, sont quantifiées en mesurant les changements de capacité électrique du DIB. Ensemble, cette procédure peut aider à évaluer les phénomènes biophysiques dans les membranes modèles à différentes températures, y compris la détermination d’une température de fusion efficace(T_M)pour les mélanges lipidiques multicomposants. Cette capacité permettra ainsi une réplication plus étroite des transitions de phase naturelles dans les membranes modèles et encouragera la formation et l’utilisation de membranes modèles à partir d’une plus grande bande de constituants membranaires, y compris ceux qui capturent mieux l’hétérogénéité de leurs homologues cellulaires.

Introduction

Les membranes cellulaires sont des barrières sélectivement perméables composées de milliers de lipides de types^1,de protéines, de glucides et de stérols qui encapsulent et subdivisent toutes les cellules vivantes. Comprendre comment leurs compositions affectent leurs fonctions et révéler comment les molécules naturelles et synthétiques interagissent avec, adhèrent, perturbent et transfèrent les membranes cellulaires sont, par conséquent, des domaines de recherche importants avec de vastes implications en biologie, médecine, chimie, physique et génie des matériaux.

Ces objectifs de découverte bénéficient directement de techniques éprouvées d’assemblage, de manipulation et d’étude de membranes modèles, y compris des bicouches lipidiques assemblées à partir de lipides synthétiques ou naturels, qui imitent la composition, la structure et les propriétés de transport de leurs homologues cellulaires. Ces dernières années, la méthode^2,3,4 de la bicouche d’interface gouttelettes (DIB) pour la construction d’une bicouche lipidique plane entre des gouttelettes d’eau recouvertes de lipides dans l’huile a fait l’objet d’une attention significative^5,6,7,8,9,10,^{11, 12,}13,^{14, 15,16, 17, 18,19,20,21,22,23,}et a démontré des avantages pratiques par rapport à d’autres approches pour la formation de membranes modèles: la méthode DIB est simple à réaliser, ne nécessite aucune fabrication ou préparation sophistiquée (par exemple, « peinture ») d’un substrat pour soutenir la membrane, donne constamment des membranes avec des membranes supérieures longévité, permet des mesures électrophysiologiques standard, et simplifie la formation de membranes modèles avec des compositions de feuillets asymétriques^3. Parce que la bicouche se forme spontanément entre les gouttelettes et que chaque gouttelette peut être adaptée en position et en maquillage, la technique DIB a également suscité un intérêt considérable pour le développement de systèmes de matériaux inspirés des cellules qui s’appuient sur l’utilisation de membranes sensibles auxstimuli^{18,24,25, 26,27, 28,29,}compartimentation et transport équilibrés^14,30,31,et de matériaux tissulaires^{17,23,32,33,34,35,36.}

La majorité des expériences publiées sur des membranes modèles, y compris celles avec des DIB, ont été réalisées à température ambiante (RT, ~20-25 °C) et avec une poignée de lipides synthétiques (p. ex. DOPC, DPhPC, etc.). Cette pratique limite la portée des questions biophysiques qui peuvent être étudiées dans les membranes modèles et, sur la base de l’observation, elle peut également restreindre les types de lipides qui peuvent être utilisés pour assembler les DIB. Par exemple, un lipide synthétique tel que dppc, qui a une température de fusion de 42 °C, n’assemble pas de monocouches serrées ni ne forme de DIB à RT^37. La formation de DIB à température ambiante s’est également avérée difficile pour les extraits naturels, tels que ceux des mammifères (par exemple, l’extrait lipidique total du cerveau, BTLE)³⁸ ou des bactéries (par exemple, l’extrait lipidique total d’Escherichia coli, ETLE)³⁷, qui contiennent de nombreux types différents de lipides et proviennent de cellules qui résident à des températures élevées (37 ° C). L’étude de diverses compositions offre ainsi des occasions de comprendre les processus à médiation membranaire dans des conditions biologiquement pertinentes.

L’élévation de la température de l’huile peut servir à deux fins: elle augmente la cinétique de l’assemblage monocouche et elle peut provoquer une transition de fusion des lipides pour atteindre une phase de désordre liquide. Les deux conséquences facilitent l’assemblage^{monocouche 39,}un pré-requis pour un DIB. En plus du chauffage pour la formation de bicouches, le refroidissement de la membrane après la formation peut être utilisé pour identifier les transitions thermotropes dans les bicouches lipidiques simples^38,y compris celles dans les mélanges lipidiques naturels (par exemple, BTLE) qui peuvent être difficiles à détecter en utilisant la calorimétrie. En plus d’évaluer les transitions thermotropes des lipides, la variation précise de la température du DIB peut être utilisée pour étudier les changements induits par la température dans la structure de la membrane³⁸ et examiner comment la composition lipidique et la fluidité affectent la cinétique des espèces membranaires actives (par exemple, les peptides formant des pores et les protéines transmembranaires^37),y compris les membranes modèles mammifères et bactériennes à une température physiologiquement pertinente (37 °C).

Ici, une description de la façon d’assembler un réservoir d’huile DIB modifié et de faire fonctionner un contrôleur de température de rétroaction pour permettre l’assemblage monocouche et la formation de bicouche à des températures supérieures à RT sera expliquée. À la différence d’un protocole précédent^40,des détails explicites sont inclus concernant l’intégration de l’instrumentation nécessaire à la mesure et au contrôle de la température parallèlement à l’assemblage et à la caractérisation du DIB dans le réservoir d’huile. La procédure permettra ainsi à un utilisateur d’appliquer cette méthode pour former et étudier des DIB à travers une gamme de températures dans une variété de contextes scientifiques. De plus, les résultats représentatifs fournissent des exemples précis pour les types de changements mesurables dans la structure de la membrane et le transport des ions qui peuvent se produire lorsque la température varie. Ces techniques sont des ajouts importants aux nombreuses études biophysiques qui peuvent être conçues et réalisées efficacement dans les DIB, y compris l’étude de la cinétique des espèces membranaires actives dans différentes compositions membranaires.

Protocol

1. Préparation des appareils chauffés Rassemblez 2 pièces de caoutchouc isolant de 1 mm d’épaisseur garnies de 25 mm x 40 mm de largeur et de longueur, respectivement, 2 pièces d’un caoutchouc de 6 mm d’épaisseur qui sont également de 25 mm x 40 mm, un ensemble de fixation de base en aluminium préparé et un réservoir d’huile acrylique qui s’insère dans la fenêtre d’observation de l’appareil de base en aluminium (voir les figures S1, S2 et S3 pour plus de détails sur l…

Representative Results

La figure 1 montre comment le luminaire en aluminium et le réservoir d’huile acrylique sont préparés sur l’étage du microscope pour la formation de DIB. Les étapes d’assemblage 1.2 à 1.4 servent à isoler thermiquement le luminaire de la scène pour un chauffage plus efficace. Les étapes 1.5 à 1.7 montrent comment fixer correctement le thermocouple au luminaire et positionner le réservoir d’huile, et les étapes 1.8 à 1.9 montrent les emplacements recommandés pour la distr…

Discussion

Le protocole décrit ici fournit des instructions pour l’assemblage et l’exploitation d’un système expérimental pour contrôler la température de l’huile et des gouttelettes utilisées pour former des DIB. Il est particulièrement bénéfique pour permettre la formation de DIB en utilisant des lipides qui ont des températures de fusion supérieures à RT. De plus, en faisant varier précisément la température du réservoir d’huile, la température bicouche peut être manipulée pour étudier les effets de…

Materials

25 mm x 40 mm x 1 mm insulative rubber (x2)	Any		Insulates the bottom of the aluminum fixture from the stage of the microscope
25 mm x 40 mm x 6 mm insulative rubber (x2)	Any		Protects heating elements from being damaged by the microscope stage clips and insulates the top of the heating elements.
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid	Sigma Aldrich	M3183	Buffering agent for lipid solution
Acrylic substrate	Fabricated in house	HTD_STG_2	~1000 uL acrylic well with a poka-yoke exterior profile to fix orientation
Aluminum fixture	Fabricated in house	HTD_STG_1	Base fixture with an oil well that holds the acylic fixture and includes two flat pads adjacent to the oil well for the heating elements
Brain Total Lipid Extract	Avanti	131101C-100mg	25 mg/mL porcine lipid extract
Compact DAQ Chassis (cDAQ)	National Instruments	cDAQ-9174	Chassis to house multiple types of sensor measurement or output modules
Data Acquisition System (DAQ)	Molecular Devices	Digidata 1440A	High resolution analog to digital converter
Fixed gain amplifier/power supply	Hewlitt Packard	HP 6826A	Amplifies DC voltage output from the voltage output module
Glass Cover Slip	Corning	CLS284525	Seals bottom of aluminum base and allows for optical characterization of the bilayer
Heating element (x2)	Omega	KHLV-101/5	25 mm x 25 mm polymide film kapton heating element with a 5 watt power limit.
M3 Stainless Steel Screw	McMaster Carr	90116A150	Secures thermocouple to aluminum fixture
Patch clamp amplifier	Molecular Devices	AxoPatch 200B	Measures current and outputs voltage to the headstage
Personal computer	Any		Computer with mulitiple high speed usb ports and a minimum of 6 Gb of ram
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P3911	Electrolyte solution of dissociated ions
Temperature input module	National Instruments	NI 9211	Enables open and cold junction thermocouple measurements for the cDAQ chassis
Thermocouple	Omega	JMTSS-020U-6	U-type thermocouple with a diameter of 0.02 inches and 6 inches in length
UV Curable Adhesive	Loctite	19739	Secures glass coverslip to aluminum base fixture
Voltage output module	National Instruments	NI 9263	Analog voltage output module for use with the cDAQ chassis
Waveform generator	Agilent	33210A	Used to output a 10 mV 10 Hz sinusoidal waveform