Assemblaggio a temperatura controllata e caratterizzazione di un bistrato di interfaccia a goccia

Summary

Questo protocollo descrive in dettaglio l’uso di un sistema di riscaldamento a temperatura controllata a retroazione per promuovere l’assemblaggio monostrato lipidico e la formazione di bistrati di interfaccia a goccia per lipidi con temperature di fusione elevate e misurazioni della capacità per caratterizzare i cambiamenti guidati dalla temperatura nella membrana.

Abstract

Il metodo di battiscopi di interfaccia a goccia (DIB) per assemblare bistrati lipidici (cioè DIB) tra goccioline acquose rivestite di lipidi nell’olio offre vantaggi chiave rispetto ad altri metodi: i DIB sono stabili e spesso di lunga durata, l’area bistrato può essere sintonizzata in modo reversibile, l’asimmetria del foglio illustrativo è prontamente controllata tramite composizioni di goccioline e reti tissutali di bistrati possono essere ottenute confinando con molte goccioline. La formazione di DIB richiede l’assemblaggio spontaneo di lipidi in monostrati lipidici ad alta densità sulle superfici delle goccioline. Mentre questo si verifica prontamente a temperatura ambiente per i comuni lipidi sintetici, un monostrato o un bistrato stabile sufficiente non riesce a formarsi in condizioni simili per i lipidi con punti di fusione sopra la temperatura ambiente, inclusi alcuni estratti lipidici cellulari. Questo comportamento ha probabilmente limitato le composizioni – e forse la rilevanza biologica – dei DIB negli studi di membrana modello. Per affrontare questo problema, viene presentato un protocollo sperimentale per riscaldare attentamente il serbatoio dell’olio che ospita goccioline DIB e caratterizzare gli effetti della temperatura sulla membrana lipidica. In particolare, questo protocollo mostra come utilizzare un apparecchio in alluminio termoduttivo e elementi riscaldanti resistivi controllati da un circuito di feedback per prescrivere temperature elevate, che migliora l’assemblaggio monostrato e la formazione di due livelli per un set più ampio di tipi di lipidi. Le caratteristiche strutturali della membrana, così come le transizioni di fase termotropiche dei lipidi che compongono il bistrato, sono quantificate misurando i cambiamenti nella capacità elettrica del DIB. Insieme, questa procedura può aiutare a valutare i fenomeni biofisici nelle membrane modello a varie temperature, compresa la determinazione di una temperatura di fusione efficace(T_M)per miscele lipidiche multicomponente. Questa capacità consentirà quindi una più stretta replicazione delle transizioni di fase naturali nelle membrane modello e incoraggerà la formazione e l’uso di membrane modello da una fascia più ampia di costituenti della membrana, compresi quelli che catturano meglio l’eterogeneità delle loro controparti cellulari.

Introduction

Le membrane cellulari sono barriere selettivamente permeabili composte da migliaia di tipi lipidici^1,proteine, carboidrati e steroli che incapsulano e suddividono tutte le cellule viventi. Comprendere come le loro composizioni influenzano le loro funzioni e rivelare come le molecole naturali e sintetiche interagiscono, aderiscono, interrompono e traslocano le membrane cellulari sono, quindi, importanti aree di ricerca con implicazioni di vasta portata in biologia, medicina, chimica, fisica e ingegneria dei materiali.

Questi obiettivi di scoperta beneficiano direttamente di tecniche comprovate per assemblare, manipolare e studiare membrane modello , inclusi bistrati lipidici assemblati da lipidi sintetici o presenti in natura, che imitano la composizione, la struttura e le proprietà di trasporto delle loro controparti cellulari. Negli ultimi anni, il bistrato di interfaccia a goccia (DIB)^{metodo 2,3,4} per la costruzione di un bistrato lipidico planare tra goccioline d’acqua rivestite di lipidi nell’olio ha ricevuto^{un’attenzione significativa 5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,}e ha dimostrato vantaggi pratici rispetto ad altri approcci per la formazione della membrana modello: il metodo DIB è semplice da eseguire, non richiede una fabbricazione o una preparazione sofisticata (ad es. “pittura”) di un substrato per sostenere la membrana, produce costantemente membrane con longevità, consente misurazioni elettrofisiologia standard e semplifica la formazione di membrane modello con composizioni asimmetriche di volantini³. Poiché il bistrato si forma spontaneamente tra goccioline e ogni goccia può essere su misura in posizione e trucco, la tecnica DIB ha anche attirato notevole interesse nello sviluppo di sistemi di materiali ispirati alle cellule che si basano sull’uso di membrane stimolanti-reattive^{18,24,25,26,27,28,29,}compartimentazione e trasporto^{bilanciati 14,30,31}e materiali tissutali^{17,23,32,33,34,35,36.}

La maggior parte degli esperimenti pubblicati sulle membrane modello, comprese quelle con DIB, sono stati eseguiti a temperatura ambiente (RT, ~ 20-25 ° C) e con una manciata di lipidi sintetici (ad esempio, DOPC, DPhPC, ecc.). Questa pratica limita la portata delle domande biofisiche che possono essere studiate nelle membrane modello e, in base all’osservazione, può anche limitare i tipi di lipidi che possono essere utilizzati per assemblare DIB. Ad esempio, un lipide sintetico come il DPPC, che ha una temperatura di fusione di 42 °C, non assembla monostrati ben imballati o forma DIB a RT³⁷. La formazione di DIB a temperatura ambiente si è dimostrata difficile anche per gli estratti naturali, come quelli provenienti da mammiferi (ad esempio, estratto lipidico totale cerebrale, BTLE)³⁸ o batteri (ad esempio, estratto lipidico totale di Escherichia coli, ETLE)³⁷, che contengono molti tipi diversi di lipidi e provengono da cellule che risiedono a temperature elevate (37 °C). Consentire lo studio di diverse composizioni offre quindi l’opportunità di comprendere i processi mediati dalla membrana in condizioni biologicamente rilevanti.

Aumentare la temperatura dell’olio può servire a due scopi: aumenta la cinetica dell’assemblaggio monostrato e può causare ai lipidi di subire una transizione di fusione per raggiungere una fase disordinata liquida. Entrambe le conseguenze aiutano^{nell’assemblaggio monostrato 39}, un prerequisito per un DIB. Oltre al riscaldamento per la formazione di due strato, il raffreddamento della membrana dopo la formazione può essere utilizzato per identificare le transizioni termotropiche in singoli bistrati lipidici³⁸, compresi quelli in miscele lipidiche naturali (ad esempio, BTLE) che possono essere difficili da rilevare usando la calorimetria. Oltre a valutare le transizioni termotropiche dei lipidi, variare con precisione la temperatura del DIB può essere utilizzato per studiare i cambiamenti indotti dalla temperatura nella struttura della membrana³⁸ ed esaminare in che modo la composizione lipidica e la fluidità influenzano la cinetica delle specie attive della membrana (ad esempio, peptidi che formano pori e proteine transmembrana³⁷), comprese le membrane modello di mammiferi e batteriche a una temperatura fisiologicamente rilevante (37 °C).

Nel presente documento verrà spiegata una descrizione di come assemblare un serbatoio di olio DIB modificato e utilizzare un regolatore di temperatura di feedback per consentire l’assemblaggio monostrato e la formazione di due livelli a temperature superiori a RT. Distinto da un precedente protocollo^{40, è incluso}un dettaglio esplicito per quanto riguarda l’integrazione della strumentazione necessaria per misurare e controllare la temperatura in parallelo all’assemblaggio e alla caratterizzazione del DIB nel serbatoio dell’olio. La procedura consentirà quindi all’utente di applicare questo metodo per la formazione e lo studio dei DIB in una serie di temperature in una varietà di contesti scientifici. Inoltre, i risultati rappresentativi forniscono esempi specifici per i tipi di cambiamenti misurabili sia nella struttura della membrana che nel trasporto ionica che possono verificarsi man mano che la temperatura è varia. Queste tecniche sono importanti aggiunte ai numerosi studi biofisici che possono essere progettati ed eseguiti efficacemente nei DIB, incluso lo studio della cinetica delle specie attive a membrana in diverse composizioni di membrana.

Protocol

1. Preparazione dell’apparecchio riscaldato Raccogliere 2 pezzi di gomma isolante spessa 1 mm tagliati a 25 mm x 40 mm di larghezza e lunghezza, rispettivamente, 2 pezzi di gomma spessa 6 mm che sono anche 25 mm x 40 mm, un gruppo di fissaggio di base in alluminio preparato e un serbatoio di olio acrilico che si adatta alla finestra di visualizzazione dell’apparecchio di base in alluminio (vedi figure S1, S2 e S3 per i dettagli sulla fabbricazione e una vista esplosa del gruppo). Preparare prim…

Representative Results

La figura 1 mostra come l’apparecchio in alluminio e il serbatoio dell’olio acrilico sono preparati sullo stadio del microscopio per la formazione di DIB. I passaggi di assemblaggio 1.2-1.4 servono a isolare termicamente l’apparecchio dal palco per un riscaldamento più efficiente. I passaggi 1.5-1.7 mostrano come collegare correttamente la termocopia all’apparecchio e posizionare il serbatoio dell’olio, e i passaggi 1.8 -1.9 mostrano le posizioni consigliate per l’erogazione dell’olio in qu…

Discussion

Il protocollo qui descritto fornisce istruzioni per assemblare e far funzionare un sistema sperimentale per controllare la temperatura dell’olio e delle goccioline utilizzate per formare DIB. È particolarmente utile per consentire la formazione di DIB utilizzando lipidi che hanno temperature di fusione superiori a RT. Inoltre, variando con precisione la temperatura del serbatoio dell’olio, la temperatura del bistrato può essere manipolata per studiare gli effetti di temperature elevate su varie proprietà e caratterist…

Materials

25 mm x 40 mm x 1 mm insulative rubber (x2)	Any		Insulates the bottom of the aluminum fixture from the stage of the microscope
25 mm x 40 mm x 6 mm insulative rubber (x2)	Any		Protects heating elements from being damaged by the microscope stage clips and insulates the top of the heating elements.
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid	Sigma Aldrich	M3183	Buffering agent for lipid solution
Acrylic substrate	Fabricated in house	HTD_STG_2	~1000 uL acrylic well with a poka-yoke exterior profile to fix orientation
Aluminum fixture	Fabricated in house	HTD_STG_1	Base fixture with an oil well that holds the acylic fixture and includes two flat pads adjacent to the oil well for the heating elements
Brain Total Lipid Extract	Avanti	131101C-100mg	25 mg/mL porcine lipid extract
Compact DAQ Chassis (cDAQ)	National Instruments	cDAQ-9174	Chassis to house multiple types of sensor measurement or output modules
Data Acquisition System (DAQ)	Molecular Devices	Digidata 1440A	High resolution analog to digital converter
Fixed gain amplifier/power supply	Hewlitt Packard	HP 6826A	Amplifies DC voltage output from the voltage output module
Glass Cover Slip	Corning	CLS284525	Seals bottom of aluminum base and allows for optical characterization of the bilayer
Heating element (x2)	Omega	KHLV-101/5	25 mm x 25 mm polymide film kapton heating element with a 5 watt power limit.
M3 Stainless Steel Screw	McMaster Carr	90116A150	Secures thermocouple to aluminum fixture
Patch clamp amplifier	Molecular Devices	AxoPatch 200B	Measures current and outputs voltage to the headstage
Personal computer	Any		Computer with mulitiple high speed usb ports and a minimum of 6 Gb of ram
Potassium Chloride	Sigma Aldrich	P3911	Electrolyte solution of dissociated ions
Temperature input module	National Instruments	NI 9211	Enables open and cold junction thermocouple measurements for the cDAQ chassis
Thermocouple	Omega	JMTSS-020U-6	U-type thermocouple with a diameter of 0.02 inches and 6 inches in length
UV Curable Adhesive	Loctite	19739	Secures glass coverslip to aluminum base fixture
Voltage output module	National Instruments	NI 9263	Analog voltage output module for use with the cDAQ chassis
Waveform generator	Agilent	33210A	Used to output a 10 mV 10 Hz sinusoidal waveform