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Bioengenharia

液滴界面二層の温度制御アセンブリと特性

Published: April 19, 2021
doi:
10.3791/62362
,
1Department of Mechanical, Aerospace and Biomedical Engineering,University of Tennessee

Summary

このプロトコルは、溶融温度の上昇を伴う脂質の脂質単層アセンブリおよび液滴界面二重層形成を促進するためのフィードバック温度制御加熱システムの使用、および膜の温度駆動変化を特徴付ける容量測定の詳細を示す。

Abstract

油中の脂質被覆水滴間で脂質二重層(すなわち、DIB)を組み立てる液滴界二重層(DIB)法は、他の方法に対して重要な利点を提供する:DIBは安定しており、しばしば長持ちし、二重層領域は可逆的に調整することができ、リーフレット非対称性は液滴組成物を介して容易に制御され、二重層の組織状ネットワークは、多くの滴を介して容易に制御され、二重層の組織状ネットワークは、多くの滴によって得ることができる。DIBを形成するには、液滴の表面で高密度脂質単層に脂質を自発的に集める必要があります。これは一般的な合成脂質の室温で容易に起こるが、十分な単層または安定な二重層は、いくつかの細胞脂質抽出物を含む室温以上の融点を有する脂質に対して同様の条件で形成できない。この動作は、モデル膜研究におけるDIBの組成(おそらく生物学的関連性)を制限している可能性があります。この問題に対処するために、DIB液滴をホストする油溜層を慎重に加熱し、脂質膜に対する温度の影響を特徴付ける実験プロトコルが提示される。具体的には、このプロトコルは、熱伝導性のアルミニウムフィクスチャと、フィードバックループによって制御される抵抗加熱要素を使用して、より広い脂質タイプの単層アセンブリおよび二層形成を改善する高温を規定する方法を示す。膜の構造的特性は、二重層を含む脂質の熱的な相転移と同様に、DIBの電気容量の変化を測定することによって定量される。この手順を組み合わせることで、多成分脂質混合物の有効な融解温度(TM)の決定を含む、様々な温度にわたってモデル膜の生物物理学的現象を評価するのに役立ちます。この機能は、モデル膜における自然相転移のより緊密な複製を可能にし、細胞の異質性をより良く捕捉するものも含め、より広い範囲の膜構成体からのモデル膜の形成と使用を促進する。

Introduction

細胞膜は、何千もの脂質タイプ1、タンパク質、炭水化物、ステロールから構成され、すべての生きた細胞をカプセル化して細分化する選択的透過性バリアです。その組成がそれらの機能にどのような影響を与えるかを理解し、自然分子と合成分子が細胞膜とどのように相互作用し、接着し、破壊し、トランスポジションするかを明らかにすることは、生物学、医学、化学、物理学、材料工学において広範囲に及ぶ影響を持つ重要な研究分野です。

これらの発見は、合成脂質または天然脂質から組み立てられた脂質二重層を含むモデル膜を組み立て、操作、および研究するための実証済みの技術から直接利益を得ることを目的としています。近年、油脂中の脂質被覆水滴間に平坦な脂質二重層を構築するための液滴界面二重層(DIB)法2、3、4は、5、6、7、8、9、11、1に大きな注目を集めている2,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,およびモデル膜形成のための他のアプローチよりも実用的な利点を示している:DIB法は、実行が簡単である、 洗練された製造や準備を必要としない(例えば、 膜を支える基質の「絵画」)は、一貫して優れた膜を生み出す長寿は、標準的な電気生理学的測定を可能にし、非対称リーフレット組成物3を有するモデル膜の形成を簡素化する。二重層は液滴と各液滴の間に自発的に形成されるため、位置と化粧で調整することができます。 DIB技術は、刺激応答性膜18、24、25、26、27、28、28、バランスのとれた区画化および輸送14、30、31、および組織状材料17、23、32、33、34、35、36を使用して構築する細胞に触発された材料システムの開発にも大きな関心を集めています。

モデル膜に関する公開実験の大半は、DIBを含め、室温(RT、〜20~25°C)および一握りの合成脂質(例えば、DOPC、DPhPCなど)で行われている。この実習では、モデル膜で研究できる生体物理学的な質問の範囲が制限され、観察に基づいて、DIBを組み立てるために使用できる脂質の種類も制限できます。例えば、42°Cの融解温度を有するDPPCのような合成脂質は、密に詰まった単層を組み立てないか、またはRT37でDDBを形成する。室温でのDIB形成は、哺乳類(例えば、脳総脂質抽出物、BTLE)38または細菌(例えば、大腸菌全脂質抽出物、ETLE)37などから生じる天然抽出物に対しても困難であることが証明されている。多様な組成物の研究を可能にすることで、生物学的に関連する条件で膜介在プロセスを理解する機会を提供します。

油の温度を上げることは2つの目的を果たすことができます:それは単層アセンブリの運動学を増加させ、脂質が液体乱れた相に達するために溶融遷移を受ける可能性があります。両方の結果は、単層アセンブリ39、DIBの前提条件を助ける。二重層形成のための加熱に加えて、形成後の膜を冷却して、カロリー測定を用いて検出が困難な天然脂質混合物(例えば、BTLE)内のものを含む単一脂質二重層38における熱的な遷移を同定するために使用することができる。脂質の熱的な遷移を評価する以外に、DIBの温度を正確に変化させることで、膜構造38 の温度誘発変化を研究し、脂質組成および流動性が膜活性種(例えば、気孔形成ペプチドおよび膜貫通タンパク質37)に与える影響を調べることができます。

本明細書において、改変されたDIB油貯留層を組み立て、RTよりも高い温度で単層アセンブリおよび二層形成を可能にするフィードバック温度コントローラを動作させる方法の説明が説明される。以前のプロトコル40とは区別して、オイル貯蔵所のDIBのアセンブリおよび特性評価に平行して温度を測定し、制御するために必要な器械使用の統合に関して明記された詳細が含まれている。したがって、この手順により、ユーザーはさまざまな科学的文脈で温度範囲にわたってDiIbを形成し、研究するためにこの方法を適用することができます。さらに、代表的な結果は、温度が変化するにつれて起こり得る膜構造およびイオン輸送の両方における測定可能な変化の種類についての具体的な例を提供する。これらの技術は、異なる膜組成における膜活性種の運動学の研究を含む、DIBで効果的に設計および実施することができる多くの生物物理学的研究に重要な追加である。

Protocol

1. 加熱された器具の準備 幅と長さで25mm x 40mmにトリミングされた厚さ1mmの絶縁ゴム2個、25mm x 40mmの厚さ6mmのゴム2個、準備されたアルミニウムベースフィクスチャアセンブリ、アルミニウムベースフィクスチャの表示窓に収まるアクリルオイルリザーバー( 図S1、S2、およびS3 を収集して、製作と分解した組み立て図の詳細を参照)。最初に、UV硬化性接着剤でガラスカバース…

Representative Results

図1は、DIB形成用の顕微鏡ステージ上でアルミニウム製の器具およびアクリルオイル貯留層がどのように調製されているかを示しています。組み立てステップ1.2-1.4は、より効率的な加熱のために、ステージからフィクスチャを熱絶縁するのに役立ちます。ステップ1.5-1.7は、熱電対をフィクスチャに適切に取り付け、オイル貯蔵所を配置する方法を示し、ステップ1.8 -1.9?…

Discussion

本明細書に記載されているプロトコルは、Dibを形成するために使用される油および液滴の温度を制御する実験システムを組み立て、操作するための指示を提供する。RT以上の融解温度を有する脂質を用いてDIB形成を可能にする上で特に有益である。さらに、油溜めの温度を正確に変化させることにより、二層温度を操作して、容量、面積、厚さ、熱伝導相変化、膜活性種の運動論、および二?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

国立科学財団グラントCBET-1752197と空軍科学研究研究グラントFA9550-19-1-0213によって財政的支援が提供されました。

Materials

25 mm x 40 mm x 1 mm insulative rubber (x2) Any Insulates the bottom of the aluminum fixture from the stage of the microscope
25 mm x 40 mm x 6 mm insulative rubber (x2) Any Protects heating elements from being damaged by the microscope stage clips and insulates the top of the heating elements.
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid  Sigma Aldrich M3183 Buffering agent for lipid solution
Acrylic substrate Fabricated in house HTD_STG_2 ~1000 uL acrylic well with a poka-yoke exterior profile to fix orientation
Aluminum fixture Fabricated in house HTD_STG_1 Base fixture with an oil well that holds the acylic fixture and includes two flat pads adjacent to the oil well for the heating elements 
Brain Total Lipid Extract Avanti 131101C-100mg 25 mg/mL porcine lipid extract 
Compact DAQ Chassis (cDAQ) National Instruments  cDAQ-9174  Chassis to house multiple types of sensor measurement or output modules
Data Acquisition System (DAQ) Molecular Devices  Digidata 1440A  High resolution analog to digital converter
Fixed gain amplifier/power supply Hewlitt Packard HP 6826A Amplifies DC voltage output from the voltage output module
Glass Cover Slip Corning CLS284525 Seals bottom of aluminum base and allows for optical characterization of the bilayer
Heating element (x2) Omega KHLV-101/5 25 mm x 25 mm polymide film kapton heating element with a 5 watt power limit. 
M3 Stainless Steel Screw McMaster Carr 90116A150 Secures thermocouple to aluminum fixture
Patch clamp amplifier Molecular Devices  AxoPatch 200B  Measures current and outputs voltage to the headstage
Personal computer Any Computer with mulitiple high speed usb ports and a minimum of 6 Gb of ram
Potassium Chloride Sigma Aldrich P3911 Electrolyte solution of dissociated ions
Temperature input module National Instruments  NI 9211 Enables open and cold junction thermocouple measurements for the cDAQ chassis
Thermocouple Omega JMTSS-020U-6  U-type thermocouple with a diameter of 0.02 inches and 6 inches in length
UV Curable Adhesive Loctite 19739 Secures glass coverslip to aluminum base fixture
Voltage output module National Instruments  NI 9263 Analog voltage output module for use with the cDAQ chassis
Waveform generator Agilent 33210A  Used to output a 10 mV 10 Hz sinusoidal waveform
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Ringley, J. D., Sarles, S. A. Temperature-Controlled Assembly and Characterization of a Droplet Interface Bilayer. J. Vis. Exp. (170), e62362, doi:10.3791/62362 (2021).
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