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Abstract
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Bioengenharia

Montagem controlada por temperatura e caracterização de um Bilayer de interface de gotícula

Published: April 19, 2021
doi:
10.3791/62362
,
1Department of Mechanical, Aerospace and Biomedical Engineering,University of Tennessee

Summary

Este protocolo detalha o uso de um sistema de aquecimento controlado pela temperatura para promover a montagem de monocamadas lipídicas e a formação de bicamadas de interface de gotícula para lipídios com temperaturas elevadas de fusão e medidas de capacitância para caracterizar mudanças orientadas pela temperatura na membrana.

Abstract

O método de bicamadas de interface de gota (DIB) para a montagem de bicamadas lipídicas (ou seja, DIBs) entre gotículas aquosas revestidas de lipídios no óleo oferece benefícios importantes em relação a outros métodos: os DIBs são estáveis e, muitas vezes, a área bicamada de longa duração pode ser reversivelmente ajustada, a assimetria de folhetos é facilmente controlada através de composições de gotículas, e redes semelhantes a tecidos de bicamadas podem ser obtidas por muitas gotículas adjacentes. A formação de DIBs requer montagem espontânea de lipídios em monocamadas lipídicas de alta densidade nas superfícies das gotículas. Embora isso ocorra prontamente à temperatura ambiente para lipídios sintéticos comuns, uma monocamide ou bicamadas estáveis suficientes não se formam em condições semelhantes para lipídios com pontos de fusão acima da temperatura ambiente, incluindo alguns extratos lipídes celulares. Esse comportamento provavelmente limitou as composições — e talvez a relevância biológica — dos DIBs em estudos de membrana modelo. Para resolver esse problema, um protocolo experimental é apresentado para aquecer cuidadosamente o reservatório de óleo que hospeda gotículas DIB e caracterizar os efeitos da temperatura na membrana lipídica. Especificamente, este protocolo mostra como usar uma luminária de alumínio termicamente condutora e elementos de aquecimento resistivos controlados por um loop de feedback para prescrever temperaturas elevadas, o que melhora a montagem de monocamadas e a formação de bicamadas para um conjunto mais amplo de tipos lipídes. Características estruturais da membrana, bem como as transições de fase termotrópica dos lipídios que compõem a bicamada, são quantificadas medindo as alterações na capacitância elétrica do DIB. Em conjunto, este procedimento pode auxiliar na avaliação de fenômenos biofísicos em membranas modelo sobre várias temperaturas, incluindo a determinação de uma temperatura de fusão eficaz (TM) para misturas lipídicas multicomponidais. Essa capacidade permitirá, assim, uma replicação mais próxima das transições de fases naturais nas membranas do modelo e incentivará a formação e o uso de membranas modelo a partir de uma faixa mais ampla de constituintes de membrana, incluindo aquelas que melhor captam a heterogeneidade de suas contrapartes celulares.

Introduction

As membranas celulares são barreiras seletivamente permeáveis compostas por milhares de lipídiostipos 1,proteínas, carboidratos e esteróis que encapsulam e subdividem todas as células vivas. Entender como suas composições afetam suas funções e revelar como moléculas naturais e sintéticas interagem, aderem, interrompem e translocam membranas celulares são, portanto, áreas importantes da pesquisa com implicações de grande alcance na biologia, medicina, química, física e engenharia de materiais.

Esses objetivos para a descoberta se beneficiam diretamente de técnicas comprovadas para montar, manipular e estudar membranas modelo — incluindo bicamadas lipídicas montadas a partir de lipídios sintéticos ou de ocorrência natural — que imitam as propriedades de composição, estrutura e transporte de suas contrapartes celulares. Nos últimos anos, o método bilayer de interface de gotícula (DIB)2,3,4 para a construção de um bicamado lipídeca planar entre gotículas de água revestidas de lipídios no óleo recebeu atenção significativa5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23, e demonstrou vantagens práticas sobre outras abordagens para a formação de membrana modelo: o método DIB é simples de realizar, não requer fabricação ou preparação sofisticada (por exemplo, “pintura”) de um substrato para suportar a membrana, consistentemente produz membranas com superior longevidade, permite medições de eletrofisiologia padrão, e simplifica a formação de membranas modelo com composições de folhetos assimétricos3. Como o bicamado se forma espontaneamente entre gotículas e cada gota pode ser adaptada em posição e maquiagem, a técnica DIB também atraiu considerável interesse no desenvolvimento de sistemas materiais inspirados em células que se baseiam no uso de membranas responsivas a estímulos18,24,25,26,27,28,2829, compartimentação e transporteequilibrados 14,30,31, e materiais semelhantes a tecidos17,23,32,33,34,35,36.

A maioria dos experimentos publicados em membranas de modelo, incluindo aqueles com DIBs, foram realizados à temperatura ambiente (RT, ~20-25 °C) e com um punhado de lipídios sintéticos (por exemplo, DOPC, DPhPC, etc.). Essa prática limita o escopo de questões biofísicas que podem ser estudadas em membranas modelo e, com base na observação, também pode restringir os tipos de lipídios que podem ser usados para montar DIBs. Por exemplo, um lipídio sintético como o DPPC, que tem uma temperatura de fusão de 42 °C, não monta monocamadas bem embaladas ou forma DIBs na RT37. A formação de DIB à temperatura ambiente também tem se mostrado difícil para extratos naturais, como os de mamíferos (por exemplo, extrato lipídico total cerebral, BTLE)38 ou bactérias (por exemplo, extrato lipídico total de Escherichia coli, ETLE)37, que contêm muitos tipos diferentes de lipídios e se originam de células que residem a temperaturas elevadas (37 °C). Viabilizar o estudo de diversas composições proporciona, assim, oportunidades de compreender processos mediados por membrana em condições biologicamente relevantes.

Elevar a temperatura do óleo pode servir a dois propósitos: aumenta a cinética da montagem de monocamadas e pode fazer com que os lipídios sejam submetidos a uma transição de fusão para chegar a uma fase desordenada líquida. Ambas as consequências auxiliam na montagem de monocamadas39, um pré-requisito para um DIB. Além do aquecimento para a formação de bicamadas, o resfriamento da membrana após a formação pode ser usado para identificar transições termotrópicas em bicamadas lipídicassimples 38, incluindo aquelas em misturas lipídicas naturais (por exemplo, BTLE) que podem ser difíceis de detectar usando a calorimetria. Além de avaliar transições termotrópicas de lipídios, precisamente variando a temperatura do DIB pode ser usado para estudar alterações induzidas pela temperatura na estrutura da membrana38 e examinar como a composição lipídica e a fluidez afetam a cinética de espécies ativas de membrana (por exemplo, peptídeos formadores de poros e proteínas transmembranas37),incluindo membranas de modelos mamíferos e bacterianos a uma temperatura fisiologicamente relevante (37 °C).

Aqui, uma descrição de como montar um reservatório de óleo DIB modificado e operar um controlador de temperatura de feedback para permitir a montagem de monocamadas e a formação de bicamadas a temperaturas mais altas que a RT será explicada. Distinguido de um protocolo anterior40,é incluído detalhe explícito em relação à integração da instrumentação necessária para medir e controlar a temperatura paralelamente à montagem e caracterização do DIB no reservatório de petróleo. O procedimento permitirá, assim, que o usuário aplique este método para formar e estudar DIBs em uma variedade de temperaturas em uma variedade de contextos científicos. Além disso, os resultados representativos fornecem exemplos específicos para os tipos de alterações mensuráveis tanto na estrutura da membrana quanto no transporte de íons que podem ocorrer à medida que a temperatura é variada. Essas técnicas são importantes adições aos muitos estudos biofísicos que podem ser projetados e realizados efetivamente em DIBs, inclusive estudando a cinética de espécies membrana-ativas em diferentes composições de membrana.

Protocol

1. Preparação aquecida da luminária Reúna 2 peças de borracha isolante de 1 mm de espessura aparadas a 25 mm x 40 mm de largura e comprimento, respectivamente, 2 peças de borracha de 6 mm de espessura que também são de 25 mm x 40 mm, um conjunto de luminárias de alumínio preparadas e um reservatório de óleo acrílico que se encaixa na janela de visualização da luminária base de alumínio (ver Figuras S1, S2 e S3 para detalhes sobre a fabricação e uma visão explodida de montage…

Representative Results

A Figura 1 mostra como a luminária de alumínio e o reservatório de óleo acrílico são preparados no estágio do microscópio para a formação de DIB. As etapas de montagem 1.2-1.4 servem para isolar termicamente a luminária do palco para um aquecimento mais eficiente. As etapas 1.5-1.7 mostram como fixar adequadamente o termopar à luminária e posicionar o reservatório de óleo, e as etapas 1.8 -1.9 mostram locais recomendados para a distribuição de óleo nessas peças. <p cla…

Discussion

O protocolo aqui descrito fornece instruções para a montagem e operação de um sistema experimental para controlar a temperatura do óleo e gotículas usadas para formar DIBs. É especialmente benéfico para permitir a formação de DIB usando lipídios que têm temperaturas de fusão acima de RT. Além disso, variando precisamente a temperatura do reservatório de óleo, a temperatura bicamada pode ser manipulada para estudar os efeitos das temperaturas elevadas em várias propriedades e características da membrana,…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

O apoio financeiro foi fornecido pela National Science Foundation Grant CBET-1752197 e pelo Escritório de Pesquisa Científica da Força Aérea, Grant FA9550-19-1-0213.

Materials

25 mm x 40 mm x 1 mm insulative rubber (x2) Any Insulates the bottom of the aluminum fixture from the stage of the microscope
25 mm x 40 mm x 6 mm insulative rubber (x2) Any Protects heating elements from being damaged by the microscope stage clips and insulates the top of the heating elements.
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid  Sigma Aldrich M3183 Buffering agent for lipid solution
Acrylic substrate Fabricated in house HTD_STG_2 ~1000 uL acrylic well with a poka-yoke exterior profile to fix orientation
Aluminum fixture Fabricated in house HTD_STG_1 Base fixture with an oil well that holds the acylic fixture and includes two flat pads adjacent to the oil well for the heating elements 
Brain Total Lipid Extract Avanti 131101C-100mg 25 mg/mL porcine lipid extract 
Compact DAQ Chassis (cDAQ) National Instruments  cDAQ-9174  Chassis to house multiple types of sensor measurement or output modules
Data Acquisition System (DAQ) Molecular Devices  Digidata 1440A  High resolution analog to digital converter
Fixed gain amplifier/power supply Hewlitt Packard HP 6826A Amplifies DC voltage output from the voltage output module
Glass Cover Slip Corning CLS284525 Seals bottom of aluminum base and allows for optical characterization of the bilayer
Heating element (x2) Omega KHLV-101/5 25 mm x 25 mm polymide film kapton heating element with a 5 watt power limit. 
M3 Stainless Steel Screw McMaster Carr 90116A150 Secures thermocouple to aluminum fixture
Patch clamp amplifier Molecular Devices  AxoPatch 200B  Measures current and outputs voltage to the headstage
Personal computer Any Computer with mulitiple high speed usb ports and a minimum of 6 Gb of ram
Potassium Chloride Sigma Aldrich P3911 Electrolyte solution of dissociated ions
Temperature input module National Instruments  NI 9211 Enables open and cold junction thermocouple measurements for the cDAQ chassis
Thermocouple Omega JMTSS-020U-6  U-type thermocouple with a diameter of 0.02 inches and 6 inches in length
UV Curable Adhesive Loctite 19739 Secures glass coverslip to aluminum base fixture
Voltage output module National Instruments  NI 9263 Analog voltage output module for use with the cDAQ chassis
Waveform generator Agilent 33210A  Used to output a 10 mV 10 Hz sinusoidal waveform
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Ringley, J. D., Sarles, S. A. Temperature-Controlled Assembly and Characterization of a Droplet Interface Bilayer. J. Vis. Exp. (170), e62362, doi:10.3791/62362 (2021).
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