该协议详细说明了使用反馈温度控制加热系统来促进脂质单层组件和液滴接口双层形成,用于熔化温度升高的脂质,以及电容测量,以描述膜中温度驱动的变化。
用于组装脂质双层的液滴接口双层 (DIB) 方法 (即, 与其它方法相比,油中脂质涂层水滴之间的 DIB 具有关键益处:DIB 是稳定的,而且通常具有持久性,双层区域可以逆向调整,传单不对称很容易通过液滴成分控制,并且通过相邻的许多液滴可以获得类似组织的双层水滴网络。形成 DIB 需要在液滴表面自发地将脂质组装成高密度脂质单层。虽然这在室温下很容易发生,但足够的单层或稳定的双层纤维不能在类似条件下形成,其熔点高于室温,包括一些细胞脂质提取物。这种行为可能限制了模型膜研究中DIB的组成——或许还有生物学相关性。为了解决这个问题,提出了一个实验方案,以仔细加热油藏托管DIB液滴,并描述温度对脂质膜的影响。具体来说,此协议展示了如何使用反馈环控制的热导电铝夹具和电阻加热元件来规定温度升高,从而改善单层组件和双层形成,用于更广泛的脂质类型。通过测量 DIB 电容的变化,可以量化膜的结构特征以及由双层纤维组成的脂质的温相过渡。该程序有助于评估模型膜中不同温度的生物物理现象,包括确定多成分脂质混合物的有效熔化温度(TM)。因此,这种能力将允许在模型膜中更密切地复制自然相位转换,并鼓励从更广泛的膜成分(包括那些能够更好地捕获其细胞对应体异质性)形成和使用模型膜。
细胞膜是选择性渗透屏障,由数千种脂质类型1、蛋白质、碳水化合物和固醇组成,这些屏障封装和细分所有活细胞。因此,了解其组成如何影响其功能,揭示自然分子和合成分子如何与细胞膜相互作用、粘附、破坏和转移,是生物学、医学、化学、物理学和材料工程领域具有广泛影响的重要研究领域。
这些发现的目的直接受益于经过验证的组装、操纵和研究模型膜的技术,包括从合成或自然产生的脂质中组装的脂质双层,这些双层细胞模仿其细胞对应体的组成、结构和传输特性。近年来,在油脂涂层水滴之间构建平面脂质双层的液滴接口双层(DIB)方法2、3、4受到重视,5、6、7、8、9、10、11、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23,在模型膜形成的其他方法上显示出实用优势:DIB方法操作简单, 不需要复杂的制造或准备(例如, “绘画”)的基板,以支持膜,一贯产生膜与优越寿命长,允许标准电生理学测量,并简化模型膜的形成与不对称的传单成分3。因为双层在液滴之间自发形成,每个液滴都可以在位置和妆容中量身定做, DIB技术也吸引了相当的兴趣,开发细胞启发材料系统,建立在使用刺激反应膜18,24,25,26,27,28,29、平衡分割和运输14、30、31和组织状材料17、23、32、33、34、35、36。
大多数已公布的模型膜实验,包括使用 DIB 的实验,都是在室温下(RT,+20-25 °C)和少量合成脂质(如 DOPC、DPHPC 等)进行的。这种做法限制了可在模型膜中研究的生物物理问题的范围,基于观察,它还可以限制可用于组装DIB的脂质类型。例如,合成脂质,如 DPPC,其熔化温度为 42 °C,不会在 RT37中组装紧密包装的单层或形成 DIB。室温下的DIB形成也被证明是困难的自然提取物,如那些来自哺乳动物(如大脑总脂质提取物,BTLE)38或细菌(如大肠杆菌总脂质提取物,ETLE)37,其中含有许多不同类型的脂质,并来自细胞,居住在高温(37°C)。因此,能够研究不同的成分,为了解生物相关条件下膜介介的过程提供了机会。
提高油的温度可以达到两个目的:它增加单层组件的动力学,并可能导致脂质经历融化过渡,以达到液体紊乱阶段。这两种后果都有助于单层组件39,这是 DIB 的先决条件。除了为双层形成加热外,形成后冷却膜还可用于识别单脂双层38中的热向过渡,包括天然脂质混合物(如BTLE)中难以使用热量测量检测的热向过渡。除了评估脂质的温电性过渡外, 精确改变DIB的温度可用于研究膜结构38 的温度诱发变化,并检查脂质组成和流动性如何影响膜活性物种的动力学(例如,孔隙形成肽和转膜蛋白37),包括哺乳动物和细菌模型膜在生理相关温度(37°C)。
在此,将解释如何组装经过改进的 DIB 油藏并操作反馈温度控制器,以便在高于 RT 的温度下实现单层组件和双层地层的形成。与以前的第40号议定书不同,在油藏DIB的组装和定性的同时,对测量和控制温度所需的仪器进行了整合,其中包括了明确的细节。因此,该过程将使用户能够应用此方法在各种科学环境中在各种温度下形成和研究 DIB。此外,具有代表性的结果为膜结构和离子传输中可能因温度变化而发生的可测量变化类型提供了具体示例。这些技术是许多生物物理研究的重要补充,这些研究可以在DIB中有效设计和执行,包括研究不同膜成分中膜活性物种的动力学。
此处描述的协议为组装和操作用于形成 DIB 的油和液滴的温度提供了组装和操作实验系统的说明。它特别有利于使用温度高于RT的脂质形成DIB。此外,通过精确改变油藏的温度,可以操纵双层温度来研究温度升高对各种膜特性和特征的影响,包括电容、面积、厚度、诱导的温带相变化、膜活性物种的动力学以及双层界面37、38的粘附能量。
<p class="jove_c…The authors have nothing to disclose.
财政支助由国家科学基金会赠款CBET-1752197和空军科学研究办公室赠款FA9550-19-1-0213提供。
25 mm x 40 mm x 1 mm insulative rubber (x2) | Any | Insulates the bottom of the aluminum fixture from the stage of the microscope | |
25 mm x 40 mm x 6 mm insulative rubber (x2) | Any | Protects heating elements from being damaged by the microscope stage clips and insulates the top of the heating elements. | |
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid | Sigma Aldrich | M3183 | Buffering agent for lipid solution |
Acrylic substrate | Fabricated in house | HTD_STG_2 | ~1000 uL acrylic well with a poka-yoke exterior profile to fix orientation |
Aluminum fixture | Fabricated in house | HTD_STG_1 | Base fixture with an oil well that holds the acylic fixture and includes two flat pads adjacent to the oil well for the heating elements |
Brain Total Lipid Extract | Avanti | 131101C-100mg | 25 mg/mL porcine lipid extract |
Compact DAQ Chassis (cDAQ) | National Instruments | cDAQ-9174 | Chassis to house multiple types of sensor measurement or output modules |
Data Acquisition System (DAQ) | Molecular Devices | Digidata 1440A | High resolution analog to digital converter |
Fixed gain amplifier/power supply | Hewlitt Packard | HP 6826A | Amplifies DC voltage output from the voltage output module |
Glass Cover Slip | Corning | CLS284525 | Seals bottom of aluminum base and allows for optical characterization of the bilayer |
Heating element (x2) | Omega | KHLV-101/5 | 25 mm x 25 mm polymide film kapton heating element with a 5 watt power limit. |
M3 Stainless Steel Screw | McMaster Carr | 90116A150 | Secures thermocouple to aluminum fixture |
Patch clamp amplifier | Molecular Devices | AxoPatch 200B | Measures current and outputs voltage to the headstage |
Personal computer | Any | Computer with mulitiple high speed usb ports and a minimum of 6 Gb of ram | |
Potassium Chloride | Sigma Aldrich | P3911 | Electrolyte solution of dissociated ions |
Temperature input module | National Instruments | NI 9211 | Enables open and cold junction thermocouple measurements for the cDAQ chassis |
Thermocouple | Omega | JMTSS-020U-6 | U-type thermocouple with a diameter of 0.02 inches and 6 inches in length |
UV Curable Adhesive | Loctite | 19739 | Secures glass coverslip to aluminum base fixture |
Voltage output module | National Instruments | NI 9263 | Analog voltage output module for use with the cDAQ chassis |
Waveform generator | Agilent | 33210A | Used to output a 10 mV 10 Hz sinusoidal waveform |