Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Temperaturkontrollert montering og karakterisering av et dråpegrensesnitt Bilayer

Published: April 19, 2021 doi: 10.3791/62362
Automatic Translation
1, 1
1Department of Mechanical, Aerospace and Biomedical Engineering, University of Tennessee

Summary

Denne protokollen beskriver bruken av et feedback temperaturkontrollert varmesystem for å fremme lipid monolayer montering og dråpe grensesnitt bilayer formasjon for lipider med forhøyede smeltetemperaturer, og kapasitansmålinger for å karakterisere temperaturdrevne endringer i membranen.

Abstract

Dråpegrensesnittet bilayer (DIB) metode for montering av lipid bilayers (dvs. DIBs) mellom lipidbelagte vandige dråper i olje gir viktige fordeler i forhold til andre metoder: DIBer er stabile og ofte langvarige, bilayerområdet kan justeres reversibelt, brosjyreasymmetri kontrolleres lett via dråpesammensetninger, og vevslignende nettverk av bilayers kan oppnås ved å tilstøte mange dråper. Forming av DIBer krever spontan montering av lipider i lipidmonolayers med høy tetthet på overflatene av dråpene. Selv om dette skjer lett ved romtemperatur for vanlige syntetiske lipider, klarer ikke en tilstrekkelig monolayer eller stabil bilayer å danne seg under lignende forhold for lipider med smeltepunkter over romtemperatur, inkludert noen cellulære lipidekstrakter. Denne atferden har sannsynligvis begrenset sammensetningene – og kanskje den biologiske relevansen – av DIBer i modellmembranstudier. For å løse dette problemet presenteres en eksperimentell protokoll for å forsiktig varme oljereservoaret som er vert for DIB-dråper og karakterisere effekten av temperatur på lipidmembranen. Spesielt viser denne protokollen hvordan du bruker en termisk ledende aluminiumsarmatur og resistive varmeelementer styrt av en tilbakemeldingssløyfe for å foreskrive forhøyede temperaturer, noe som forbedrer monolayermontering og bilayerdannelse for et bredere sett med lipidtyper. Strukturelle egenskaper av membranen, samt de termotrope faseovergangene til lipidene som består av bilayeren, kvantifiseres ved å måle endringene i elektrisk kapasitans av DIB. Sammen kan denne prosedyren bidra til å evaluere biofysiske fenomener i modellmembraner over ulike temperaturer, inkludert å bestemme en effektiv smeltetemperatur (TM) for lipidblandinger med flere komponenter. Denne evnen vil dermed muliggjøre nærmere replikering av naturlige faseoverganger i modellmembraner og oppmuntre til dannelse og bruk av modellmembraner fra en bredere svor av membranbestanddeler, inkludert de som bedre fanger heterogeniteten til sine cellulære kolleger.

Introduction

Cellulære membraner er selektivt gjennomtrengelige barrierer som består av tusenvis av lipidtyper1, proteiner, karbohydrater og steroler som innkapsler og deler opp alle levende celler. Forstå hvordan deres komposisjoner påvirker deres funksjoner og avdekke hvordan naturlige og syntetiske molekyler samhandler med, holder seg til, forstyrrer og omfordeler cellulære membraner, er derfor viktige forskningsområder med vidtrekkende implikasjoner innen biologi, medisin, kjemi, fysikk og materialteknikk.

Disse målene for oppdagelse drar direkte nytte av velprøvde teknikker for montering, manipulering og studier av modellmembraner – inkludert lipid-bilayere samlet fra syntetiske eller naturlig forekommende lipider – som etterligner sammensetningen, strukturen og transportegenskapene til sine cellulære kolleger. I de senere år har dråpegrensesnittet bilayer (DIB) metode2,3,4 for å konstruere en planar lipidbilayer mellom lipidbelagte vanndråper i olje fått betydelig oppmerksomhet5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22,23, og har vist praktiske fordeler i forhold til andre tilnærminger for modellmembrandannelse: DIB-metoden er enkel å utføre, krever ingen sofistikert fabrikasjon eller forberedelse (f.eks. "maleri") av et substrat for å støtte membranen, gir konsekvent membraner med overlegen levetid, muliggjør standard elektrofysiologimålinger, og forenkler dannelsen av modellmembraner med asymmetriske brosjyresammensetninger3. Fordi bilayer dannes spontant mellom dråper og hver dråpe kan skreddersys i posisjon og sminke, DIB-teknikken har også tiltrukket seg betydelig interesse for å utvikle celleinspirerte materialsystemer som bygger på bruk av stimuli-responsive membraner18,24,25,26,27,28,29, balansert oppdeling og transport14,30,31og vevlignende materialer17,23,32,33,34,35 , 35 , 35 , 35 , 35 , 35 , 35 , 35 , 35 , 35 , 35 , 35 , 35 ,35.

De fleste publiserte eksperimenter på modellmembraner, inkludert de med DIB, har blitt utført ved romtemperatur (RT, ~ 20-25 °C) og med en håndfull syntetiske lipider (f.eks. DOPC, DPhPC, etc.). Denne praksisen begrenser omfanget av biofysiske spørsmål som kan studeres i modellmembraner, og basert på observasjon kan det også begrense hvilke typer lipider som kan brukes til å montere DIB. For eksempel monterer ikke en syntetisk lipid som DPPC, som har en smeltetemperatur på 42 °C, tettpakkede monolagre eller danner DIBer ved RT37. DIB-dannelse ved romtemperatur har også vist seg vanskelig for naturlige ekstrakter, for eksempel de fra pattedyr (f.eks. hjernetotal lipidekstrakt, BTLE)38 eller bakterier (f.eks. Escherichia coli total lipidekstrakt, ETLE)37, som inneholder mange forskjellige typer lipider og stammer fra celler som ligger ved forhøyede temperaturer (37 °C). Å muliggjøre studier av ulike komposisjoner gir dermed muligheter til å forstå membranmediert prosess under biologisk relevante forhold.

Å øke temperaturen på oljen kan tjene to formål: det øker kinetikken til monolayermontering, og det kan føre til at lipider gjennomgår en smeltende overgang for å nå en væskeforstyrrelsesfase. Begge konsekvensene hjelper i monolayer montering39, en forutsetning for en DIB. I tillegg til oppvarming for bilayerdannelse, kan kjøling av membranen etter formasjonen brukes til å identifisere termotrope overganger i enkle lipidbilayers38, inkludert de i naturlige lipidblandinger (f.eks. BTLE) som kan være vanskelig å oppdage ved hjelp av kalorimetri. Bortsett fra å vurdere termotrope overganger av lipider, kan nøyaktig varierende temperaturen på DIB brukes til å studere temperaturinduserte endringer imembranstruktur 38 og undersøke hvordan lipidsammensetning og fluiditet påvirker kinetikken til membranaktive arter (f.eks. poredannende peptider og transmembranproteiner37), inkludert pattedyr og bakterielle modellmembraner ved en fysiologisk relevant temperatur (37 °C).

Heri vil en beskrivelse av hvordan man monterer et modifisert DIB-oljereservoar og bruker en feedback-temperaturregulator for å muliggjøre monolayermontering og bilayerdannelse ved temperaturer høyere enn RT forklares. Skiller seg fra en tidligere protokoll40, er eksplisitt detalj inkludert om integrering av instrumentering som trengs for å måle og kontrollere temperaturen parallelt med montering og karakterisering av DIB i oljebeholderen. Prosedyren vil dermed gjøre det mulig for en bruker å anvende denne metoden for å danne og studere DIBer på tvers av en rekke temperaturer i en rekke vitenskapelige sammenhenger. Videre gir de representative resultatene konkrete eksempler på hvilke typer målbare endringer i både membranstruktur og iontransport som kan oppstå etter hvert som temperaturen varierer. Disse teknikkene er viktige tillegg til de mange biofysiske studiene som kan utformes og utføres effektivt i DIBer, inkludert å studere kinetikken til membranaktive arter i forskjellige membransammensetninger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Klargjøring av oppvarmet armatur

  1. Samle 2 stykker av 1 mm tykk isolasjonsgummi trimmet til henholdsvis 25 mm x 40 mm i bredde og lengde, 2 deler av en 6 mm tykk gummi som også er 25 mm x 40 mm, en forberedt aluminiumsbasearmaturmontering og et akryloljereservoar som passer i visningsvinduet til aluminiumsbasearmaturen (se figur S1, S2 og S3 for detaljer om fabrikasjon og en eksplodert visning av montering). Forbered aluminiumsarmaturen først ved å feste til bunnen av armaturen et glassdekslerlip visningsvindu med UV-herdbart lim og feste 1 resistivt varmeelement til toppen av hver 25 mm x 25 mm sideflens av armaturen.
  2. Plasser de tynnere gummistykkene på mikroskopets stadium slik at den lange kanten på hvert stykke er tangensielt til sceneåpningen som vist i (Figur 1).
  3. Plasser aluminiumsbasearmaturen på toppen av de isolerende putene med visningsvinduet til armaturen sentrert over objektivlinsen. Riktig justering er nødvendig for å avbilde de tilkoblede dråpene.
  4. Plasser et tykkere stykke gummi på toppen av hvert resistivt varmeelement og bruk et mikroskoptrinnklemme for å holde det på plass. Disse delene beskytter varmeelementene mot skader forårsaket av sceneklemmene og isolerer mot utilsiktet elektrisk kortslutning mellom varmeelementene og både aluminiumsarmaturen og mikroskopstadiet.
  5. Bøy forsiktig måleenden av en termokobling for å oppnå en 90° vinkel ved ~ 4 mm fra enden.
  6. Sett den bøyde spissen av termoelementet inn i nedre venstre hjørne av aluminiumsarmaturen og fest den forsiktig med låseskruen.
  7. Plasser akrylbeholderen i brønnen på aluminiumsarmaturen. Dette gjøres før du tilsetter heksadekan olje til brønnen (trinn 1.8) av aluminiumsarmaturen for å minimere risikoen for å fange luftbobler mellom visningsvinduet og bunnen av akrylbeholderen, noe som kan hindre visningen av dråpene.
    MERK: Olje som tilsettes visningsrommet på aluminiumsarmaturen brukes til å matche brytningsindeksene til akryl og glass for klarere bildebehandling av dråpene i akrylbeholderen. Dermed er det verdt å merke seg at olje i brønnen til aluminiumsarmaturen ikke kontakter innholdet i akrylbeholderen, og streng rengjøring av aluminiumsarmaturen er ikke nødvendig.
  8. Dispenser ~ 1000 μL heksadekanolje i brønnen av aluminiumsarmatur (dvs. mellom veggene i akrylbeholderen og aluminiumsarmaturen), og pass på at du ikke overfyller. Oljenivået i brønnen på aluminiumsarmaturen skal være så høyt som tillatt for å maksimere overflatearealet for varmeoverføring, samtidig som oljen ikke kan søle over kantene på armaturen på mikroskopstadiet eller objektivlinsen.
  9. Dispenser ~1000 μL heksadekanolje inn i akrylbeholderen, mens du forblir oppmerksom på ikke å overfylle.
    MERK: Akrylbeholderen skal alltid rengjøres grundig mellom eksperimenter. Brukeren må bruke et regiment som består av påfølgende skyllinger med etylalkohol og deionisert vann etterfulgt av tørking i en tørkeskål i over 12 timer.

Figure 1
Figur 1: Oppvarmet scenemontering. Bilder viser monteringen av den termisk ledende armaturen og oljereservoaret for DIB-dannelse; tall under hvert bilde identifiserer det tilsvarende trinnet i protokollen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

2. Instrumentering for samtidig tilbakekoblingstemperaturkontroll og elektrisk karakterisering av en DIB

MERK: Denne protokollen integrerer følgende instrumenter for å muliggjøre tilbakemeldingstemperaturkontroll og samtidig elektrisk karakterisering av en DIB: en personlig datamaskin (PC) med to tilgjengelige USB-tilkoblinger (Universal Serial Bus), en patchklemmeforsterker sammenkoblet med et dedikert datainnsamlingssystem (DAQ-1), en bølgeformgenerator, en annen programmerbar DAQ (DAQ-2) med spenningsutgang og temperaturinngangsmoduler, og en strømforsyning / forsterker. Følgende trinn beskriver de nødvendige tilkoblingene til disse instrumentene (som illustrert i figur 2a) som er nødvendige for å isolere måling og kontroll av temperatur fra samtidig elektrofysiologi av en DIB. Erstatninger for tilsvarende instrumenter kan gjøres etter behov.

  1. Opprett utgangs- og inngangstilkoblinger til DAQ-2-modulene.
    1. Velg to par skrueterminaler på spenningsutgangsmodulen for differensialspenningstilkoblinger og fest ledningsledninger til disse stedene. Oddetallsterminaler er vanlige bakketilkoblinger, og partallsterminalene er ugrunnede utganger, som vist i (Figur 2c). Koble hvert av disse to parene med ledninger til separate skrueterminal-BNC-adaptere, og koble deretter hver adapter til en separat BNC-kabel som brukes til å rute spenningssignaler til andre instrumenter.
      MERK: I dette oppsettet er differensialtilkoblinger på klemme 0 og 1 tilordnet temperaturkontrollutgangen til effektforsterkeren, mens et annet par tilkoblinger på klemme 6 og 7 er beregnet for spenningsutgang som skal sendes til dråpene via patchklemmeforsterkeren.
    2. Med henvisning til (Figur 2c) velger du ett sett med termokoblingsklemmer (f.eks. klemme 2 og 3 er angitt som TC1-paret) på termokoblingsinngangsmodulen og kobler til termokoblingsledningene.

Figure 2
Figur 2: Tilkoblinger til systemledninger. Et skjema av enhetene og ledningene som kreves for systemet, vises i (a), mens en detaljert titt på DAQ-2-tilkoblingene leveres i (b). Illustrasjonen i (c) viser vandige dråper på hydrogelbelagte elektroder nedsenket i olje for DIB-dannelse. De to elektrodene er koblet til henholdsvis jordede og ujordede (V+) tilkoblinger på hodelyktenheten til patchklemmeforsterkeren. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

  1. Etter at elektriske tilkoblinger til DAQ-2-modulene er gjort, kobler du DAQ-2-kabinettet til en PC via en USB-tilkobling og kobler til en elektrisk strømkilde. Bekreft deretter vellykket driver- og programvareinstallasjon før bruk med kommersiell programvare.
  2. Konfigurer og koble til en effektforsterker mellom DAQ-2 og resistive varmeelementer.
    1. Konfigurer forsterkeren til å fungere i forsterkningsmodus med fast forsterkning med en forsterkning på 10X.
    2. Bruk en banankontakt-BNC-adapter til å koble BNC-kabelen fra klemme 0 og 1 på spenningsutgangsmodulen (figur 2b) til inngangstilkoblingene på strømforsterkeren.
    3. Bruk ekstra BNC-adaptere og kabler, koble utgangsterminalene til strømforsterkeren til begge settene med varmeelementer, som er koblet parallelt med hverandre og forsterkeren for å sikre at begge elementene opprettholder samme spenningsfall under bruk.
  3. Etablere nødvendige forbindelser for elektrofysiologiutstyret.
    1. Koble en BNC-kabel fra klemme 6 og 7 på spenningsutgangsmodulen (Figur 2b) til BNC-kontaktene for bakre svitsjede eksterne kommandoer på baksiden av patchklemmeforsterkeren.
    2. Koble til en annen BNC-kabel mellom utgangen av bølgeformgeneratoren og frontbryterens eksterne kommandotilkobling på baksiden av patchklemmeforsterkeren.
      MERK: Disse to tilkoblingene gir alternative metoder for å generere spenningsbølgeformer som påføres dråpeelektrodene via patchklemmeforsterkeren. Bølgeformgeneratoren er spesielt nyttig for å generere trekantede bølgeformspenninger som brukes til å måle membran kapasitans. Brukeren kan bestemme hvilke, om noen av dem, som er nødvendige for sitt eget program.
    3. Med en tredje BNC-kabel kobler du utgangen til den målte strømmen på frontpanelet på patchklemmeforsterkeren til en tilgjengelig analog inngangs-BNC-kontakt foran på DAQ-1.
    4. Med en fjerde BNC-kabel kobler du utgangen av målt membranspenning (på baksiden av patchklemmeforsterkeren) til en separat analog inngangskontakt på DAQ-1. Dette muliggjør digitalisering av spenningen som påføres over elektrodene.
    5. Når de to dråpeelektrodene er klargjort og støttet på mikromanipulatorer som beskrevet i trinn 7-9 i ref.40, kobler du elektrodens ledninger til patchklemmens hodestøtte, som er festet via kabel til patchklemmeforsterkeren.
      MERK: Headstage-rollen er å kontrollere spenningen mellom elektrodene og måle den resulterende strømmen, som omdannes til en proporsjonal spenning som får utgang av patchklemmeforsterkeren til DAQ-1.
    6. Koble DAQ-1 til en PC via en USB-tilkobling og koble de tilsvarende strømforsyningskablene til både patchklemmeforsterkeren og DAQ-1.
  4. Strøm på alt måleutstyr.
    MERK: Kanskje den viktigste detaljen i dette oppsettet er å sikre at effektforsterkerutgangen (mA-A) er elektrisk isolert fra hodelyktenheten til patchklemmeforsterkeren, som bruker en sensitiv krets for å måle pA-nA-nivåstrømmer i en DIB.

3. Tilbakemelding temperaturkontroll av dråpegrensesnitt bilayers

MERK: Følgende trinn for bruk av tilbakemeldingstemperaturkontrollsystemet er basert på et tilpasset grafisk brukergrensesnitt (GUI) som er opprettet for implementering av proporsjonal-integrert (PI) feedback temperaturkontroll40,41 (se Tilleggskodingsfiler). Andre programvare- og kontrollalgoritmer kan brukes i stedet. En kopi av dette programmet er gitt til leseren med tilleggsinformasjonen for papiret, men brukeren er ansvarlig for å konfigurere den for eget utstyr og behov.

  1. Start DAQ-2-programvaren på PC-en og åpne filen for temperaturkontrollprogrammet. Når GUI åpnes, åpner du programmet igjen ved å klikke på mappeikonet nederst til venstre i GUI og velge temperaturkontrollprogrammet (Figur 3).
  2. Angi riktige numeriske verdier for den proporsjonale kontrollforsterkningen (KP) og integrert kontrollforsterkning (KI).
    MERK: KP- og KI-verdier på henholdsvis 0,598 og 0,00445 ble funnet å fungere godt i oppsettet. Disse verdiene ble bestemt gjennom simulering ved hjelp av en systemmodell som inneholder parametere hentet fra målte åpne varmeresponser (se figur 4). Under åpen sløyfeoppvarminger den foreskrevne varmeeffekten uavhengig av den målte temperaturen. I motsetning til dette består lukket sløyfeoppvarming av kontinuerlig justering av den påførte kraften til varmeovnene på en måte som bidrar til å drive den målte temperaturen nærmere ønsket temperatur. Dette oppnås heri ved hjelp av en PI-kontrollordning.
  3. For å teste temperaturkontrollskjemaet, angi ønsket innstilt punkttemperatur (over romtemperatur) og slå deretter på tilbakekoblingstemperaturkontrollen i GUI. Vær oppmerksom på det målte temperatursignalet under tilbakekoblingskontrollen (lukket sløyfe), som vises i gui i de neste minuttene. Hvis den målte temperaturen på oljen i stor grad overskygger ønsket temperatur, reagerer for sakte på endringer eller ikke konvergerer til ønsket settpunkt, må brukeren justere kontrollforsterkningene for å oppnå ønsket lukket sløyfeytelse.
    MERK: Programmet definerer en metningsgrense for kraften (og dermed spenningen) som leveres til de resistive varmeelementene. For eksempel bruker to elementer som rapporteres her, opptil 5 W strøm hver. Å koble dem parallelt betyr at det totale strømforbruket ikke skal overstige 10 W. Brukeren anbefales å vurdere den maksimale mengden strøm som skal leveres til enhetene og vite at denne grensen kan påvirke hastigheten som det lukkede sløyfesystemet vil reagere på ønskede temperaturendringer. Høyere varmeelementer gir raskere oppvarming og høyere innstilte punkttemperaturer, men krever høyere tilførte strømmer for oppvarming.
  4. Når systemet er innstilt på akseptabel ytelse med lukket sløyfe, angir du ønsket oljetemperatur for DIB-dannelse som innstilt punkt i GUI.
    MERK: For eksempel ga en innstilt punkttemperatur på 60 °C gode resultater i eksperimenter med BTLE-liposomer i de vandige dråpene37. Brukeren henvises andre steder2,40 for protokoller som forklarer DIB-montering mellom dråper som henger på trådtypeelektroder og konfigurasjon av elektrofysiologiutstyr ved hjelp av patchklemmeforsterkeren, DAQ-1 og elektrofysiologimålingsprogramvaren. Nærmere bestemt kan protokollen fra Najem, et al.40 følges nøye frem til trinn 13. Utover dette trinnet brukes en litt annen tilnærming for vellykket monolayer- og bilayerformasjon ved bruk av lipider som krever oppvarming for å fremme monolayer- eller bilayerformasjon.
  5. Senk spissene på sølv/sølvklorid (Ag/AgCl)-elektrodene ned i oljen til de nesten berører bunnen av akrylbeholderen. Denne plasseringen av elektrodespissene er avgjørende for å holde dråpen på elektroden i oppvarmet olje, der konvektive strømmer i oljen er observert for å løsne dråper fra hydrogelbelagte elektroder (Figur 2c).
  6. Pipette en 250 nL dråpe vandig lipidoppløsning som inneholder 2 mg/ml BTLE, 100 mM kaliumklorid (KCl) og 10 mM 3-(N-morpholino) propansulfonsyre (MOPS) på hver elektrodespiss og la dem inkubere i den oppvarmede oljen i minst 10 minutter for å fremme monolayerdannelse.
  7. Dekk headstage og oppvarmet scenearmatur med et jordet Faraday-bur.
  8. Ta dråpene i forsiktig kontakt ved å sakte
    manipulere elektrodenes horisontale posisjoner til brukeren ser dråpene deformere fra kontakt eller begynne å fortrenge hverandre og vente noen minutter til bilayerformasjonen begynner. Hvis en bilayer etter flere minutter ikke har dannet seg, kan dråpene tvinges sammen mer for å lette bilayerformasjonen. Dannelsen av en tynnet interfacial bilayer kan bekreftes gjennom visuell inspeksjon (Figur 5a) eller ved å måle økningen i amplituden til en firkantet bølgeformet kapasitiv strøm indusert av en bølgeformgenerator som gir en 10 mV, 10 Hz trekantet spenning22. La bilayeren likevekte i minst 10 minutter for å nå et jevnt mellomfacialt område, ved innledende dannelse og før etterfølgende karakterisering ved det første angitte punktet.
    MERK: Oljetypen kan ha en betydelig innvirkning på bilayertynning, membrantykkelse og kontaktvinkel mellom dråper. Generelt, jo mindre oljemolekylet er, desto lettere kan det forbli i den hydrofobe kjernen av bilayeren okkupert av lipidakylkjeder. Oljeretensjon øker både monolayer- og bilayerspenninger og tykkelse og reduserer området og kontaktvinkelen mellom dråper. Disse beregningene indikerer en svakere adhesjonstilstand. Større, større molekyler utøver motsatt effekt. For eksempel er squalene et større molekyl enn alkaner som heksadekanin, noe som gjør at det lett kan utelukkes fra mellom monolayers under bilayer tynning. Som sådan er DIBer dannet i squalene tynnere, de viser høyere kontaktområder og vinkler, og de viser høyere frie energier avformasjon 22,42 (et mål på dråpedråpeadhesjon).

4. Karakterisering av temperaturavhengig atferd i DIBer

MERK: Mange fysiske prosesser kan studeres i DIB-baserte modellmembraner, inkludert hvordan temperaturendringer påvirker membranens struktur og transportegenskaper. Følgende trinn bør utføres etter vellykket bilayerformasjon ved ønsket temperatur.

  1. Mål den nominelle kapasitansen av membranen mens du senker temperaturen på oljebadet fra et settpunkt som tillater bilayerdannelse å identifisere termotrope faseoverganger av lipidene i membranen38.
    1. Høyreklikk på temperaturgrafen på GUI og fjern de viste dataene. Dette sikrer at det er nok plass i bufferen til senere innspillinger.
    2. Bruk en trekantet spenningsbølgeform (f.eks. 10 mV, 10 Hz) på tvers av DIB-elektrodene ved hjelp av bølgeformgeneratoren som er koblet til patch-klemmeforsterkeren, og registrer den induserte strømresponsen gjennom bilayeren.
    3. Avkjøl bilayeren ved å redusere den innstilte punkttemperaturen i trinn på 5 °C og vent minst 5 minutter ved den nye steady state-temperaturen mellom temperaturendringer til ønsket temperatur oppnås. Alternativt kan du prøve å kjøle ned bilayeren passivt ved å slå av tilbakemeldingskontrollsystemet. Vær imidlertid oppmerksom på at eksperimenter som implementerte passiv kjøling fra 50-60 °C resulterte i høyere kullscens.
    4. Etter at oljebadet og bilayeren er avkjølt til ønsket minimumstemperatur, høyreklikker du på temperaturgrafen i GUI igjen og eksporterer temperaturdataene kontra tid til en regnearkprogramvare. Stopp gjeldende innspilling.
    5. Fra den målte strømmen beregner du den nominelle kapasitansen til den firkantede bølgestrømresponsen kontra tiden i avkjølingsperioden.
    6. Plott nominell kapasitans (C) versus temperatur (T) for å observere hvordan membran kapasitans endret seg. Finn ikke-harmoniske endringer i C kontra T for å identifisere TM.
      MERK: Nominell kapasitans kan beregnes ut fra amplituden til kvadratbølgestrømmen43 (| Jeg |) bruke relasjonen | Jeg | = C dv/dt, der dv/dt er lik fire ganger produktet av spenningsamplituden (| V|) frekvensen (f) av den påførte trekantede spenningen. Fra disse ligningene | C = Jeg |/(4| V|f).
  2. På samme måte kan du vurdere den kvasistatiske spesifikke kapasitansen (Cm) til bilayeren ved faste temperaturer ved å øke temperaturen på oljebadet og bilayerområdet.
    1. Endre den innstilte punkttemperaturen i trinn på 10 °C ved hjelp av GUI og la systemet likevekte til den nye temperaturen.
      1. Utfør trinn 4.1.2 for å starte målingen av kapasitiv strøm og opptak.
      2. Endre bilayerområdet ved å justere elektrodenes posisjoner nøye ved hjelp av mikromanipulatorene (dvs. separering av elektrodene reduserer bilayerområdet). Gjør det mulig for kvadratbølgestrømmen å nå en steady state-amplitude og samle bilder av DIB for å muliggjøre beregning av membranområde kontra tid ved å bruke et kamera montert på mikroskopet for å avbilde bilayeren sett fra åpningen av mikroskopstadiet. Legg samtidig til en digital kode i gjeldende innspillingsprogramvare for å markere det tilsvarende tidspunktet for bildesamling.
        MERK: Mikromanipulatorer gir presis kontroll av elektrodene og dermed skånsom kontakt mellom dråper. Grov manipulering av dråpene kan føre til et mislykket eksperiment ved koalescens av dråpene eller ved å få en dråpe til å falle av elektroden. Som beskrevet andre steder22,beregnes bilayerområdet ut fra kontaktlengden mellom slippverktøy, som vises som overlappende sirkler i et bilde i nederste visning. Posisjonene og dimensjonene til dråpene, og lengden på kontaktlinjen, kan beregnes ved hjelp av en bildebehandlingsprogramvare eller med andre vitenskapelige programmeringsverktøy.
      3. Gjenta trinn 4.2.1.2 minst 4 ganger for å få totalt 5 DIB-bilder og steady-state-regioner med bilayerstrøm.
    2. Gjenta trinn 4.2.1 ved ønsket temperatur.
    3. På de taggede tidspunktene som tilsvarer steady-state bilayer-områder for oppkjøpte bilder, analyserer du gjeldende opptak og DIB-bilder for å trekke ut C- og A-data for hver temperatur.
    4. Plott C kontra A-data for hver temperatur og beregner hellingen av en førsteordens regresjon, som representerer Cm av bilayeren ved hver temperatur22.
    5. Plottverdiene for Cm hentet fra trinn 4.2.4 versus T.
    6. Undersøk dataene Cm versus T for ikke-monotone variasjoner for å identifisere smeltetemperaturer, TM.
  3. Vurder dynamikken i spenningsavhengig ionkanaldannelse ved å generere en dc spenningstrinninngang over bilayeren.
    1. Still inn startspenningen til ønsket trinnverdi i mV (f.eks. 100 mV).
    2. Sett Endelig spenning og Trinnstørrelse til en verdi som er høyere enn ønsket trinn (f.eks. 110 mV sluttspenning og 110 mV trinnstørrelse).
    3. Angi ønsket varighetstid for trinninngangen i sekunder (f.eks. 90 s).
    4. Velg ønsket polaritet for trinninngangen (f.eks. positiv).
    5. Bytt patchklemmeforsterkeren for å sende kommandospenningen som kommer fra GUI/spenningsutgangsmodulen, til hodespennet.
    6. Start gjeldende innspillinger.
    7. Slå på spenningen og registrer den induserte strømresponsen, som skal vise en S-formet respons på en kritisk spenning (f.eks. ~70 mV for 1 μg/ml Mz i 2 mg/ml BTLE).
  4. Separat kan dynamiske strømspenningsforhold for en membran oppnås ved ønskede temperaturer for å avsløre spenningsavhengige forhold, for eksempel ionkanaloppførsel.
    1. Bytt patchklemmeforsterkeren for å sende kommandospenningen som stammer fra bølgeformgeneratoren, til å sende kommandospenningen fra bølgeformgeneratoren og starte strømopptak.
    2. På bølgeformgeneratoren sender du ut en kontinuerlig sinusformet bølgeform med ønsket amplitude, offset og frekvens.
    3. Registrer det induserte gjeldende svaret på tvers av én eller flere sykluser.
    4. Gjenta etter ønske for forskjellige sinusbølgeamplituder og frekvenser og temperaturer.

Figure 3
Figur 3: Gui for temperaturkontroll. Denne figuren fremhever og merker de kritiske trinnene som kreves for å bruke programmets GUI for å kontrollere temperaturen på oljebadet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 viser hvordan aluminiumsarmaturen og akryloljereservoaret fremstilles på mikroskopstadiet for DIB-dannelse. Monteringstrinn 1.2-1.4 tjener til å isolere armaturen termisk fra scenen for mer effektiv oppvarming. Trinn 1.5-1.7 viser hvordan du fester termoelementet riktig til armaturen og plasserer oljebeholderen, og trinn 1,8 -1,9 viser anbefalte steder for dispensering av olje i disse stykkene.

Figur 2 skisserer komponentene som brukes til å etablere temperaturkontroll for feedback og utføre elektriske målinger på en DIB: en PC, en strømforsterker med fast forsterkning, en patchklemmeforsterker og et DAQ-system (eller tilsvarende instrument for påføring av spennings- og måle-pA-nA-nivåstrømmer), en andre DAQ med passende analoge innganger og utganger, en bølgeformgenerator og montert aluminiumsarmatur med vedlagte resistive varmeovner. DAQ-2 bruker to moduler (figur 2b). En 4-kanals, ±10 V, 16-biters analog spenningsutgangsmodul brukes til å starte de uavhengige spenningene som leveres til inngangen til strømforsterkeren (blå tilkobling i figur 2a) og en ekstern kommandoinngang på patchklemmeforsterkeren (grønn tilkobling). Spenningsutgangsmodulen er begrenset av en maksimal utgangsstrøm på 46 mA og en maksimal utgangsspenning på 10 V, mens hvert varmeelement som brukes her, bruker så mye som 5 W strøm (~ 180 mA maks) ved en maksimal spenning på 28 V. Av denne grunn ble strømforsyningen / forsterkeren inkludert for å forsterke utgangsspenningen og supplere den medfølgende strømmen som trengs for å drive varmeelementene (kablet parallelt) festet til aluminiumsarmaturen. En 4-kanals, 24-biters termokoblingsenhet brukes til å digitalisere temperaturmålinger fra oljebeholderen nær DIB (gul tilkobling). Siden termoelementets inngangsenhetsmodul tillater opptil 4 termokoblinger, kan brukeren vurdere å overvåke temperaturer andre steder i armaturen. Hvis det er gjort, må de også vurdere hvilket signal eller kombinasjon av signaler som brukes til sammenligning med ønsket innstilt punkttemperatur i tilbakemeldingssløyfen.

Disse utgangene og målte signaler styres via to programvare: 1) det tilpassede GUI for temperaturkontroll; og 2) programvare for elektrofysiologimåling. Figur 3 viser et skjermbilde av brukergrensesnittet og inkluderer merknader til tilsvarende trinn i protokollen. GUI brukes til å definere nøkkelparametere (Still inn punkttemperatur, PI-kontrollgevinster, spenningsgrenser), sammenlign den målte temperaturen med den innstilte punkttemperaturen og beregn kontrollsignalet som leveres til forsterkeren og deretter varmeelementene, og registrer data om temperaturen og påført spenning kontra tid. Dette programmet inkluderer også muligheten til å kommandere spenningen som påføres DIB-elektroder (Figur 2c) via patchklemmeforsterkeren. Separat brukes måleprogramvare til å konfigurere målinger av både spenningen som påføres DIB-elektrodene og den induserte strømmen gjennom lipid-bilayeren. En spenning proporsjonal med DIB-strømmen sendes ut av patchklemmeforsterkeren og sendes via BNC-kabel til DAQ-1 (tilkobling ikke vist).

Figur 4 tegner temperaturendringen og absolutt elektrisk kraft som sendes til varmeovnene kontra tid under både åpen sløyfe og lukkede varmescenarioer. For førstnevnte ble en vilkårlig inngangsspenning som tilsvarer ~ 5,2 W strøm påført varmeovnene, noe som resulterte i en eksponentiell temperaturøkning med en tidskonstant på ~ 125 s og en steady state ΔT ≈ 4,5 ° C / W etter en innledende forsinkelse på ~ 20 s. Disse egenskapene til open-loop-systemet ble brukt til å konstruere en modell av lukket sløyfe-systemet i en simuleringsprogramvare (se figur S4 for detaljer) som kan brukes til å bestemme verdier for proporsjonale og integrerte kontrollgevinster. De lukkede og simulerte modellresponsene i figur 4 representerer dermed de målte og simulerte svarene til den innstilte PI-kontrolleren, med KP- og KI-verdier på henholdsvis 0,598 og 0,00445, til en innstilt punkttemperatur 20 °C høyere enn RT. Sammenlignet med åpen sløyfe-saken bekrefter både simuleringen og målingene den økte responshastigheten i lukket sløyfesystem (tidskonstant ~ 63 s). Reduksjonen i oppvarmingstiden kommer på bekostning av høyere innledende kraft. Likevel forble ønsket innstilt punkttemperatur og den målte oljetemperaturen innenfor 0,6 °C ved steady state, som ble ansett som egnet for bruk. Total levert strøm er begrenset i programmet under lukket sløyfekontroll for ikke å formørke den totale strømgrensen på 10 W for de to varmeovnene.

Temperaturkontrollsystemet ble brukt til å vise frem temperaturavhengigheten av løsningsmiddel i en DIB dannet av BTLE-lipider og dens innvirkning på membrankaasitansen (figur 5). BTLE lipider ble valgt for denne målingen fordi oppvarming er nødvendig for DIB-dannelse på grunn av en lipidfaseovergang som oppstår mellom 35-42 °C38. Protokollen som er beskrevet her, ble utført for å initiere bilayerformasjon ved 60 °C. Etter membrandannelse og likevekt kan temperaturen senkes eller heves etter behov for å karakterisere membranens respons. Figur 5a viser for eksempel representative målinger av rå kapasitiv strøm (firkantet bølgeform) og temperatur kontra tid under en oppvarmingssyklus fra RT til ~60 °C. Vær oppmerksom på at amplituden til den kapasitive strømbølgeformen reduseres med mer enn halvparten når temperaturen stiger, noe som skyldes opptak av olje i membranens hydrofobe kjerne. Denne endringen gjør grensesnittet tykkere og endrer sidespenningen til bilayer22,37,38.

Dataene i figur 5b-dokumentet endres i C (normalisert ved kapasitans ved 27 °C) versus T over en komplett kjølevarmesyklus etter første bilayerformasjon ved 60 °C. Akkurat som i figur 5a, når temperaturen stiger, faller kapasitansen. Men det denne presentasjonen viser tydeligere er de ikke-demoniske endringene som oppstår ved temperaturer mellom ~ 30-42 °C, som representerer den kollektive smeltetemperaturen, TM, der lipidblandingen går mellom en væskebestilt og en væskeforstyrrelsert termotropisk fase. Temperaturen der den ikke-harmonitoniske endringen i kapasitans oppstår, tilsvarer en endring i bilayertykkelsen fra utelukkelse av olje fra membranen38. Vær også oppmerksom på at hysteresen som vises mellom varmesyklusen og kjølesyklusen skyldes irreversible endringer i bilayerområdet som oppstår mellom etterfølgende sykluser, som vanligvis ble utført 10 min fra hverandre.

På samme måte viser figur 6a,b hvordan kvasistatiske målinger av Cm ved forskjellige temperaturer kan brukes til å identifisere TM. Her er membranens område variert suksessivt ved å øke avstanden mellom dråpeelektrodene manuelt. Under dette eksperimentet skyves dråpene først sammen for å fremme maksimalt membranområde før etterfølgende reduksjoner i kontaktområdet med trinnvise separasjoner mellom elektrodene. På hvert kontaktnivå vurderes den nominelle kapasitansen til bilayeren fra den induserte strømmen, og området bestemmes gjennom bildeanalyse. Plotting C kontra A gir mulighet for en lineær regresjon, der stigningstallet representerer verdien av Cm som vist i figur 6a. Hvis du gjentar denne prosedyren over flere temperaturer (Figur 6b) viser at Cm reduseres med nesten 50 % ved temperaturer over TM, noe som bekrefter en økning i membranens hydrofobe tykkelse på grunn av oppvarmingsindusert heksadekanisk opptak (se figur S5 for fullstendig C versus A-data). Ved høyere temperaturer reduserer det ekstra løsningsmidlet i membranen også det maksimale kontaktområdet mellom dråpene, og dermed maksimal nominell kapasitans. Redusere temperaturen reverserer disse effektene. DIB-bildet i figur 6c viser at når temperaturen (25 °C) er godt under TM, kan membranen stabilt vedta en svært selvklebende tilstand- selv under spenningen av strakte dråper forårsaket av godt separerte elektroder. Dette er resultatet av fullstendig utelukkelse av heksadekanin fra bilayeren, noe som øker vedheftsenergien til dråpene. I denne tilstanden kan ikke bilayerområdet endres pålitelig gjennom manipulering av elektrodene og hindrer evnen til å måle spesifikk kapasitans nøyaktig (se figur S5 for mer informasjon).

Til slutt viser de representative dataene i figur 7 hvordan temperaturendringer kan påvirke oppførselen til poredannende arter som skaper ionledende kanaler gjennom en DIB. Monazomycin (Mz), et positivt ladet antibiotika som danner kation selektive kanaler gjennom bilayer ved tilstrekkelig transmembrane potensialer37,44, ble valgt for å demonstrere dette forholdet. Disse målingene ble utført på en BTLE-basert (2 mg/ml sluttkonsentrasjon i begge dråpene) DIB dopet med Mz (1 μg/ml endelig konsentrasjon i begge dråpene). De nåværende versus spenningssporene vist i figur 7a ble oppnådd ved å bruke sinusformede membranspenninger og måle den induserte strømmen ved to forskjellige temperaturer; pilene og påfølgende tall i figur 7a bidrar til å visualisere de påfølgende kvartalene i sinusformet spenning med hensyn til tid. Denne typen måling utføres ofte for å undersøke spenningsavhengigheten til strømmen gjennom ionkanaler. Dataene her viser at å øke temperaturen på DIB fra 27 °C til 45 °C fører til at terskelen for kanaldannelse stiger fra ~|100 mV| til ~|110 mV|. Denne endringen, sannsynligvis drevet av høyere membrantykkelse på grunn av absorbert olje, viser at energibarrieren for innsetting har steget. Hysteresen i disse kurvene - som betyr minnemotstand - kan skyldes spenningsinduserte endringer i enten bilayerområdet eller kinetikken til Mz-kanaldannelse og inaktivering44.

For å bidra til å skille disse faktorene i DIBer, kan forbigående endringer i ionstrøm måles som svar på en DC-trinnspenning. Figur 7b viser den målte strømtettheten for samme Mz-doped BTLE-membran på samme spenningsnivå (+90 mV) og to forskjellige temperaturer (27 °C og 45 °C). Dataene viser tydelig at kinetikken til kanalresponsene er ganske forskjellige. Spesielt ved 27 °C viser membranen en raskere, større økning i strøm som deretter etterfølges av et forbigående forfall (sistnevnte er et resultat av at Mz-kanaler translokaliserer over bilayeren til en inaktiv tilstand44). Responsen er mye mer dempet ved 45 °C, der den S-formede strømstigningen ikke fortsetter med et påfølgende fall. Forskjeller som disse er nyttige for å vurdere kinetikken til kanalresponser og forstå hvordan disse kan bidra til membranens totale dynamiske motstand.

Figure 4
Figur 4: Åpen sløyfe kontra lukket sløyfeoppvarming. Panel (a) sammenligner tidsresponsene for det målte og simulerte (Se SI) lukket sløyfesystem med et +20 °C temperaturtrinn med den åpne varmeresponsen under fast påført effekt. Panel (b) viser strømmen som er forsvinner av hvert system. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Måle kapasitans og varierende temperatur. Den typiske firkantede bølgeformstrømresponsen på en 10 mV, 10 Hz trekantet bølgeforminngang på en BTLE lipidmembran som gjennomgår en faseovergang, vises i (a). Faseovergangen til lipidene kan også ses i områdemålingsdataene som vises over panelet (a). Kapasitans normalisert ved innledende kapasitans ved 27 °C er vist i panelet (b) plottet som en temperaturfunksjon for en varme- og kjølesyklus. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Spesifikke kapasitansmålinger Panel (a) viser nominell kapasitans kontra bilayerområde oppnådd ved påfølgende kontaktområder for to forskjellige temperaturer. Lineære regresjoner til hvert sett brukes til å bestemme deres respektive verdier for CM. Panel (b) plotter CM versus T, mens panelet (c) viser den stabile kapasitive strømbølgeformen (venstre) og kontaktområdet (høyre) under forsøk på dråpeseparasjon ved 25 °C. Klikk her for å vise en større versjon av denne figuren.

Figure 7
Figur 7: Spenningsavhengig membranmotstand og Mz ionkanalkinetikk kontra temperatur. Panel (a)   viser hvordan strømspenningsforholdet endres med temperatur for BTLE-DIBer dannet mellom dråper som inneholder 1 μg/ml Mz. Pilene og tallene representerer de etterfølgende delene av den brukte sinusbølgen. Forskjellene i disse sporene illustrerer hvordan temperaturen skifter spenningsterskelen for Mz-innsetting, som identifiseres som størrelsen på spenningen der den induserte strømmen øker kraftig. På samme måte viser panelet (b) slagtemperaturen på den forbigående strømresponsen forårsaket av en DC-trinnspenning på 90 mV. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur S1: Aluminiumsarmatur. Denne tegningen viser de nødvendige dimensjonene og egenskapene for fabrikasjon av aluminiumsarmaturen som er bunnen av det oppvarmede stadiet. De 25,2 mm X 26 mm flate flekkene ved siden av oljebrønnen ble designet for å muliggjøre en maksimal mengde overflatekontakt mellom armaturen og varmeelementene for varmeledning. På samme måte ble aluminium valgt for basearmaturmaterialet på grunn av sin høye termiske ledningsevne. Skruehullet M3 X 0,5 mm som er ropte ut i trykket, brukes til å feste og plassere termoelementet i oljebrønnen. Klikk her for å laste ned denne filen.

Figur S2: Akrylunderlag. Akrylunderlaget er relativt enkelt stykke å fremstille, uten kritiske fremragende egenskaper, bortsett fra profilen. Den utvendige profilen ble designet med Poka -åk i tankene, slik at akrylunderlaget bare kan orienteres i armaturen på en slik måte at rikelig plass til termoelementet passer i oljebrønnen. Klikk her for å laste ned denne filen.

Figur S3: Oppvarmet scenemontering. En eksplodert visning av det monterte oppvarmede stadiet er gitt for å hjelpe eksperimentet under første oppsett. Legg også merke til området uthevet av den stiplede sirkelen, da dette er den ideelle posisjonen til å fylle aluminiumsarmaturen med olje under protokolltrinn 1.8. Klikk her for å laste ned denne filen.

Figur S4: Åpne sløyfedata og Simulink-modelleringspanelet. (a) viser temperaturresponsene for åpen sløyfe på varierende dc-effektnivåer som ble brukt til å vurdere forsinkelsestiden, td, tidskonstanten, τog varmeforsterkningen i åpen sløyfe, α, av systemet. Forsinkelsestiden representerer tidsforsinkelsen før temperaturen begynner å stige (~20 s). Hver verdi av τ (merket med *, ~125 s) er definert som tiden som kreves for at 63,2 % av den totale temperaturstigningen skal skje. Panel (b) viser steady state-temperaturendringen (∆T) i forhold til den påførte effekten. Hellingen av dataene som er plottet inn (b), ble brukt til å beregne α, som representerer forholdet mellom temperaturendring per medfølgende strøm. Disse parametrene ble brukt i modellen vist i panelet (c) og gitt som en tilleggsfil for å stille inn PI-kontrolleren for å oppnå ønsket temperaturkontrollrespons med lukket sløyfe. Klikk her for å laste ned denne filen.

Figur S5: Ytterligere spesifikke kapasitansdata. Plottene som vises i figur 6a,b, ble kompilert fra dette C M-datasettet. Denne tomten viser også manglende evne til å måle kapasitans nøyaktig ved temperaturer på 25 °C og lavere, derfor ble denne målingen utelukket fra datasettet. Området endres nødvendig for en nøyaktig Cm måling krever overdreven kraft som skal påføres dråpene fra mikromanipulatorene, noe som forårsaker sever forvrengning av dråpene form og kontaktområde. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggskodingsfiler. Klikk her for å laste ned denne filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen som er beskrevet her, gir instruksjoner for montering og drift av et eksperimentelt system for å kontrollere temperaturen på oljen og dråpene som brukes til å danne DIBer. Det er spesielt gunstig for å muliggjøre DIB-dannelse ved hjelp av lipider som har smeltetemperaturer over RT. Videre, ved nøyaktig å variere temperaturen i oljereservoaret, kan bilayertemperaturen manipuleres for å studere effekten av forhøyede temperaturer på ulike membranegenskaper og egenskaper, inkludert kapasitans, område, tykkelse, induserte termotrope faseendringer, kinetikk av membranaktive arter og energisk ved vedheft av bilayergrensesnittet37,38.

Protokollen består av tre deler før bruk i en DIB-studie: 1) forberedelse og montering av den oppvarmede fasearmaturen; 2) koble de ulike instrumentene; og 3) bekrefte egnet temperaturkontrollytelse med de valgte proporsjonale og integrerte kontrollgevinstene. Viktigst i del 2, brukeren må sørge for å unngå delte ledningsbaner mellom utgangen av effektforsterker (>mA strømmer) og patch klemme headstage (pA-nA strømmer). En utilsiktet kortslutning kan forårsake permanent skade på hodeslitasjen. I tillegg bidrar det å sikre at PC-en og alle instrumentene er koblet til et felles vekselstrømsmiljø, og bruken av et jordet Faraday-bur nær hodelykten og dråpeelektrodene bidrar til å minimere støy i bilayerstrømmålinger. Etter at oppsettet i del 2 er fullført, må brukeren først vurdere oljereservoarets åpne sløyferespons ved å påføre en fast spenning på varmeelementene og registrere den påfølgende temperaturstigningen (som vist i figur 4a). Denne typen eksponentiell respons kan brukes til å definere og simulere en enkel modell av systemet for lukket sløyfe for ulike verdier av kontrollgevinster (se figur S4 for detaljer). Kontrollgevinstene som rapporteres her, gjør at systemet raskt kan varmes opp til ønsket temperaturnivå (~ 2 minutter) og med liten overskytning og opprettholde innstilt punktverdi nøyaktig. Men de spesifikke gevinstene som kreves vil avhenge av varmeelementenes effektnivå samt geometrien til armaturen som støtter oljereservoaret. Når egnede verdier for kontrollgevinster er bestemt og tilbakemeldingskontrollsystemet fungerer etter ønske, kan brukeren da begynne å montere og karakterisere en DIB.

Protokollen endrer ikke prosessen med DIB-dannelse eller karakterisering, men det er begrensninger og hensyn. Å øke temperaturen på oljen kan påvirke hvordan dråper henger på elektrodene, på grunn av reduksjoner i monolayerspenning og oljetetthet som øker dråpesaging og konvektive strømmer i oljen som kan flytte dråpene. Derfor foreslår protokollen å senke elektrodenes spisser til nær underlagets bunnoverflate slik at dråper støttes og holdes stille av akrylbeholderen. Brukeren bør vurdere hvor mye substratet kan forvrenge dråpene (hvis de senkes for langt), og vurdere denne forvrengningen ved beregning av bilayerområdet fra bilder av DIBer som diskutert andre steder22.

Mens det beskrevne systemet er begrenset til oppvarming av oljebadet, kan en Peltier kjøleenhet brukes i stedet for de resistive varmeelementene hvis testing ved temperaturer under RT er nødvendig. I dette tilfellet må brukeren imidlertid vurdere frysepunktet i oljefasen. Mange alkaner fryser ved temperaturer høyere enn 0 °C; heksadekanne beskrevet heri fryser ved 18 °C. Hvis oljen fryser, vil dråper ikke lenger være bevegelige og en bilayer mellom dråper kan bli ustabil eller briste.

For en tidligere uprøvd lipidsammensetning er ukjente nøkkeler inkubasjonstiden og -temperaturen som kreves for å muliggjøre tilstrekkelig monolayermontering på overflatene av dråpene. Den generelle regelen er å varme oljen til en temperatur over TM, hvor lipidmobilitet forbedres, noe som gir raskere lateral diffusjon og strammere pakking ved olje-vann-grensesnittet45, og vent lenge nok slik at monolayerpakking ved olje-vann-grensesnittet er høyt. Brukeren kan gjennomgå publisert litteratur eller vurdere sine egne komplementære målinger for å bestemme passende tids- og temperaturverdier: interfaciale spenningsmålinger på et anhengsdråpe goniometer kan brukes til å vurdere tiden som kreves for monolayermontering46 og differensialskanning av kalorimetri brukes ofte til å identifisere termotrope overganger av lipider38. Eller en iterativ tilnærming kan forfølges for å identifisere passende tid og temperatur der bilayerformasjonen er konsistent, membranen er stabil i mer enn noen få minutter, og motstanden til bilayeren er >1 GΩ. I nyere studier med E. coli total lipid ekstrakt (ETLE)37 og BTLE38,47 en starttemperatur >50 °C fører konsekvent til stabil bilayerformasjon. På samme måte kan minimum stabil temperatur etter DIB for en gitt lipidtype også variere mellom lipidvalg. For eksempel kan ETLE DIB-er avkjøles til 25 °C37, mens enkeltkomponent DPPC DIBer alltid samles under TM~40 °C38. Observasjon har vist at BTLE DIBS viser at 27 °C er en sikker minimumstemperatur for å opprettholde en stabil bilayer.

Våre representative resultater viser at temperaturendringer i stor grad kan påvirke egenskapene til den resulterende DIB. Dataene i figur 5 viser at den nominelle kapasitansen til membranen reduseres etter hvert som temperaturen stiger. Fordi kapasitans, C, er direkte proporsjonal med bilayerområdet, A, og omvendt proporsjonal med tykkelsen, d, som angitt av

Equation 1, (1)

En reduksjon i C kan manifesteres ved en reduksjon i A, en økning i d, eller begge deler (forutsatt en fast dielektrisk tillatelse, ε). Disse relasjonene motiverer bruken av kapasitansmålinger og DIB-bilder til å vurdere endringer i C, Aog Cm i forhold til temperatur for å avgjøre hvilke effekter som er signifikante. Dataene som er inkludert i figur 5 og figur 6 for BTLE-DIBer, viser at både C og Cm (som representerer forholdet ε/d) reduseres med nesten 50% når temperaturen stiger fra 30 C til 60 C. Sammen indikerer disse at høyere temperatur tykkere bilayeren, på grunn av økt løselighet av acylkjedene til lipidene i heksadekan48. Den ekstra oljen i membranen kan også påvirke den interfaciale spenningen til bilayeren og kontaktvinkelen mellom dråper22,38. Disse effektene kan kvantifiseres ved å analysere bilder av en DIB ved brukerspesifikke tidsintervaller for å overvåke bilayerområdet og kontaktvinkelen under oppvarming og kjøling.

Oljens temperatur gunstighet i membranen kan også brukes til å vurdere termotrope smeltetemperaturer på lipidene og påvirke ionkanalkinetikken. Smeltetemperaturen for en lipidblanding kan defineres ved å finne ikke-harmoniske endringer i C versus T-relasjoner som i figur 6. De nåværende målingene i figur 7 viser videre at temperaturinduserte endringer i fase (dvs. fluiditet) og tykkelse kan påvirke terskelspenningen for innsetting av ionoforer som Mz. Disse fysiske assosiasjonene er viktige for å forstå ionkanalatferd i modellmembraner, spesielt i scenarier som tar sikte på å gjenskape kroppstemperaturmiljøer. Imidlertid kan de også være nyttige for å justere ledningsevnen til bilayeren i applikasjoner som nevromorfiske databehandlingsenheter47 For eksempel er økt kanalkinetikk en ønskelig funksjon når du fremstiller enheter som viser minnemotstand som trenger å etterligne hjernens hastighet, funksjonalitet og kortsiktig plastisitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Økonomisk støtte ble gitt av National Science Foundation Grant CBET-1752197 og Air Force Office of Scientific Research Grant FA9550-19-1-0213.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
25 mm x 40 mm x 1 mm insulative rubber (x2) Any Insulates the bottom of the aluminum fixture from the stage of the microscope
25 mm x 40 mm x 6 mm insulative rubber (x2) Any Protects heating elements from being damaged by the microscope stage clips and insulates the top of the heating elements.
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid  Sigma Aldrich M3183 Buffering agent for lipid solution
Acrylic substrate Fabricated in house HTD_STG_2 ~1000 uL acrylic well with a poka-yoke exterior profile to fix orientation
Aluminum fixture Fabricated in house HTD_STG_1 Base fixture with an oil well that holds the acylic fixture and includes two flat pads adjacent to the oil well for the heating elements 
Brain Total Lipid Extract Avanti 131101C-100mg 25 mg/mL porcine lipid extract 
Compact DAQ Chassis (cDAQ) National Instruments  cDAQ-9174  Chassis to house multiple types of sensor measurement or output modules
Data Acquisition System (DAQ) Molecular Devices  Digidata 1440A  High resolution analog to digital converter
Fixed gain amplifier/power supply Hewlitt Packard HP 6826A Amplifies DC voltage output from the voltage output module
Glass Cover Slip Corning CLS284525 Seals bottom of aluminum base and allows for optical characterization of the bilayer
Heating element (x2) Omega KHLV-101/5 25 mm x 25 mm polymide film kapton heating element with a 5 watt power limit. 
M3 Stainless Steel Screw McMaster Carr 90116A150 Secures thermocouple to aluminum fixture
Patch clamp amplifier Molecular Devices  AxoPatch 200B  Measures current and outputs voltage to the headstage
Personal computer Any Computer with mulitiple high speed usb ports and a minimum of 6 Gb of ram
Potassium Chloride Sigma Aldrich P3911 Electrolyte solution of dissociated ions
Temperature input module National Instruments  NI 9211 Enables open and cold junction thermocouple measurements for the cDAQ chassis
Thermocouple Omega JMTSS-020U-6  U-type thermocouple with a diameter of 0.02 inches and 6 inches in length
UV Curable Adhesive Loctite 19739 Secures glass coverslip to aluminum base fixture
Voltage output module National Instruments  NI 9263 Analog voltage output module for use with the cDAQ chassis
Waveform generator Agilent 33210A  Used to output a 10 mV 10 Hz sinusoidal waveform

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van Meer, G., de Kroon, A. I. P. M. Lipid map of the mammalian cell. Journal of Cell Science. 124 (1), 5-8 (2011).
  2. Bayley, H., et al. Droplet interface bilayers. Molecular BioSystems. 4 (12), 1191-1208 (2008).
  3. Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 130 (18), 5878-5879 (2008).
  4. Holden, M. A., Needham, D., Bayley, H. Functional bionetworks from nanoliter water droplets. Journal of the American Chemical Society. 129 (27), 8650-8655 (2007).
  5. Sarles, S. A., Leo, D. J. Physical encapsulation of droplet interface bilayers for durable, portable biomolecular networks. Lab on a Chip. 10 (6), 710-717 (2010).
  6. Stanley, C. E., et al. A microfluidic approach for high-throughput droplet interface bilayer (DIB) formation. Chemical Communications. 46 (10), 1620-1622 (2010).
  7. Gross, L. C. M., Heron, A. J., Baca, S. C., Wallace, M. I. Determining membrane capacitance by dynamic control of droplet interface bilayer area. Langmuir. 27 (23), 14335-14342 (2011).
  8. Huang, J., Lein, M., Gunderson, C., Holden, M. A. Direct quantitation of peptide-mediated protein transport across a droplet, interface bilayer. Journal of the American Chemical Society. 133 (40), 15818-15821 (2011).
  9. Leptihn, S., Thompson, J. R., Ellory, J. C., Tucker, S. J., Wallace, M. I. In vitro reconstitution of eukaryotic ion channels using droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 133 (24), 9370-9375 (2011).
  10. Castell, O. K., Berridge, J., Wallace, M. I. Quantification of membrane protein inhibition by optical ion flux in a droplet interface bilayer array. Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3134-3138 (2012).
  11. Dixit, S. S., Pincus, A., Guo, B., Faris, G. W. Droplet shape analysis and permeability studies in droplet lipid bilayers. Langmuir. 28 (19), 7442-7451 (2012).
  12. Elani, Y., deMello, A. J., Niu, X., Ces, O. Novel technologies for the formation of 2-D and 3-D droplet interface bilayer networks. Lab on a Chip. 12 (18), 3514-3520 (2012).
  13. Michalak, Z., Fartash, D., Haque, N., Lee, S. Tunable crystallization via osmosis-driven transport across a droplet interface bilayer. CrystEngComm. 14 (23), 7865-7868 (2012).
  14. Punnamaraju, S., You, H., Steckl, A. J. Triggered release of molecules across droplet interface bilayer lipid membranes using photopolymerizable lipids. Langmuir. 28 (20), 7657-7664 (2012).
  15. Boreyko, J. B., Mruetusatorn, P., Sarles, S. A., Retterer, S. T., Collier, C. P. Evaporation-induced buckling and fission of microscale droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 135 (15), 5545-5548 (2013).
  16. Leptihn, S., et al. Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil. Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).
  17. Villar, G., Graham, A. D., Bayley, H. A Tissue-like printed material. Science. 340 (6128), 48-52 (2013).
  18. Barriga, H. M. G., et al. Droplet interface bilayer reconstitution and activity measurement of the mechanosensitive channel of large conductance from Escherichia coli. Journal of The Royal Society Interface. 11 (98), (2014).
  19. Boreyko, J. B., Polizos, G., Datskos, P. G., Sarles, S. A., Collier, C. P. Air-stable droplet interface bilayers on oil-infused surfaces. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (21), 7588-7593 (2014).
  20. Mruetusatorn, P., et al. Dynamic morphologies of microscale droplet interface bilayers. Soft Matter. 10 (15), 2530-2538 (2014).
  21. Najem, J., Dunlap, M., Sukharev, S., Leo, D. J. The gating mechanism of mechanosensitive channels in droplet interface bilayers. MRS Proceedings. , Cambridge University Press. 1755 (2015).
  22. Taylor, G. J., Venkatesan, G. A., Collier, C. P., Sarles, S. A. Direct in situ measurement of specific capacitance, monolayer tension, and bilayer tension in a droplet interface bilayer. Soft Matter. 11 (38), 7592-7605 (2015).
  23. Bayley, H., Cazimoglu, I., Hoskin, C. E. G. Synthetic tissues. Emerging Topics in Life Sciences. 3 (5), 615-622 (2019).
  24. Oliver, A. E., et al. Protecting, patterning, and scaffolding supported lipid membranes using carbohydrate glasses. Lab on a Chip. 8 (6), 892-897 (2008).
  25. Maglia, G., et al. Droplet networks with incorporated protein diodes show collective properties. Nature Nanotechnology. 4 (7), 437-440 (2009).
  26. Najem, J. S., et al. Activation of bacterial channel MscL in mechanically stimulated droplet interface bilayers. Scientific Reports. 5, 13726 (2015).
  27. Freeman, E. C., Najem, J. S., Sukharev, S., Philen, M. K., Leo, D. J. The mechanoelectrical response of droplet interface bilayer membranes. Soft Matter. 12 (12), 3021-3031 (2016).
  28. Tamaddoni, N., Sarles, S. A. Toward cell-inspired materials that feel: measurements and modeling of mechanotransduction in droplet-based, multi-membrane arrays. Bioinspiration & Biomimetics. 11 (3), 036008 (2016).
  29. Restrepo Schild, V., et al. Light-patterned current generation in a droplet bilayer array. Scientific Reports. 7, 46585 (2017).
  30. Milianta, P. J., Muzzio, M., Denver, J., Cawley, G., Lee, S. Water permeability across symmetric and asymmetric droplet interface bilayers: Interaction of cholesterol sulfate with DPhPC. Langmuir. 31 (44), 12187-12196 (2015).
  31. Mruetusatorn, P., et al. Control of membrane permeability in air-stable droplet interface bilayers. Langmuir. 31 (14), 4224-4231 (2015).
  32. Wauer, T., et al. Construction and manipulation of functional three-dimensional droplet networks. ACS Nano. 8 (1), 771-779 (2013).
  33. Bayley, H. Building blocks for cells and tissues: Beyond a game. Emerging Topics in Life Sciences. 3 (5), 433-434 (2019).
  34. Booth, M., Restrepo Schild, V., Downs, F., Bayley, J. Droplet network, from lipid bilayer to synthetic tissues. Encyclopedia of Biophysics. , Springer. (2019).
  35. Booth, M. J., Cazimoglu, I., Bayley, H. Controlled deprotection and release of a small molecule from a compartmented synthetic tissue module. Communications Chemistry. 2 (1), 142 (2019).
  36. Gobbo, P., et al. Programmed assembly of synthetic protocells into thermoresponsive prototissues. Nature Materials. 17 (12), 1145-1153 (2018).
  37. Taylor, G. J., Sarles, S. A. Heating-enabled formation of droplet interface bilayers using escherichia coli total lipid extract. Langmuir. 31 (1), 325-337 (2015).
  38. Taylor, G. J., et al. Capacitive detection of low-enthalpy, higher-order phase transitions in synthetic and natural composition lipid membranes. Langmuir. 33 (38), 10016-10026 (2017).
  39. Lee, S., Kim, D. H., Needham, D. Equilibrium and dynamic interfacial tension measurements at microscopic interfaces using a micropipet technique. 2. Dynamics of phospholipid monolayer formation and equilibrium tensions at the water-air interface. Langmuir. 17 (18), 5544-5550 (2001).
  40. Najem, J. S., et al. Assembly and characterization of biomolecular memristors consisting of ion channel-doped lipid membranes. Journal of Visualized Experiments. (145), e58998 (2019).
  41. Wang, Y. G., Shao, H. H. Optimal tuning for PI controller. Automatica. 36 (1), 147-152 (2000).
  42. Needham, D., Haydon, D. A. Tensions and free energies of formation of "solventless" lipid bilayers. Measurement of high contact angles. Biophysical Journal. 41 (3), 251-257 (1983).
  43. Sarles, S. A., Leo, D. J. Physical Encapsulation of Interface Bilayers for durable portable biolayer network. Lab on a Chip. 10 (6), 710-717 (2010).
  44. Muller, R. U., Peskin, C. S. The kinetics of monazomycin-induced voltage-dependent conductance. II. Theory and a demonstration of a form of memory. The Journal of General Physiology. 78 (2), 201-229 (1981).
  45. Nenninger, A., et al. Independent mobility of proteins and lipids in the plasma membrane of Escherichia coli. Molecular Microbiology. 92 (5), 1142-1153 (2014).
  46. Venkatesan, G. A., et al. Adsorption kinetics dictate monolayer self-assembly for both lipid-in and lipid-out approaches to droplet interface bilayer formation. Langmuir. 31 (47), 12883-12893 (2015).
  47. Najem, J. S., et al. Memristive ion channel-doped biomembranes as synaptic mimics. ACS Nano. 12 (5), 4702-4711 (2018).
  48. Tamaddoni, N., Taylor, G., Hepburn, T., Michael Kilbey, S., Sarles, S. A. Reversible, voltage-activated formation of biomimetic membranes between triblock copolymer-coated aqueous droplets in good solvents. Soft Matter. 12, 5096-5109 (2016).

Tags

Bioengineering Utgave 170 engineering bioingeniør lipid bilayer dråpegrensesnitt bilayer tilbakemelding temperaturkontroll kapasitansmålinger ionkanal livsvitenskap
Temperaturkontrollert montering og karakterisering av et dråpegrensesnitt Bilayer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ringley, J. D., Sarles, S. A.… More

Ringley, J. D., Sarles, S. A. Temperature-Controlled Assembly and Characterization of a Droplet Interface Bilayer. J. Vis. Exp. (170), e62362, doi:10.3791/62362 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter