Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Ensemble à température contrôlée et caractérisation d’une bicouche d’interface de gouttelettes

Published: April 19, 2021 doi: 10.3791/62362
Automatic Translation
1, 1
1Department of Mechanical, Aerospace and Biomedical Engineering, University of Tennessee

Summary

Ce protocole détaille l’utilisation d’un système de chauffage à température contrôlée par rétroaction pour promouvoir l’assemblage de monocouche lipidique et la formation de bicouches d’interface de gouttelettes pour les lipides avec des températures de fusion élevées, ainsi que des mesures de capacité pour caractériser les changements induits par la température dans la membrane.

Abstract

La méthode de bicouche d’interface de gouttelettes (DIB) pour assembler des bicouches lipidiques (c’est-à-dire des DIB) entre des gouttelettes aqueuses enrobées de lipides dans l’huile offre des avantages clés par rapport à d’autres méthodes: les DIB sont stables et souvent durables, la zone de la bicouche peut être réglée de manière réversible, l’asymétrie des feuillets est facilement contrôlée via des compositions de gouttelettes et des réseaux de bicouches ressemblant à des tissus peuvent être obtenus en attenant de nombreuses gouttelettes. La formation de DIB nécessite l’assemblage spontané de lipides en monocouches lipidiques de haute densité à la surface des gouttelettes. Bien que cela se produise facilement à température ambiante pour les lipides synthétiques courants, une monocouche suffisante ou une bicouche stable ne parvient pas à se former dans des conditions similaires pour les lipides avec des points de fusion au-dessus de la température ambiante, y compris certains extraits lipidiques cellulaires. Ce comportement a probablement limité les compositions — et peut-être la pertinence biologique — des DIB dans les études de membrane de modèle. Pour résoudre ce problème, un protocole expérimental est présenté pour chauffer soigneusement le réservoir d’huile hébergeant des gouttelettes DIB et caractériser les effets de la température sur la membrane lipidique. Plus précisément, ce protocole montre comment utiliser un appareil en aluminium thermoconducteur et des éléments chauffants résistifs contrôlés par une boucle de rétroaction pour prescrire des températures élevées, ce qui améliore l’assemblage monocouche et la formation de bicouche pour un ensemble plus large de types de lipides. Les caractéristiques structurelles de la membrane, ainsi que les transitions de phase thermotrope des lipides composant la bicouche, sont quantifiées en mesurant les changements de capacité électrique du DIB. Ensemble, cette procédure peut aider à évaluer les phénomènes biophysiques dans les membranes modèles à différentes températures, y compris la détermination d’une température de fusion efficace(TM)pour les mélanges lipidiques multicomposants. Cette capacité permettra ainsi une réplication plus étroite des transitions de phase naturelles dans les membranes modèles et encouragera la formation et l’utilisation de membranes modèles à partir d’une plus grande bande de constituants membranaires, y compris ceux qui capturent mieux l’hétérogénéité de leurs homologues cellulaires.

Introduction

Les membranes cellulaires sont des barrières sélectivement perméables composées de milliers de lipides de types1,de protéines, de glucides et de stérols qui encapsulent et subdivisent toutes les cellules vivantes. Comprendre comment leurs compositions affectent leurs fonctions et révéler comment les molécules naturelles et synthétiques interagissent avec, adhèrent, perturbent et transfèrent les membranes cellulaires sont, par conséquent, des domaines de recherche importants avec de vastes implications en biologie, médecine, chimie, physique et génie des matériaux.

Ces objectifs de découverte bénéficient directement de techniques éprouvées d’assemblage, de manipulation et d’étude de membranes modèles, y compris des bicouches lipidiques assemblées à partir de lipides synthétiques ou naturels, qui imitent la composition, la structure et les propriétés de transport de leurs homologues cellulaires. Ces dernières années, la méthode2,3,4 de la bicouche d’interface gouttelettes (DIB) pour la construction d’une bicouche lipidique plane entre des gouttelettes d’eau recouvertes de lipides dans l’huile a fait l’objet d’une attention significative5,6,7,8,9,10,11, 12,13,14, 15,16, 17, 18,19,20,21,22,23,et a démontré des avantages pratiques par rapport à d’autres approches pour la formation de membranes modèles: la méthode DIB est simple à réaliser, ne nécessite aucune fabrication ou préparation sophistiquée (par exemple, « peinture ») d’un substrat pour soutenir la membrane, donne constamment des membranes avec des membranes supérieures longévité, permet des mesures électrophysiologiques standard, et simplifie la formation de membranes modèles avec des compositions de feuillets asymétriques3. Parce que la bicouche se forme spontanément entre les gouttelettes et que chaque gouttelette peut être adaptée en position et en maquillage, la technique DIB a également suscité un intérêt considérable pour le développement de systèmes de matériaux inspirés des cellules qui s’appuient sur l’utilisation de membranes sensibles auxstimuli18,24,25, 26,27, 28,29,compartimentation et transport équilibrés14,30,31,et de matériaux tissulaires17,23,32,33,34,35,36.

La majorité des expériences publiées sur des membranes modèles, y compris celles avec des DIB, ont été réalisées à température ambiante (RT, ~20-25 °C) et avec une poignée de lipides synthétiques (p. ex. DOPC, DPhPC, etc.). Cette pratique limite la portée des questions biophysiques qui peuvent être étudiées dans les membranes modèles et, sur la base de l’observation, elle peut également restreindre les types de lipides qui peuvent être utilisés pour assembler les DIB. Par exemple, un lipide synthétique tel que dppc, qui a une température de fusion de 42 °C, n’assemble pas de monocouches serrées ni ne forme de DIB à RT37. La formation de DIB à température ambiante s’est également avérée difficile pour les extraits naturels, tels que ceux des mammifères (par exemple, l’extrait lipidique total du cerveau, BTLE)38 ou des bactéries (par exemple, l’extrait lipidique total d’Escherichia coli, ETLE)37, qui contiennent de nombreux types différents de lipides et proviennent de cellules qui résident à des températures élevées (37 ° C). L’étude de diverses compositions offre ainsi des occasions de comprendre les processus à médiation membranaire dans des conditions biologiquement pertinentes.

L’élévation de la température de l’huile peut servir à deux fins: elle augmente la cinétique de l’assemblage monocouche et elle peut provoquer une transition de fusion des lipides pour atteindre une phase de désordre liquide. Les deux conséquences facilitent l’assemblagemonocouche 39,un pré-requis pour un DIB. En plus du chauffage pour la formation de bicouches, le refroidissement de la membrane après la formation peut être utilisé pour identifier les transitions thermotropes dans les bicouches lipidiques simples38,y compris celles dans les mélanges lipidiques naturels (par exemple, BTLE) qui peuvent être difficiles à détecter en utilisant la calorimétrie. En plus d’évaluer les transitions thermotropes des lipides, la variation précise de la température du DIB peut être utilisée pour étudier les changements induits par la température dans la structure de la membrane38 et examiner comment la composition lipidique et la fluidité affectent la cinétique des espèces membranaires actives (par exemple, les peptides formant des pores et les protéines transmembranaires37),y compris les membranes modèles mammifères et bactériennes à une température physiologiquement pertinente (37 °C).

Ici, une description de la façon d’assembler un réservoir d’huile DIB modifié et de faire fonctionner un contrôleur de température de rétroaction pour permettre l’assemblage monocouche et la formation de bicouche à des températures supérieures à RT sera expliquée. À la différence d’un protocole précédent40,des détails explicites sont inclus concernant l’intégration de l’instrumentation nécessaire à la mesure et au contrôle de la température parallèlement à l’assemblage et à la caractérisation du DIB dans le réservoir d’huile. La procédure permettra ainsi à un utilisateur d’appliquer cette méthode pour former et étudier des DIB à travers une gamme de températures dans une variété de contextes scientifiques. De plus, les résultats représentatifs fournissent des exemples précis pour les types de changements mesurables dans la structure de la membrane et le transport des ions qui peuvent se produire lorsque la température varie. Ces techniques sont des ajouts importants aux nombreuses études biophysiques qui peuvent être conçues et réalisées efficacement dans les DIB, y compris l’étude de la cinétique des espèces membranaires actives dans différentes compositions membranaires.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Préparation des appareils chauffés

  1. Rassemblez 2 pièces de caoutchouc isolant de 1 mm d’épaisseur garnies de 25 mm x 40 mm de largeur et de longueur, respectivement, 2 pièces d’un caoutchouc de 6 mm d’épaisseur qui sont également de 25 mm x 40 mm, un ensemble de fixation de base en aluminium préparé et un réservoir d’huile acrylique qui s’insère dans la fenêtre d’observation de l’appareil de base en aluminium (voir les figures S1, S2 et S3 pour plus de détails sur la fabrication et une vue éclatée de l’assemblage). Préparez d’abord le luminaire en aluminium en fixant au bas du luminaire une fenêtre de visualisation de la lame de couverture en verre avec adhésif durcissable uv et en adhérant à 1 élément chauffant résistif au sommet de chaque bride latérale de 25 mm x 25 mm du luminaire.
  2. Placez les morceaux de caoutchouc les plus minces sur l’étage du microscope de sorte que le bord long de chaque pièce soit tangent à l’ouverture de l’étage, comme indiqué sur laFigure 1.
  3. Placez le luminaire à base en aluminium sur le dessus des coussinets isolants avec la fenêtre de visualisation du luminaire centrée au-dessus de l’objectif. Un alignement approprié est nécessaire pour l’imagerie des gouttelettes connectées.
  4. Placez un morceau de caoutchouc plus épais sur chaque élément chauffant résistif et utilisez un clip d’étage de microscope pour le maintenir en place. Ces pièces protègent les éléments chauffants des dommages causés par les clips de scène et isolent contre les courts-circuit électriques accidentels entre les éléments chauffants et le luminaire en aluminium et l’étage de microscope.
  5. Pliez soigneusement l’extrémité de mesure d’un thermocouple pour obtenir un angle de 90° à environ 4 mm de l’extrémité.
  6. Insérez la pointe pliue du thermocouple dans le coin inférieur gauche du luminaire en aluminium et fixez-la doucement avec la vis de verrouillage.
  7. Placez le réservoir acrylique dans le puits du luminaire en aluminium. Ceci est fait avant l’ajout d’huile d’hexadécane au puits (étape 1.8) de l’appareil en aluminium afin de minimiser le risque de piégeage des bulles d’air entre la fenêtre de visualisation et le fond du réservoir acrylique, ce qui peut obstruer la vue des gouttelettes.
    REMARQUE: L’huile ajoutée au compartiment de visualisation de l’appareil en aluminium est utilisée pour correspondre aux indices de réfraction de l’acrylique et du verre pour une imagerie plus claire des gouttelettes contenues dans le réservoir acrylique. Ainsi, il convient de noter que l’huile dans le puits du luminaire en aluminium n’entre pas en contact avec le contenu du réservoir acrylique et qu’un nettoyage rigoureux du luminaire en aluminium n’est pas nécessaire.
  8. Distribuer environ 1 000 μL d’huile d’hexadécane dans le puits de l’appareil en aluminium (c.-à-d. entre les parois du réservoir acrylique et de l’appareil en aluminium), en prenant soin de ne pas trop remplir. Le niveau d’huile dans le puits de l’appareil en aluminium doit être aussi élevé que possible pour maximiser la surface pour le transfert de chaleur, tout en ne permettant pas à l’huile de se répandre sur les bords de l’appareil sur l’étage du microscope ou la lentille de l’objectif.
  9. Distribuer environ 1 000 μL d’huile d’hexadécane dans le réservoir acrylique, tout en gardant à l’esprit de ne pas trop remplir.
    REMARQUE: Le réservoir acrylique doit toujours être soigneusement nettoyé entre les expériences. L’utilisateur doit employer un régiment composé de rinçages successifs à l’alcool éthylique et à l’eau désionisée suivis d’un séchage dans un bol de dessicateur pendant plus de 12 h.

Figure 1
Figure 1: Ensemble de scènes chauffées. Les images montrent l’assemblage du dispositif thermoconducteur et du réservoir d’huile pour la formation de DIB; sous chaque image identifient l’étape correspondante du protocole. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

2. Instrumentation pour le contrôle simultané de la température de rétroaction et la caractérisation électrique d’un DIB

REMARQUE: Ce protocole intègre les instruments suivants pour permettre le contrôle de la température de rétroaction et la caractérisation électrique simultanée d’un DIB: un ordinateur personnel (PC) avec deux connexions USB (Universal Serial Bus) disponibles, un amplificateur de serrage de raccordement couplé à un système d’acquisition de données dédié (DAQ-1), un générateur de forme d’onde, un deuxième DAQ programable (DAQ-2) avec des modules de sortie de tension et d’entrée de température, et une alimentation / amplificateur. Les étapes suivantes décrivent les connexions nécessaires de ces instruments (comme illustré à la figure 2a)nécessaires pour isoler la mesure et le contrôle de la température de l’électrophysiologie simultanée d’un DIB. Des substitutions d’instruments équivalents peuvent être effectuées au besoin.

  1. Établissez des connexions de sortie et d’entrée aux modules DAQ-2.
    1. Sélectionnez deux paires de bornes de vis sur le module de sortie de tension pour les connexions de tension différentielle et fixez les fils à ces emplacements. Les bornes impaires sont des connexions à terre communes, et les bornes de nombre pair sont des sorties non ancrées, comme le montre (Figure 2c). Connectez chacune de ces deux paires de fils de plomb à des adaptateurs BNC à bornes vissées séparées, puis connectez chaque adaptateur à un câble BNC distinct utilisé pour acheminer les signaux de tension vers d’autres instruments.
      REMARQUE: Dans cette configuration, des connexions différentielles aux bornes 0 et 1 sont affectées pour la sortie de contrôle de température à l’amplificateur de puissance, tandis qu’une autre paire de connexions aux bornes 6 et 7 est désignée pour la sortie de tension à envoyer aux gouttelettes via l’amplificateur de serrage de patch.
    2. En se référant à(Figure 2c),sélectionnez un ensemble de bornes de thermocouple (par exemple, les bornes 2 et 3 sont désignées comme la paire TC1) sur le module d’entrée du thermocouple et connectez-y les fils du thermocouple.

Figure 2
Figure 2: Connexions de câblage du système. Un schéma des dispositifs et du câblage requis pour le système est présenté en (a), tandis qu’un aperçu détaillé des connexions DAQ-2 est fourni en (b). L’illustration en(c)montre des gouttelettes aqueuses sur des électrodes revêtues d’hydrogel immergées dans de l’huile pour la formation de DIB. Les deux électrodes sont connectées aux connexions mise à la terre et non mise à la terre (V +), respectivement, sur l’unité de tête de l’amplificateur de serrage de patch. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

  1. Une fois les connexions électriques aux modules DAQ-2 effectuées, connectez le châssis DAQ-2 à un PC via une connexion USB et connectez-vous à une source d’alimentation électrique. Confirmez ensuite la réussite de l’installation du pilote et du logiciel avant de l’utiliser avec un logiciel commercial.
  2. Configurez et connectez un amplificateur de puissance entre le DAQ-2 et les éléments chauffants résistifs.
    1. Configurez l’amplificateur pour qu’il fonctionne en mode d’amplification à gain fixe avec un gain de 10X.
    2. À l’aide d’un adaptateur banana jack-BNC, connectez le câble BNC provenant des bornes 0 et 1 du module de sortie de tension(Figure 2b)aux connexions d’entrée de l’amplificateur de puissance.
    3. À l’aide d’adaptateurs BNC et d’un câblage supplémentaires, connectez les bornes de sortie de l’amplificateur de puissance aux deux ensembles d’éléments chauffants, qui sont câblés en parallèle l’un à l’autre et à l’amplificateur pour vous assurer que les deux éléments maintiennent la même chute de tension pendant l’utilisation.
  3. Établir les connexions nécessaires pour l’équipement d’électrophysiologie.
    1. Connectez un câble BNC provenant des bornes 6 et 7 du module de sortie de tension(Figure 2b)aux connecteurs BNC de commande externe commutée arrière situés à l’arrière de l’amplificateur de serrage de raccordement.
    2. Connectez un deuxième câble BNC entre la sortie du générateur de forme d’onde et la connexion de commande externe du commutateur avant à l’arrière de l’amplificateur de serrage de patch.
      REMARQUE: Ces deux connexions fournissent des méthodes alternatives pour générer des formes d’onde de tension qui sont appliquées aux électrodes de gouttelettes via l’amplificateur de serrage de patch. Le générateur de forme d’onde est particulièrement utile pour générer des tensions de forme d’onde triangulaires utilisées pour mesurer la capacité de la membrane. L’utilisateur peut décider lesquels, le cas échéant, sont nécessaires pour sa propre application.
    3. Avec un troisième câble BNC, connectez la sortie du courant mesuré situé sur le panneau avant de l’amplificateur de serrage de raccordement à un connecteur BNC d’entrée analogique disponible à l’avant du DAQ-1.
    4. Avec un quatrième câble BNC, connectez la sortie de la tension de membrane mesurée (à l’arrière de l’amplificateur de serrage de raccordement) à un connecteur d’entrée analogique séparé sur DAQ-1. Cela permet la numérisation de la tension appliquée à travers les électrodes.
    5. Avec les deux électrodes de gouttelettes préparées et supportées sur des micromanipulateurs comme décrit dans les étapes 7-9 de la réf.40,connectez l’électrode mène à la tête de serrage de patch, qui est le câble fixé via à l’amplificateur de pince de patch.
      REMARQUE: Le rôle de la scène de tête est de contrôler la tension entre les électrodes et de mesurer le courant résultant, qui est converti en une tension proportionnelle qui obtient la sortie par l’amplificateur de pince de raccordement à DAQ-1.
    6. Connectez le DAQ-1 à un PC via une connexion USB et connectez les câbles d’alimentation correspondants à l’amplificateur de serrage de raccordement et au DAQ-1.
  4. Mettez sous tension tout l’équipement de mesure.
    REMARQUE: Peut-être le détail le plus important dans cette configuration est de s’assurer que les connexions de sortie de l’amplificateur de puissance (mA-A) sont électriquement isolées de l’unité de tête de l’amplificateur de serrage de raccordement, qui utilise un circuit sensible pour mesurer les courants de niveau pA-nA dans un DIB.

3. Contrôle de la température de rétroaction des bicouches d’interface de gouttelettes

REMARQUE: Les étapes suivantes pour le fonctionnement du système de contrôle de la température de rétroaction sont basées sur une interface utilisateur graphique (GUI) personnalisée créée pour la mise en œuvre du contrôle de température de rétroaction proportionnelle-intégrale (PI)40,41 (voir Fichiers de codage supplémentaires). D’autres logiciels et algorithmes de contrôle peuvent être utilisés à la place. Une copie de ce programme est fournie au lecteur avec les informations supplémentaires pour le papier, mais l’utilisateur est responsable de le configurer pour son propre équipement et ses besoins.

  1. Démarrez le logiciel DAQ-2 sur le PC et ouvrez le fichier de programme de contrôle de la température. Une fois l’interface graphique ouverte, ouvrez à nouveau le programme en cliquant sur l’icône du dossier dans le coin inférieur gauche de l’interface graphique et en sélectionnant le programme de contrôle de la température (Figure 3).
  2. Entrez les valeurs numériques appropriées pour le gain de commande proportionnel(KP)et le gain de contrôle intégral(KI).
    Remarque : KP et KI valeurs de 0,598 et 0,00445, respectivement, ont été trouvés pour fonctionner correctement dans la configuration. Ces valeurs ont été déterminées de manière itérative par simulation à l’aide d’un modèle de système qui intègre des paramètres obtenus à partir des réponses de chauffage en boucle ouverte mesurées (voir la figure 4). Pendant le chauffage en boucle ouverte,la puissance de chauffage prescrite est indépendante de la température mesurée. En revanche, le chauffage en boucle fermée consiste à ajuster continuellement la puissance appliquée aux appareils de chauffage d’une manière qui aide à rapprocher la température mesurée de la température souhaitée. Ceci est réalisé ici à l’aide d’un schéma de contrôle PI.
  3. Pour tester le schéma de contrôle de la température, entrez une température de consigne souhaitée (au-dessus de la température ambiante), puis activez le contrôle de la température de rétroaction dans l’interface graphique. Observez le signal de température mesuré sous contrôle de rétroaction (boucle fermée), qui est affiché dans l’interface graphique pendant les prochaines minutes. Si la température mesurée de l’huile dépasse considérablement la température souhaitée, réagit trop lentement aux changements ou ne parvient pas à converger vers le point de jeu souhaité, l’utilisateur devra ajuster les gains de contrôle pour atteindre les performances en boucle fermée souhaitées.
    REMARQUE: Le programme définit une limite de saturation pour la puissance (et donc la tension) fournie aux éléments chauffants résistifs. Par exemple, deux éléments signalés dans le présent document consomment jusqu’à 5 W d’énergie chacun. Les câbler en parallèle signifie que la consommation totale d’énergie ne doit pas dépasser 10 W. Il est conseillé à l’utilisateur de tenir compte de la quantité maximale d’énergie qui devrait être fournie aux appareils et de savoir que cette limite peut affecter la vitesse à laquelle le système en boucle fermée répondra aux changements de température souhaités. Les éléments chauffants de puissance plus élevée permettent un chauffage plus rapide et des températures de point de réglage plus élevées, mais nécessitent des courants fournis plus élevés pour le chauffage.
  4. Avec le système réglé sur des performances en boucle fermée acceptables, entrez la température d’huile souhaitée pour la formation de DIB comme point de réglage dans l’interface graphique.
    REMARQUE: Par exemple, une température de point de réglage de 60 °C a donné de bons résultats dans les expériences avec des liposomes BTLE dans les gouttelettes aqueuses37. L’utilisateur est référé ailleurs2,40 pour des protocoles expliquant l’assemblage DIB entre des gouttelettes accrochées à des électrodes de type fil et la configuration d’équipements d’électrophysiologie à l’aide de l’amplificateur de serrage de patch, DAQ-1, et du logiciel de mesure d’électrophysiologie. Plus précisément, le protocole de Najem et al.40 peut être suivi de près jusqu’à l’étape 13. Au-delà de cette étape, une approche légèrement différente est utilisée pour une formation réussie de monocouche et de bicouche lors de l’utilisation de lipides qui nécessitent un chauffage pour favoriser la formation de monocouche ou de bicouche.
  5. Abaissez les extrémités des électrodes argent/chlorure d’argent (Ag/AgCl) dans l’huile jusqu’à ce qu’elles touchent presque le fond du réservoir acrylique. Ce positionnement des extrémités de l’électrode est crucial pour maintenir la gouttelette sur l’électrode dans de l’huile chauffée, où des courants convectifs dans l’huile ont été observés pour détacher les gouttelettes des électrodes revêtues d’hydrogel(Figure 2c).
  6. Pipeter une gouttelette de 250 nL de solution aqueuse de lipides contenant 2 mg/mL de BTLE, 100 mM de chlorure de potassium (KCl) et 10 mM d’acide propanesulfonique 3-(N-morpholino) (MOPS) sur chaque extrémité d’électrode et les laisser incuber dans l’huile chauffée pendant au moins 10 minutes pour favoriser la formation de monocouche.
  7. Couvrez la scène d’tête et le montage de scène chauffant avec une cage Faraday mise à la terre.
  8. Amenez les gouttelettes en contact doux en lent
    manipuler les positions horizontales des électrodes jusqu’à ce que l’utilisateur voit les gouttelettes se déformer au contact ou commencer à se déplacer les unes les autres et attendre quelques minutes jusqu’à ce que la formation de la bicouche commence. Si après plusieurs minutes, une bicouche ne s’est pas formée, les gouttelettes peuvent être rapprochées davantage pour faciliter la formation de la bicouche. La formation d’une bicouche interfaciale éclaircie peut être confirmée par une inspection visuelle(figure 5a)ou par la mesure de l’augmentation de l’amplitude d’un courant capacitif de forme d’onde carrée induite par un générateur de forme d’onde extrayant une tension triangulaire de 10 mV, 10Hz 22. Laisser la bicouche s’équilibrer pendant au moins 10 minutes pour atteindre une zone interfaciale stable, lors de la formation initiale et avant la caractérisation ultérieure au point de jeu initial.
    REMARQUE: Le type d’huile peut avoir un impact significatif sur l’amincissement de la couche bicouche, l’épaisseur de la membrane et l’angle de contact inter-gouttelettes. En général, plus la molécule d’huile est petite, plus elle peut facilement rester dans le noyau hydrophobe de la bicouche occupée par les chaînes acétyliques lipidiques. La rétention d’huile augmente les tensions et l’épaisseur de la monocouche et de la bicouche et diminue la surface et l’angle de contact entre les gouttelettes. Ces mesures signifient un état d’adhérence plus faible. Des molécules plus grosses et plus volumineuses exercent l’effet inverse. Par exemple, le squalène est une molécule plus volumineuse que les alcanes tels que l’hexadécane, ce qui lui permet d’être facilement exclu entre les monocouches lors de l’amincissement bicouche. En tant que tels, les DIB formés dans le squalène sont plus minces, ils présentent des zones de contact et des angles plus élevés, et ils présentent des énergies libres de formationplus élevées 22,42 (une mesure de l’adhérence gouttelettes-gouttelettes).

4. Caractérisation des comportements dépendant de la température dans les DIB

REMARQUE: De nombreux processus physiques peuvent être étudiés dans les membranes modèles à base de DIB, y compris la façon dont les changements de température affectent la structure et les propriétés de transport de la membrane. Les étapes suivantes doivent être effectuées après la formation réussie de la bicouche à la température souhaitée.

  1. Mesurer la capacité nominale de la membrane tout en abaissant la température du bain d’huile à partir d’un point de réglage qui permet la formation de bicouche pour identifier les transitions de phase thermotrope des lipides dans la membrane38.
    1. Cliquez avec le bouton droit sur le graphique de température sur l’interface graphique et effacez les données affichées. Cela garantit que suffisamment d’espace dans la mémoire tampon est disponible pour les enregistrements suivants.
    2. À l’aide du générateur de forme d’onde connecté à l’amplificateur de serrage de raccordement, appliquez une forme d’onde de tension triangulaire (p. ex. 10 mV, 10 Hz) à travers les électrodes DIB et enregistrez la réponse de courant induite à travers la bicouche.
    3. Refroidir la bicouche en réduisant la température du point de réglage par incréments de 5 °C et en attendant un minimum de 5 min à la nouvelle température d’équilibre entre les changements de température jusqu’à ce que la température souhaitée soit atteinte. Vous pouvez également essayer de refroidir passivement la bicouche en éteignant le système de contrôle de rétroaction. Sachez toutefois que les expériences mettant en œuvre un refroidissement passif de 50 à 60 °C ont entraîné des taux de coalescence plus élevés.
    4. Une fois que le bain d’huile et la bicouche refroidissent à la température minimale souhaitée, cliquez à nouveau avec le bouton droit sur le graphique de la température dans l’interface graphique et exportez les données de température en fonction du temps vers un tableur. Arrêtez l’enregistrement en cours.
    5. À partir du courant mesuré, calculer la capacité nominale de la réponse onde-courant carré en fonction du temps pendant la période de refroidissement.
    6. Tracer la capacité nominale(C)par rapport à la température(T)pour observer comment la capacité de la membrane a changé. Localisez les changements nonmonotoniques de C par rapport à T pour identifier TM.
      REMARQUE: La capacité nominale peut être calculée à partir de l’amplitude du courant d’onde carrée43 (| I|) à l’aide de la relation | Je | = C dv/dt, où dv/dt est égal à quatre fois le produit de l’amplitude de tension (| V|) et fréquence(f)de la tension triangulaire appliquée. D’après ces équations, C = | I|/(4| V|f).
  2. De même, évaluer la capacité spécifique quasi statique(Cm)de la bicouche à des températures fixes en incrémentant successivement la température du bain d’huile et de la zone bicouche.
    1. Modifiez la température du point de réglage par incréments de 10 °C à l’aide de l’interface graphique et permettez au système de s’équilibrer à la nouvelle température.
      1. Effectuez l’étape 4.1.2 pour lancer la mesure du courant capacitif et l’enregistrement.
      2. Modifiez la zone bicouche en ajustant soigneusement les positions des électrodes à l’aide des micro-manipulateurs (c’est-à-dire que la séparation des électrodes réduit la surface de la bicouche). Permettre au courant d’onde carrée d’atteindre une amplitude à l’état stable et recueillir des images du DIB pour permettre le calcul de la surface de la membrane en fonction du temps en utilisant une caméra montée sur le microscope pour imager la bicouche vue de l’ouverture de l’étage du microscope. Simultanément, ajoutez une balise numérique dans le logiciel d’enregistrement actuel pour marquer le point temporel correspondant pour la collection d’images.
        NOTE: Les micro-manipulateurs permettent le contrôle précis des électrodes et donc un contact doux entre les gouttelettes. La manipulation grossière des gouttelettes peut conduire à un échec de l’expérience par coalescence des gouttelettes ou en provoquant la chute d’une gouttelette de l’électrode. Comme indiqué ailleurs22, la surface bicouche est calculée à partir de la longueur de contact entre les gouttelettes, qui apparaissent sous forme de cercles superposés dans une image vue de dessous. Les positions et dimensions des gouttelettes, ainsi que la longueur de la ligne de contact, peuvent être calculées à l’aide d’un logiciel de traitement d’images ou avec d’autres outils de programmation scientifique.
      3. Répétez l’étape 4.2.1.2 au moins 4 fois pour obtenir un total de 5 images DIB et régions d’équilibre du courant bicouche.
    2. Répétez l’étape 4.2.1 à chaque température souhaitée.
    3. Aux points de temps balisés correspondant aux zones bicouches à l’état d’équilibre pour les images acquises, analysez les enregistrements actuels et les images DIB pour extraire les données C et A pour chaque température.
    4. Tracer les données C versus A pour chaque température et calculer la pente d’une régression de premier ordre, qui représente le Cm de la bicouche à chaque température22.
    5. Valeurs de la placette de Cm obtenues à partir de l’étape 4.2.4 par rapport à T.
    6. Examiner les données Cm par rapport aux données T pour les variations non monotones afin d’identifier les températures de fusion, TM.
  3. Évaluer la dynamique de la formation de canaux ioniques dépendant de la tension en générant une entrée de pas de tension continue à travers la bicouche.
    1. Réglez la tension initiale sur la valeur de pas souhaitée en mV (par exemple, 100 mV).
    2. Définissez la tension finale et la taille du pas sur une valeur supérieure à l’étape souhaitée (p. ex., tension finale de 110 mV et taille de pas de 110 mV).
    3. Définissez une durée souhaitée pour l’entrée de l’étape en secondes (par exemple, 90 s).
    4. Choisissez la polarité souhaitée pour l’entrée de l’étape (par exemple, positive).
    5. Changez l’amplificateur de serrage de patch pour envoyer à la scène la tension de commande provenant du module de sortie GUI/tension.
    6. Lancez les enregistrements en cours.
    7. Activez la tension et enregistrez la réponse au courant induit, qui devrait présenter une réponse en forme de S à une tension critique (p. ex., ~70 mV pour 1 μg/mL Mz dans 2 mg/mL de BTLE).
  4. Séparément, des relations dynamiques courant-tension pour une membrane peuvent être obtenues aux températures souhaitées pour révéler les relations dépendantes de la tension, telles que les comportements des canaux ioniques.
    1. Changez l’amplificateur de serrage de patch pour envoyer à la scène d’tête la tension de commande provenant du générateur de forme d’onde et lancer des enregistrements de courant.
    2. Sur le générateur de forme d’onde, extrayez une forme d’onde sinusoïdale continue avec une amplitude, un décalage et une fréquence souhaités.
    3. Enregistrer la réponse actuelle induite sur un ou plusieurs cycles.
    4. Répétez comme vous le souhaitez pour différentes amplitudes, fréquences et températures d’ondes sinusoïdales.

Figure 3
Figure 3: L’interface graphique de contrôle de la température. Cette figure met en évidence et étiquette les étapes critiques requises pour utiliser l’interface graphique du programme pour contrôler la température du bain d’huile. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

La figure 1 montre comment le luminaire en aluminium et le réservoir d’huile acrylique sont préparés sur l’étage du microscope pour la formation de DIB. Les étapes d’assemblage 1.2 à 1.4 servent à isoler thermiquement le luminaire de la scène pour un chauffage plus efficace. Les étapes 1.5 à 1.7 montrent comment fixer correctement le thermocouple au luminaire et positionner le réservoir d’huile, et les étapes 1.8 à 1.9 montrent les emplacements recommandés pour la distribution d’huile dans ces pièces.

La figure 2 décrit les composants utilisés pour établir le contrôle de la température de rétroaction et effectuer des mesures électriques sur un DIB : un PC, un amplificateur de puissance à gain fixe, un amplificateur de serrage de patch et un système DAQ (ou un instrument équivalent pour appliquer la tension et mesurer les courants de niveau pA-nA), un deuxième DAQ avec des entrées et sorties analogiques appropriées, un générateur de forme d’onde et le luminaire en aluminium assemblé avec radiateurs résistifs attachés. DAQ-2 utilise deux modules(Figure 2b). Un module de sortie de tension analogique 16 bits à 4 canaux, ±10 V, est utilisé pour initier les tensions indépendantes fournies à l’entrée de l’amplificateur de puissance (connexion bleue sur la figure 2a)et une entrée de commande externe sur l’amplificateur de serrage de raccordement (connexion verte). Le module de sortie de tension est limité par un courant de sortie maximal de 46 mA et une tension de sortie maximale de 10 V, tandis que chaque élément chauffant utilisé ici consomme jusqu’à 5 W de puissance (~ 180 mA max) à une tension maximale de 28 V. Pour cette raison, l’alimentation / amplificateur a été inclus pour pré-amplifier la tension de sortie et compléter le courant fourni nécessaire pour alimenter les éléments chauffants (câblés en parallèle) fixés au luminaire en aluminium. Un dispositif d’entrée de thermocouple 4 canaux et 24 bits est utilisé pour numériser les mesures de température à partir du réservoir d’huile près du DIB (connexion jaune). Étant donné que le module du dispositif d’entrée du thermocouple permet jusqu’à 4 thermocouples, l’utilisateur peut envisager de surveiller les températures à d’autres endroits dans le luminaire. Si cela est fait, ils devront également considérer quel signal ou combinaison de signaux est utilisé pour la comparaison avec la température de point de réglage souhaitée dans la boucle de rétroaction.

Ces sorties et signaux mesurés sont contrôlés via deux logiciels: 1) l’interface graphique personnalisée pour le contrôle de la température; et 2) un logiciel de mesure d’électrophysiologie. La figure 3 montre une capture d’écran de l’interface graphique et inclut des annotations aux étapes correspondantes dans le protocole. L’interface graphique est utilisée pour définir des paramètres clés (température du point de consigne, gains de contrôle PI, limites de tension), comparer la température mesurée à la température du point de consigne et calculer le signal de commande fourni à l’amplificateur, puis aux éléments chauffants, et enregistrer les données de la température et de la tension appliquée en fonction du temps. Ce programme comprend également la possibilité de commander la tension appliquée aux électrodes DIB(Figure 2c)via l’amplificateur de serrage de patch. Séparément, un logiciel de mesure est utilisé pour configurer les mesures de la tension appliquée aux électrodes DIB et du courant induit à travers la bicouche lipidique. Une tension proportionnelle au courant DIB est sortie par l’amplificateur de serrage de patch et envoyée via un câble BNC à DAQ-1 (connexion non représentée).

La figure 4 représente le changement de température et d’alimentation électrique absolue envoyés aux appareils de chauffage en fonction du temps dans les scénarios de chauffage en boucle ouverte et en boucle fermée. Pour le premier, une tension d’entrée arbitraire correspondant à ~5,2 W de puissance a été appliquée aux appareils de chauffage, ce qui a entraîné une augmentation exponentielle de la température avec une constante de temps d’environ 125 s et un état stable ΔT ≈ 4,5 °C/W après un retard initial d’environ 20 s. Ces caractéristiques du système en boucle ouverte ont été utilisées pour construire un modèle du système en boucle fermée dans un logiciel de simulation (voir la figure S4 pour plus de détails) qui peut être utilisé pour déterminer les valeurs des gains de contrôle proportionnels et intégraux. Les réponses en boucle fermée et simulées du modèle de la figure 4 représentent donc les réponses mesurées et simulées du contrôleur PI accordé, avec des valeurs KP et KI de 0,598 et 0,00445, respectivement, à une température de point de réglage supérieure de 20 °C à RT. Par rapport au cas en boucle ouverte, la simulation et les mesures confirment l’augmentation de la vitesse de réponse dans le système en boucle fermée (constante de temps ~ 63 s). La réduction du temps de chauffage se fait au détriment d’une puissance appliquée initiale plus élevée. Néanmoins, la température de réglage souhaitée et la température mesurée de l’huile sont restées à moins de 0,6 °C à l’état d’équilibre, ce qui a été jugé approprié pour une utilisation. La puissance totale fournie est limitée dans le programme pendant le contrôle en boucle fermée afin de ne pas éclipser la limite de puissance totale de 10 W pour les deux radiateurs.

Le système de contrôle de la température a été utilisé pour mettre en valeur la dépendance à la température du solvant dans un DIB formé à partir de lipides BTLE et son impact sur la capacité de la membrane (Figure 5). Les lipides BTLE ont été choisis pour cette mesure car le chauffage est nécessaire pour la formation de DIB en raison d’une transition de phase lipidique qui se produit entre 35 et 42°C38. Le protocole décrit ici a été réalisé pour initier la formation de bicouche à 60 °C. Après la formation et l’équilibration de la membrane, la température peut être successivement abaissée ou augmentée selon les besoins pour caractériser la réponse de la membrane. Par exemple, la figure 5a montre des mesures représentatives du courant capacitif brut (forme d’onde de forme carrée) et de la température par rapport au temps pendant un cycle de chauffage allant de RT à ~60 °C. Observez que l’amplitude de la forme d’onde de courant capacitif diminue de plus de la moitié à mesure que la température augmente, ce qui est causé par l’absorption d’huile dans le noyau hydrophobe de la membrane. Ce changement épaissit l’interface et modifie la tension latérale de labicouche 22,37,38.

Les données de la figure 5b documentent les changements en C (normalisés par la capacité à 27 °C) par rapport à T sur un cycle complet de refroidissement-chauffage après formation initiale de la bicouche à 60 °C. Tout comme dans la figure 5a,à mesure que la température augmente, la capacité diminue. Cependant, ce que cette présentation montre plus clairement, ce sont les changements non monotoniques qui se produisent à des températures comprises entre ~30-42 °C, ce qui représente la température de fusion collective, TM,au cours de laquelle le mélange lipidique passe entre une phase thermotropique ordonnée par un liquide et une phase thermotrope désordonnée par unliquide. La température où se produit le changement nonmonotonique de capacité correspond à un changement d’épaisseur de la bicouche par exclusion de l’huile de la membrane38. Notez également que l’hystérésis montrée entre le cycle de chauffage et le cycle de refroidissement est due à des changements irréversibles dans la zone bicouche qui se produisent entre les cycles suivants, qui ont généralement été effectués à 10 minutes d’intervalle.

De même, la figure 6a,b montre comment des mesures quasi statiques de Cm à différentes températures peuvent être utilisées pour identifier TM. Ici, la surface de la membrane est modifiée successivement en augmentant manuellement la distance entre les électrodes de gouttelettes. Au cours de cette expérience, les gouttelettes sont d’abord poussées ensemble pour promouvoir la surface maximale de la membrane avant les réductions ultérieures de la zone de contact avec des séparations par étapes entre les électrodes. À chaque niveau de contact, la capacité nominale de la bicouche est évaluée à partir du courant induit et sa surface est déterminée par analyse d’image. Le traçage de C par rapport à A permet une régression linéaire, où la pente représente la valeur de Cm comme le montre la figure 6a. La répétition de cette procédure à plusieurs températures (figure 6b) montre que Cm diminue de près de 50% à des températures supérieures à TM,confirmant une augmentation de l’épaisseur hydrophobe de la membrane en raison de l’absorption d’hexadécane induite par le chauffage (voir la figure S5 pour les données complètes de C par rapport à A). À des températures plus élevées, le solvant supplémentaire dans la membrane réduit également la zone de contact maximale entre les gouttelettes, et donc la capacité nominale maximale. La réduction de la température inverse ces effets. L’image DIB de la figure 6c montre que lorsque la température (25 °C) est bien inférieure à TM,la membrane peut adopter de manière stable un état hautement adhésif, même sous la tension de gouttelettes étirées causées par des électrodes bien séparées. Ceci est le résultat de l’exclusion complète de l’hexadécane de la bicouche, ce qui augmente l’énergie d’adhérence des gouttelettes. Dans cet état, la zone bicouche ne peut pas être modifiée de manière fiable par la manipulation des électrodes et entrave la capacité de mesurer avec précision la capacité spécifique (voir la figure S5 pour plus de détails).

Enfin, les données représentatives de la figure 7 montrent comment les changements de température peuvent affecter les comportements des espèces formant des pores qui créent des canaux conducteurs d’ions à travers un DIB. La monazomycine (Mz), un antibiotique chargé positivement qui forme des canaux sélectifs cationiques à travers la bicouche à des potentiels transmembranaires suffisants37,44,a été choisi pour démontrer cette relation. Ces mesures ont été effectuées sur un DIB à base de BTLE (concentration finale de 2 mg/mL dans les deux gouttelettes) dopé avec du Mz (concentration finale de 1 μg/mL dans les deux gouttelettes). Les traces de courant par rapport à tension représentées à la figure 7a ont été obtenues en appliquant des tensions sinusoïdales membranaires et en mesurant le courant induit à deux températures différentes ; les flèches et les nombres suivants de la figure 7a aident à visualiser les quarts successifs de la tension sinusoïdale par rapport au temps. Ce type de mesure est souvent effectué pour examiner la dépendance en tension du courant à travers les canaux ioniques. Les données ici montrent que l’augmentation de la température du DIB de 27 °C à 45 °C fait passer le seuil de formation du canal d’environ |100 mV| à ~|110 mV|. Ce changement, probablement dû à l’épaisseur plus élevée de la membrane due à l’huile absorbée, montre que la barrière énergétique pour l’insertion a augmenté. L’hystérésis dans ces courbes - qui signifie la résistance de la mémoire - peut être causée par des changements induits par la tension dans la zone bicouche ou la cinétique de la formation et de l’inactivation du canal Mz44.

Pour aider à séparer ces facteurs dans les DIB, les changements transitoires du courant ionique peuvent être mesurés en réponse à une tension pas à pas cc. La figure 7b montre la densité de courant mesurée pour la même membrane BTLE dutée par Mz au même niveau de tension (+90 mV) et à deux températures différentes (27 °C et 45 °C). Les données montrent clairement que la cinétique des réponses du canal est très différente. Notamment, à 27°C, la membrane présente une augmentation de courant plus rapide et plus importante qui est ensuite suivie d’une désintégration transitoire (cette dernière est le résultat de la translocation des canaux Mz à travers la bicouche à un état inactif44). La réponse est beaucoup plus atténuée à 45 °C, où la montée en forme de Sdu courant n’est pas suivie d’une chute ultérieure. De telles différences sont utiles pour évaluer la cinétique des réponses des canaux et comprendre comment celles-ci pourraient contribuer à la résistance dynamique totale de la membrane.

Figure 4
Figure 4: Chauffage en boucle ouverte ou en boucle fermée. Le panneau(a)compare les réponses temporelles pour le système en boucle fermée mesuré et simulé (voir SI) à un pas de température de +20 °C à la réponse de chauffage en boucle ouverte sous une puissance fixe appliquée. Le panneau(b)affiche la puissance dissipée par chaque système. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5
Figure 5: Capacité de mesure et variation de température. La réponse typique du courant de forme d’onde carrée à une entrée de forme d’onde triangulaire de 10 mV et 10 Hz sur une membrane lipidique BTLE subissant une transition de phase est illustrée à (a). La transition de phase des lipides peut également être vue dans les données de mesure de surface affichées ci-dessus panneau (a). La capacité normalisée par la capacité initiale à 27 °C est représentée sur le panneau(b)tracé en fonction de la température pour un cycle de chauffage et de refroidissement. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 6
Figure 6: Mesures de capacité spécifiques Le panneau (a)montre la capacité nominale par rapport à la surface bicouche obtenue à des zones de contact successives pour deux températures différentes. Des régressions linéaires à chaque ensemble sont utilisées pour déterminer leurs valeurs respectives de CM. Le panneau(b)représente CM par rapport à T,tandis que le panneau(c)montre la forme d’onde de courant capacitif stable (à gauche) et la zone de contact (à droite) sous la tentative de séparation des gouttelettes à 25 °C. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 7
Figure 7: Résistance de la membrane dépendante de la tension et cinétique du canal ionique Mz par rapport à la température. Le panneau(a)   montre comment la relation courant-tension change avec la température des BTLE DIBs formés entre des gouttelettes contenant 1 μg/ml Mz. Les flèches et les nombres représentent les parties successives de l’onde sinusoïdale appliquée. Les différences dans ces traces illustrent comment la température déplace le seuil de tension pour l’insertion de Mz, qui est identifié comme l’ampleur de la tension où le courant induit augmente fortement. De même, le panneau(b)montre la température d’impact de la réponse du courant transitoire induite par une tension pas à pas continu de 90 mV. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure S1 : Appareil en aluminium. Ce dessin montre les dimensions et les caractéristiques nécessaires à la fabrication du luminaire en aluminium qui est la base de l’étage chauffé. Les points plats de 25,2 mm X 26 mm adjacents au puits de pétrole ont été conçus pour permettre un contact maximal de surface entre le luminaire et les éléments chauffants pour la conduction de la chaleur. De même, l’aluminium a été choisi pour le matériau du luminaire de base en raison de sa conductivité thermique élevée. Le trou de vis M3 X de 0,5 mm appelé dans l’impression est utilisé pour fixer et positionner le thermocouple dans le puits de pétrole. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure S2 : Substrat acrylique. Le substrat acrylique est une pièce relativement simple à fabriquer, sans caractéristiques exceptionnelles critiques, à l’exception du profil. Le profil extérieur a été conçu avec Poka -yoke à l’esprit de sorte que le substrat acrylique ne peut être orienté dans le luminaire de manière à laisser suffisamment d’espace pour le thermocouple pour s’adapter au puits de pétrole. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure S3: Ensemble de scènes chauffées. Une vue éclatée de l’étage chauffé assemblé a été fournie pour aider l’expérimentateur lors de la configuration initiale. Notez également la zone mise en évidence par le cercle en pointillés, car c’est la position idéale pour remplir le luminaire en aluminium avec de l’huile lors de l’étape de protocole 1.8. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure S4: Données en boucle ouverte et panneau de modélisation Simulink. (a) montre les réponses de température en boucle ouverte aux différents niveaux de puissance cc qui ont été utilisés pour évaluer le temps de retard, td, la constante de temps, τ, et le gain de chauffage en boucle ouverte, α, du système. Le délai représente le décalage avant que la température ne commence à augmenter (~20 s). Chaque valeur de τ (marquée par *, ~125 s) est définie comme le temps nécessaire pour que 63,2 % de l’augmentation totale de la température se produise. Le panneau (b) montre le changement de température à l’état d’équilibre (∆T)par rapport à la puissance appliquée. La pente des données tracées en (b) a été utilisée pour calculer le α, qui représente le rapport de changement de température par puissance fournie. Ces paramètres ont été utilisés dans le modèle présenté dans le panneau (c) et fournis sous forme de fichier supplémentaire pour régler le contrôleur PI afin d’obtenir une réponse de contrôle de température en boucle fermée souhaitée. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure S5: Données de capacité spécifiques supplémentaires. Les graphiques de la figure 6a,b ont été compilés à partir de cet ensemble de données CM. Ce graphique montre également l’incapacité de mesurer avec précision la capacité à des températures de 25 °C et moins, par conséquent, cette mesure a été exclue de l’ensemble de données. Les changements de surface nécessaires pour une mesure précise de Cm nécessitent une force excessive à appliquer aux gouttelettes des micromanipulateurs, ce qui provoque une distorsion de la forme des gouttelettes et de la zone de contact. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichiers de codage supplémentaires. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Le protocole décrit ici fournit des instructions pour l’assemblage et l’exploitation d’un système expérimental pour contrôler la température de l’huile et des gouttelettes utilisées pour former des DIB. Il est particulièrement bénéfique pour permettre la formation de DIB en utilisant des lipides qui ont des températures de fusion supérieures à RT. De plus, en faisant varier précisément la température du réservoir d’huile, la température bicouche peut être manipulée pour étudier les effets des températures élevées sur diverses propriétés et caractéristiques de la membrane, y compris la capacité, la surface, l’épaisseur, les changements de phase thermotrope induits, la cinétique des espèces membranaires actives, et l’énergie d’adhérence de l’interfacebicouche 37,38.

Le protocole se compose de trois parties avant utilisation dans une étude DIB: 1) préparation et assemblage du montage de scène chauffé; 2) connecter les différents instruments; et 3) confirmer les performances appropriées de contrôle de la température avec les gains de contrôle proportionnels et intégraux choisis. Plus important encore dans la partie 2, l’utilisateur doit s’assurer d’éviter les chemins de conduction partagés entre la sortie de l’amplificateur de puissance (courants >mA) et la tête d’eau de la pince de raccordement (courants pA-nA). Un court-circuit involontaire pourrait causer des dommages permanents à la scène d’tête. De plus, s’assurer que le PC et tous les instruments sont connectés à une masse d’alimentation CA commune, et l’utilisation d’une cage de Faraday mise à la terre près de la scène de tête et des électrodes de gouttelettes aide à minimiser le bruit dans les mesures de courant bicouche. Une fois l’installation de la partie 2 terminée, l’utilisateur doit d’abord évaluer la réponse de chauffage en boucle ouverte du réservoir d’huile en appliquant une tension fixe aux éléments chauffants et en enregistrant l’augmentation ultérieure de la température (comme le montre la figure 4a). Ce type de réponse exponentielle peut être utilisé pour définir et simuler un modèle simple du système en boucle fermée pour des valeurs variables de gains de contrôle (voir la figure S4 pour plus de détails). Les gains de contrôle rapportés ici permettent au système de chauffer à un niveau de température souhaité rapidement (~ 2 minutes) et avec peu de dépassement et de maintenir la valeur du point de réglage avec précision. Mais les gains spécifiques requis dépendront du niveau de puissance des éléments chauffants ainsi que de la géométrie du luminaire qui supporte le réservoir d’huile. Une fois que les valeurs appropriées des gains de contrôle sont déterminées et que le système de contrôle de rétroaction fonctionne comme vous le souhaitez, l’utilisateur peut alors commencer à assembler et à caractériser un DIB.

Le protocole ne change pas le processus de formation ou de caractérisation du DIB, mais il y a des limites et des considérations. L’augmentation de la température de l’huile peut affecter la façon dont les gouttelettes pendent sur les électrodes, en raison des réductions de la tension monocouche et de la densité de l’huile qui augmentent l’affaissement des gouttelettes et les courants de convection dans l’huile qui peuvent déplacer les gouttelettes. Par conséquent, le protocole suggère d’abaisser les extrémités des électrodes près de la surface inférieure du substrat de sorte que les gouttelettes soient soutenues et maintenues immobiles par le réservoir acrylique. L’utilisateur doit évaluer dans quelle mesure le substrat peut déformer les gouttelettes (s’il est abaissé trop loin), et tenir compte de cette distorsion lors du calcul de la surface de la bicouche à partir d’images de DIB comme indiqué ailleurs22.

Bien que le système décrit soit limité au chauffage du bain d’huile, un dispositif de refroidissement Peltier pourrait être utilisé à la place des éléments chauffants résistifs si des essais à des températures inférieures à RT sont nécessaires. Dans ce cas, cependant, l’utilisateur devra considérer le point de congélation de la phase huile. De nombreux alcanes gèlent à des températures supérieures à 0 °C; l’hexadécane décrit ici gèle à 18 °C. Si l’huile gèle, les gouttelettes ne seront plus déplaçables et une bicouche entre les gouttelettes peut devenir instable ou se rompre.

Pour une composition lipidique non testée auparavant, les principales inconnues sont le temps d’incubation et la température nécessaires pour permettre un assemblage monocouche suffisant à la surface des gouttelettes. La règle générale est de chauffer l’huile à une température supérieure à TM,où la mobilité lipidique est améliorée permettant une diffusion latérale plus rapide et un emballage plus serré à l’interface huile-eau45,et d’attendre assez longtemps pour que l’emballage monocouche à l’interface huile-eau soit élevé. L’utilisateur peut consulter la littérature publiée ou envisager ses propres mesures complémentaires pour déterminer les valeurs de temps et de température appropriées : les mesures de tension interfaciale sur un goniomètre suspendu peuvent être utilisées pour évaluer le temps nécessaire à l’assemblage monocouche46 et la calorimétrie différentielle à balayage est souvent utilisée pour identifier les transitions thermotropes des lipides38. Ou une approche itérative peut être poursuivie pour identifier le temps et la température appropriés où la formation de la bicouche est cohérente, la membrane est stable pendant plus de quelques minutes, et la résistance de la bicouche est de >1 GΩ. Dans des études récentes avec l’extrait lipidique total de E. coli (ETLE)37 et BTLE38,47 une température de départ >50 °C conduit constamment à la formation de bicouche stable. De même, la température minimale stable après DIB pour un type de lipide donné peut également varier entre les sélections de lipides. Par exemple, les DIB ETLE peuvent être refroidis à 25°C37,tandis que les DIB DPPC à composant unique sont toujours fusionnés en dessous de TM~ 40 ° C38. L’observation a montré que BTLE DIBS montre que 27 °C est une température minimale sûre pour maintenir une bicouche stable.

Nos résultats représentatifs montrent que les changements de température peuvent grandement affecter les propriétés du DIB résultant. Les données de la figure 5 montrent que la capacité nominale de la membrane diminue à mesure que la température augmente. Parce que la capacité, C, est directement proportionnelle à la surface bicouche, A, et inversement proportionnelle à l’épaisseur, d, comme donné par

Equation 1, (1)

une diminution de C peut se manifester par une diminution de A,une augmentation de d, ou les deux (en supposant une permittivité diélectrique fixe, ε). Ces relations motivent l’utilisation de mesures de capacité et d’images DIB pour évaluer les changements de C, Aet Cm par rapport à la température afin de déterminer quels effets sont significatifs. Les données incluses dans la figure 5 et la figure 6 pour les DIB BTLE montrent que C et Cm (qui représente le rapport ε/d)diminuent de près de 50% à mesure que la température passe de 30 C à 60 C. Ensemble, ces éléments indiquent qu’une température plus élevée épaissit la bicouche, en raison d’une solubilité accrue des chaînes acyle des lipides dans l’hexadécane48. L’huile supplémentaire dans la membrane peut également affecter la tension interfaciale de la bicouche et l’angle de contact entre les gouttelettes22,38. Ces effets peuvent être quantifiés en analysant les images d’un DIB à des intervalles de temps spécifiés par l’utilisateur pour surveiller la zone bicouche et l’angle de contact pendant le chauffage et le refroidissement.

La favorabilité de la température de l’huile dans la membrane peut également être utilisée pour évaluer les températures de fusion thermotropes des lipides et affecter la cinétique des canaux ioniques. La température de fusion d’un mélange lipidique peut être définie en localisant les changements non monotoniques dans les relations C versus T comme dans la figure 6. Les mesures de courant de la figure 7 révèlent en outre que les changements de phase (c’est-à-dire de fluidité) et d’épaisseur induits par la température peuvent avoir un impact sur la tension de seuil pour l’insertion d’ionophores comme Mz. Ces associations physiques sont importantes pour comprendre les comportements des canaux ioniques dans les membranes modèles, en particulier dans les scénarios visant à reproduire les environnements de température corporelle. Cependant, ils peuvent également être utiles pour régler la conductivité de la bicouche dans des applications telles que les dispositifs informatiques neuromorphiques47 Par exemple, l’augmentation de la cinétique des canaux est une caractéristique souhaitable lors de la fabrication de dispositifs présentant une résistance de la mémoire qui doivent imiter la vitesse, la fonctionnalité et la plasticité à court terme du cerveau.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs n’ont pas de conflit d’intérêts.

Acknowledgments

Le soutien financier a été fourni par la subvention CBET-1752197 de la National Science Foundation et la subvention FA9550-19-1-0213 du Bureau de la recherche scientifique de la Force aérienne.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
25 mm x 40 mm x 1 mm insulative rubber (x2) Any Insulates the bottom of the aluminum fixture from the stage of the microscope
25 mm x 40 mm x 6 mm insulative rubber (x2) Any Protects heating elements from being damaged by the microscope stage clips and insulates the top of the heating elements.
3-(N-morpholino) propanesulfonic acid  Sigma Aldrich M3183 Buffering agent for lipid solution
Acrylic substrate Fabricated in house HTD_STG_2 ~1000 uL acrylic well with a poka-yoke exterior profile to fix orientation
Aluminum fixture Fabricated in house HTD_STG_1 Base fixture with an oil well that holds the acylic fixture and includes two flat pads adjacent to the oil well for the heating elements 
Brain Total Lipid Extract Avanti 131101C-100mg 25 mg/mL porcine lipid extract 
Compact DAQ Chassis (cDAQ) National Instruments  cDAQ-9174  Chassis to house multiple types of sensor measurement or output modules
Data Acquisition System (DAQ) Molecular Devices  Digidata 1440A  High resolution analog to digital converter
Fixed gain amplifier/power supply Hewlitt Packard HP 6826A Amplifies DC voltage output from the voltage output module
Glass Cover Slip Corning CLS284525 Seals bottom of aluminum base and allows for optical characterization of the bilayer
Heating element (x2) Omega KHLV-101/5 25 mm x 25 mm polymide film kapton heating element with a 5 watt power limit. 
M3 Stainless Steel Screw McMaster Carr 90116A150 Secures thermocouple to aluminum fixture
Patch clamp amplifier Molecular Devices  AxoPatch 200B  Measures current and outputs voltage to the headstage
Personal computer Any Computer with mulitiple high speed usb ports and a minimum of 6 Gb of ram
Potassium Chloride Sigma Aldrich P3911 Electrolyte solution of dissociated ions
Temperature input module National Instruments  NI 9211 Enables open and cold junction thermocouple measurements for the cDAQ chassis
Thermocouple Omega JMTSS-020U-6  U-type thermocouple with a diameter of 0.02 inches and 6 inches in length
UV Curable Adhesive Loctite 19739 Secures glass coverslip to aluminum base fixture
Voltage output module National Instruments  NI 9263 Analog voltage output module for use with the cDAQ chassis
Waveform generator Agilent 33210A  Used to output a 10 mV 10 Hz sinusoidal waveform

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. van Meer, G., de Kroon, A. I. P. M. Lipid map of the mammalian cell. Journal of Cell Science. 124 (1), 5-8 (2011).
  2. Bayley, H., et al. Droplet interface bilayers. Molecular BioSystems. 4 (12), 1191-1208 (2008).
  3. Hwang, W. L., Chen, M., Cronin, B., Holden, M. A., Bayley, H. Asymmetric droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 130 (18), 5878-5879 (2008).
  4. Holden, M. A., Needham, D., Bayley, H. Functional bionetworks from nanoliter water droplets. Journal of the American Chemical Society. 129 (27), 8650-8655 (2007).
  5. Sarles, S. A., Leo, D. J. Physical encapsulation of droplet interface bilayers for durable, portable biomolecular networks. Lab on a Chip. 10 (6), 710-717 (2010).
  6. Stanley, C. E., et al. A microfluidic approach for high-throughput droplet interface bilayer (DIB) formation. Chemical Communications. 46 (10), 1620-1622 (2010).
  7. Gross, L. C. M., Heron, A. J., Baca, S. C., Wallace, M. I. Determining membrane capacitance by dynamic control of droplet interface bilayer area. Langmuir. 27 (23), 14335-14342 (2011).
  8. Huang, J., Lein, M., Gunderson, C., Holden, M. A. Direct quantitation of peptide-mediated protein transport across a droplet, interface bilayer. Journal of the American Chemical Society. 133 (40), 15818-15821 (2011).
  9. Leptihn, S., Thompson, J. R., Ellory, J. C., Tucker, S. J., Wallace, M. I. In vitro reconstitution of eukaryotic ion channels using droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 133 (24), 9370-9375 (2011).
  10. Castell, O. K., Berridge, J., Wallace, M. I. Quantification of membrane protein inhibition by optical ion flux in a droplet interface bilayer array. Angewandte Chemie International Edition. 51 (13), 3134-3138 (2012).
  11. Dixit, S. S., Pincus, A., Guo, B., Faris, G. W. Droplet shape analysis and permeability studies in droplet lipid bilayers. Langmuir. 28 (19), 7442-7451 (2012).
  12. Elani, Y., deMello, A. J., Niu, X., Ces, O. Novel technologies for the formation of 2-D and 3-D droplet interface bilayer networks. Lab on a Chip. 12 (18), 3514-3520 (2012).
  13. Michalak, Z., Fartash, D., Haque, N., Lee, S. Tunable crystallization via osmosis-driven transport across a droplet interface bilayer. CrystEngComm. 14 (23), 7865-7868 (2012).
  14. Punnamaraju, S., You, H., Steckl, A. J. Triggered release of molecules across droplet interface bilayer lipid membranes using photopolymerizable lipids. Langmuir. 28 (20), 7657-7664 (2012).
  15. Boreyko, J. B., Mruetusatorn, P., Sarles, S. A., Retterer, S. T., Collier, C. P. Evaporation-induced buckling and fission of microscale droplet interface bilayers. Journal of the American Chemical Society. 135 (15), 5545-5548 (2013).
  16. Leptihn, S., et al. Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil. Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).
  17. Villar, G., Graham, A. D., Bayley, H. A Tissue-like printed material. Science. 340 (6128), 48-52 (2013).
  18. Barriga, H. M. G., et al. Droplet interface bilayer reconstitution and activity measurement of the mechanosensitive channel of large conductance from Escherichia coli. Journal of The Royal Society Interface. 11 (98), (2014).
  19. Boreyko, J. B., Polizos, G., Datskos, P. G., Sarles, S. A., Collier, C. P. Air-stable droplet interface bilayers on oil-infused surfaces. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (21), 7588-7593 (2014).
  20. Mruetusatorn, P., et al. Dynamic morphologies of microscale droplet interface bilayers. Soft Matter. 10 (15), 2530-2538 (2014).
  21. Najem, J., Dunlap, M., Sukharev, S., Leo, D. J. The gating mechanism of mechanosensitive channels in droplet interface bilayers. MRS Proceedings. , Cambridge University Press. 1755 (2015).
  22. Taylor, G. J., Venkatesan, G. A., Collier, C. P., Sarles, S. A. Direct in situ measurement of specific capacitance, monolayer tension, and bilayer tension in a droplet interface bilayer. Soft Matter. 11 (38), 7592-7605 (2015).
  23. Bayley, H., Cazimoglu, I., Hoskin, C. E. G. Synthetic tissues. Emerging Topics in Life Sciences. 3 (5), 615-622 (2019).
  24. Oliver, A. E., et al. Protecting, patterning, and scaffolding supported lipid membranes using carbohydrate glasses. Lab on a Chip. 8 (6), 892-897 (2008).
  25. Maglia, G., et al. Droplet networks with incorporated protein diodes show collective properties. Nature Nanotechnology. 4 (7), 437-440 (2009).
  26. Najem, J. S., et al. Activation of bacterial channel MscL in mechanically stimulated droplet interface bilayers. Scientific Reports. 5, 13726 (2015).
  27. Freeman, E. C., Najem, J. S., Sukharev, S., Philen, M. K., Leo, D. J. The mechanoelectrical response of droplet interface bilayer membranes. Soft Matter. 12 (12), 3021-3031 (2016).
  28. Tamaddoni, N., Sarles, S. A. Toward cell-inspired materials that feel: measurements and modeling of mechanotransduction in droplet-based, multi-membrane arrays. Bioinspiration & Biomimetics. 11 (3), 036008 (2016).
  29. Restrepo Schild, V., et al. Light-patterned current generation in a droplet bilayer array. Scientific Reports. 7, 46585 (2017).
  30. Milianta, P. J., Muzzio, M., Denver, J., Cawley, G., Lee, S. Water permeability across symmetric and asymmetric droplet interface bilayers: Interaction of cholesterol sulfate with DPhPC. Langmuir. 31 (44), 12187-12196 (2015).
  31. Mruetusatorn, P., et al. Control of membrane permeability in air-stable droplet interface bilayers. Langmuir. 31 (14), 4224-4231 (2015).
  32. Wauer, T., et al. Construction and manipulation of functional three-dimensional droplet networks. ACS Nano. 8 (1), 771-779 (2013).
  33. Bayley, H. Building blocks for cells and tissues: Beyond a game. Emerging Topics in Life Sciences. 3 (5), 433-434 (2019).
  34. Booth, M., Restrepo Schild, V., Downs, F., Bayley, J. Droplet network, from lipid bilayer to synthetic tissues. Encyclopedia of Biophysics. , Springer. (2019).
  35. Booth, M. J., Cazimoglu, I., Bayley, H. Controlled deprotection and release of a small molecule from a compartmented synthetic tissue module. Communications Chemistry. 2 (1), 142 (2019).
  36. Gobbo, P., et al. Programmed assembly of synthetic protocells into thermoresponsive prototissues. Nature Materials. 17 (12), 1145-1153 (2018).
  37. Taylor, G. J., Sarles, S. A. Heating-enabled formation of droplet interface bilayers using escherichia coli total lipid extract. Langmuir. 31 (1), 325-337 (2015).
  38. Taylor, G. J., et al. Capacitive detection of low-enthalpy, higher-order phase transitions in synthetic and natural composition lipid membranes. Langmuir. 33 (38), 10016-10026 (2017).
  39. Lee, S., Kim, D. H., Needham, D. Equilibrium and dynamic interfacial tension measurements at microscopic interfaces using a micropipet technique. 2. Dynamics of phospholipid monolayer formation and equilibrium tensions at the water-air interface. Langmuir. 17 (18), 5544-5550 (2001).
  40. Najem, J. S., et al. Assembly and characterization of biomolecular memristors consisting of ion channel-doped lipid membranes. Journal of Visualized Experiments. (145), e58998 (2019).
  41. Wang, Y. G., Shao, H. H. Optimal tuning for PI controller. Automatica. 36 (1), 147-152 (2000).
  42. Needham, D., Haydon, D. A. Tensions and free energies of formation of "solventless" lipid bilayers. Measurement of high contact angles. Biophysical Journal. 41 (3), 251-257 (1983).
  43. Sarles, S. A., Leo, D. J. Physical Encapsulation of Interface Bilayers for durable portable biolayer network. Lab on a Chip. 10 (6), 710-717 (2010).
  44. Muller, R. U., Peskin, C. S. The kinetics of monazomycin-induced voltage-dependent conductance. II. Theory and a demonstration of a form of memory. The Journal of General Physiology. 78 (2), 201-229 (1981).
  45. Nenninger, A., et al. Independent mobility of proteins and lipids in the plasma membrane of Escherichia coli. Molecular Microbiology. 92 (5), 1142-1153 (2014).
  46. Venkatesan, G. A., et al. Adsorption kinetics dictate monolayer self-assembly for both lipid-in and lipid-out approaches to droplet interface bilayer formation. Langmuir. 31 (47), 12883-12893 (2015).
  47. Najem, J. S., et al. Memristive ion channel-doped biomembranes as synaptic mimics. ACS Nano. 12 (5), 4702-4711 (2018).
  48. Tamaddoni, N., Taylor, G., Hepburn, T., Michael Kilbey, S., Sarles, S. A. Reversible, voltage-activated formation of biomimetic membranes between triblock copolymer-coated aqueous droplets in good solvents. Soft Matter. 12, 5096-5109 (2016).

Tags

Bioingénierie numéro 170 ingénierie bioingénierie bicouche lipidique bicouche d’interface gouttelettes contrôle de la température de rétroaction mesures de capacité canal ionique sciences de la vie
Ensemble à température contrôlée et caractérisation d’une bicouche d’interface de gouttelettes
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ringley, J. D., Sarles, S. A.… More

Ringley, J. D., Sarles, S. A. Temperature-Controlled Assembly and Characterization of a Droplet Interface Bilayer. J. Vis. Exp. (170), e62362, doi:10.3791/62362 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter