使用荧光激活的细胞核分选从新鲜冷冻的皮质中分离出成年人类星形胶质细胞群
Summary
我们开发了一种从新鲜冷冻组织中富集和分离人类星形胶质细胞群的方法，用于下游分子分析。
Abstract
人类星形胶质细胞的复杂性在初级人体组织中仍然定义不清，需要更好的工具来分离和分子表征。荧光激活的细胞核分选（FANS）可用于从冷冻的档案组织中成功分离和研究人类神经元核（NeuN+）群体，从而避免与处理新鲜组织相关的问题。然而，缺乏从非神经元（NeuN-）元件中分离出类似星体的努力。最近开发和验证的免疫标记策略使用三种转录因子抗体同时从非患病、新鲜（未固定）速冻的死后人类颞叶新皮层组织中分离富集神经元（NeuN+）、星形胶质细胞（成对盒蛋白6 （PAX6）+NeuN-）和少突胶质细胞祖细胞 （OLIG2+NeuN-）细胞群。
该技术被证明可用于表征原发性病理性癫痫新皮层中细胞类型特异性转录组改变。转录组学分析证实，PAX6 + NeuN-分选的群体在静息和反应条件下都能强健地富集泛星形胶质细胞标志物并捕获星形胶质细胞。本文介绍了从新鲜冷冻的人皮层中分离富含星形胶质细胞的细胞群的FANS方法，包括组织解离成单核（sn）悬浮液;用抗NeuN和抗PAX6荧光偶联抗体对细胞核进行免疫标记;FANS门控策略和质量控制指标，用于优化分选过程中的灵敏度和特异性以及确认星形胶质细胞富集;并建议采购批量或Sn分辨率的下游转录组和染色质可及性测序。该方案适用于具有各种病理的非坏死，新鲜冷冻，人皮质标本，并推荐在24小时内收集死后组织。
Introduction
人类星形胶质细胞的分子复杂性在原代组织中仍然定义不清，需要更好的工具在健康和疾病中以高分辨率分离和表征它们。由于新鲜脑组织样本的获取有限，神经胶质和神经元过程的紧密相互联系的性质以及加工过程中不可避免的细胞活化，完整的人类神经元和神经胶质细胞从其生态位中分离已被证明是困难的，所有这些都限制了这些细胞类型的 离体1的分子表征。.荧光激活的细胞核分选（FANS）已成为活细胞分选的替代方案，能够从冷冻组织中解离和免疫标记细胞群。在过去的十年中，FANS已被广泛用于分离和分子表征各种脑标本和解剖区域中的人类神经元（NeuN +）细胞核群体1，2，3，4。
然而，从人体皮层中分离特定神经胶质核亚群的类似方法受到限制，导致在理解正常和患病组织中的星形胶质细胞复杂性方面相对缺乏复杂性。为此，先前发表的方案适用于使用FANS 4分离人类神经元群体，并且验证了一种使用三抗体组合富集星形胶质细胞（和少突胶质体祖细胞）的方法，在静息和反应条件下捕获星形胶质细胞5。为了特异性富集NeuN-级分中的星形胶质细胞，使用抗体对抗已知在星形胶质细胞群体中差异表达的两种转录因子之一，PAX6或SRY-box转录因子9（SOX9）6，7。PAX6在萌发区的桡骨神经胶质细胞样祖细胞内的早期胎儿发育过程中高度表达，并有助于神经发生和胶质生成8，9，10，11 以及视网膜神经元规格12。在成人中，PAX6在静息人星形胶质细胞6 中差异性过表达，并在人癫痫组织星形胶质细胞13中显示蛋白质与神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）共表达。
该协议描述了通过FANS同时分离新皮质神经元和富含星形胶质细胞的细胞核群体。首先从成人皮层收集的新鲜（未固定）速冻（即新鲜冷冻）死后组织以机械和化学方式解离。在蔗糖梯度中裂解和超速离心后，丢弃细胞质和细胞外成分，同时保留细胞核。然后用对应于所需靶谱系的荧光偶联核抗体标记细胞核，并使用FANS进行分类。遵循这种方法，在收集的PAX6 + NeuN-群体中证明了星形胶质细胞的富集，并通过靶向qPCR小组以及下游核RNA测序进行验证。
Protocol
Representative Results
Discussion
在考虑了几个生物学和技术因素后，应最终确定按照概述的方案进行的实验设计。起始组织样品是新鲜冷冻的，无需固定，并且优选具有较短的死后收集间隔，以最大限度地提高细胞核回收率。根据经验，长达24小时的PMI可以充分恢复细胞核;然而，PMI为12小时或更短时间可优选以优化完整细胞核的恢复。除PMI外的其他因素，包括身体储存温度和组织pH值，也可能影响细胞核产量，但这些研究没有考…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们要感谢西奈山伊坎医学院病理学和神经外科的成员，感谢他们帮助采购去识别化的脑组织，并感谢ISMMS的流式细胞术CORE专家建议。该研究的部分资金来自NIH RF1DA048810，R01NS106229，R03NS101581（到N.M.T.）和R61DA048207（到S.A.）。
Materials
| 10x PBS pH 7.2 | Invitrogen | 70013073 | |
| ANTI-NEUN ANTIBODY CLONE A60 | Millipore | MAB377A5MI | mouse anti-NeuN conjugated to a fluorescent compound AF555 (excitation, 553 nm; emission, 568 nm) |
| ANTI-OLIG2 ANTIBODY CLONE 211 | Millipore | MABN50A4MI | mouse anti-OLIG2 conjugated to a fluorescent compound AF488 (excitation, 499 nm; emission, 520 nm) |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | BP9704-100 | |
| Bright-Line Counting Chamber | Hausser Scientific | 3110V | |
| Calcium Chloride Anhydrous | Fisher | C614-3 | |
| Cell Strainers, 40 µM | SP Scienceware | 136800040 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma | 43815-1G | |
| DNA Library Kit | Illumina, Nextera | FC-121–1030 | |
| DNAse I | Worthington | LS002139 | |
| Dounce Tissue Grinder | WHEATON | 357542 | |
| FACS Sorter | BD Biosciences | BD FACSAria III | |
| Magnesium Acetate Tetrahydrate | Fisher | M13-500 | |
| PAX6 (PAX6/496) – 100 TESTS | Novus | NBP234705J | |
| RNA Clean & Concentrator | Zymo Research | R1013 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico Input Mammalian | Clontech Laboratories | 635005 | Fragmentation time of 2.5 minutes, as recommended for low RIN RNA values. |
| Sucrose, crystal certified, ACS, 500 mg | Fisher | S5500 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure | Thermo Scientific | J22638AE | |
| TritonX-100 | Fisher | BP151-500 | non-ionic surfactant in lysis buffer |
| TRIzol LS Reagent | Invitrogen | 10296028 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | reagent for isolation of RNA |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Optima XE-100 | A94516 | |
| Ultracentrifuge tubes PP 9/16 X 3-1/2 | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure Distilled Water (RNAse-, DNAse-free) | Invitrogen | 10977023 | referred to as distilled water |
| Ultrapure EDTA | Life Technologies | 15576-028 |
Referências
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