Выделение популяций взрослых астроцитов человека из свежезамороженной коры с помощью флуоресцентно-активированной сортировки ядер
Summary
Мы разработали метод, который обогащает и изолирует человеческие популяции астроцитов из свежезамороженной ткани для использования в последующих молекулярных анализах.
Abstract
Сложность астроцитов человека остается плохо определенной в первичной ткани человека, что требует лучших инструментов для их выделения и молекулярной характеристики. Флуоресцентно-активированная сортировка ядер (FANS) может быть использована для успешной изоляции и изучения популяций нейронов человека (NeuN+) из замороженной архивной ткани, тем самым избегая проблем, связанных с обработкой свежей ткани. Однако усилия по аналогичной изоляции астроглии от ненейронального (NeuN-) элемента отсутствуют. Недавно разработанная и валидированная стратегия иммунотегирования использует три антитела транскрипционного фактора для одновременного выделения обогащенных нейрональных (NeuN+), астроцитарных (парный бокс-белок 6 (PAX6) + NeuN-) и олигодендроцитарных предшественников (OLIG2 + NeuN-) популяций из небольшей, свежей (незафиксированной) замороженной посмертной височной неокортексной ткани человека.
Было показано, что этот метод полезен для характеристики специфических для типа клеток изменений транскриптома при первичной патологической эпилепсии неокортекса. Транскриптомные анализы подтвердили, что популяции, отсортированные PAX6 + NeuN, надежно обогащены панастроцитарными маркерами и захватывают астроциты как в условиях покоя, так и в реактивных условиях. В данной работе описана методология FANS по выделению обогащенных астроцитами популяций ядер из свежезамороженной коры головного мозга человека, включая диссоциацию тканей в одноядерную (sn) суспензию; иммунотегирование ядер анти-NeuN и анти-PAX6 флуоресцентно конъюгированными антителами; Стратегии сбора ФАН и метрики контроля качества для оптимизации чувствительности и специфичности при сортировке и для подтверждения обогащения астроцитов; и рекомендованные закупки для последующего секвенирования транскриптома и доступности хроматина при массовом разрешении или разрешении sn. Этот протокол применим для ненекротических, свежезамороженных, корковых образцов человека с различными патологиями и рекомендуемым посмертным забором тканей в течение 24 ч.
Introduction
Молекулярная сложность астроцитов человека остается плохо определенной в первичной ткани, что требует лучших инструментов для их выделения и характеристики с высоким разрешением, как в здоровье, так и в болезни. Отделение неповрежденных человеческих нейронов и глии от их ниши оказалось затруднительным из-за ограниченного доступа к свежим образцам мозговой ткани, сильно взаимосвязанной природы глиальных и нейронных процессов и неизбежной клеточной активации во время обработки, все из которых ограничивают молекулярную характеристику этих типов клеток ex vivo1. . Флуоресцентно-активированная сортировка ядер (FANS) появилась в качестве альтернативы сортировке живых клеток, что позволяет диссоциировать и иммунотегировать популяции ядер из замороженной ткани. В последнее десятилетие FANS стал широко использоваться для выделения и молекулярной характеристики популяций нейронов человека (NeuN+) в различных образцах мозга и анатомических областях 1,2,3,4.
Однако аналогичные методы выделения специфических субпопуляций глиальных ядер из коры головного мозга человека были ограничены, что привело к относительному отсутствию сложности в понимании сложности астроцитов как в нормальных, так и в больных тканях. С этой целью был адаптирован ранее опубликованный протокол для выделения популяций нейронов человека с использованием FANS 4, и былутвержден метод обогащения астроцитов (и олигодендроглиальных предшественников) с использованием комбинации тройных антител, захватывающей астроциты как в состоянии покоя, так и в реактивных условиях5. Чтобы специфически обогатить астроциты в NeuN-фракции, антитела использовали против одного из двух факторов транскрипции, которые, как известно, дифференциально экспрессируются в популяциях астроцитов, PAX6 или фактор транскрипции SRY-box 9 (SOX9)6,7. PAX6 высоко экспрессируется во время раннего развития плода в радиальных глиоподобных предшественниках в зародышевых зонах и способствует как нейрогенезу, так и глиогенезу 8,9,10,11, а также спецификации нейронов сетчатки12. У взрослого человека PAX6 дифференциально сверхэкспрессируется в покоящихся астроцитах человека6 и проявляет коэкспрессию белка с глиальным фибриллярным кислым белком (GFAP) в астроцитах ткани эпилепсии человека13.
Этот протокол описывает одновременную изоляцию неокортикальных нейрональных и обогащенных астроцитами популяций ядер FAN. Свежая (нефиксированная) замороженная (т.е. свежезамороженная) посмертная ткань, собранная из коры головного мозга взрослого человека, сначала механически и химически диссоциируется. После лизиса и ультрацентрифугирования в градиенте сахарозы цитоплазматический и внеклеточный компоненты отбрасываются, а ядра сохраняются. Затем ядра мечутся флуоресцентно конъюгированными ядерными антителами, соответствующими желаемым целевым линиям, и сортируются с помощью FANS. Следуя этому подходу, обогащение астроцитов демонстрируется в собранных популяциях PAX6 + NeuN-, подтвержденных как целевой панелью qPCR, так и последующим секвенированием ядерной РНК.
Protocol
Representative Results
Discussion
Экспериментальный проект в соответствии с изложенным протоколом должен быть завершен после рассмотрения нескольких биологических и технических факторов. Исходные образцы тканей являются свежезамороженными, без фиксации и предпочтительно имеют короткий интервал посмертного сбора ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить членов в области патологии и нейрохирургии в Медицинской школе Икана на горе Синай за помощь в приобретении деидентифицированной мозговой ткани и ПРОточной цитометрии ISMMS CORE за советы экспертов. Исследование частично финансировалось NIH RF1DA048810, R01NS106229, R03NS101581 (до N.M.T.) и R61DA048207 (до S.A.).
Materials
| 10x PBS pH 7.2 | Invitrogen | 70013073 | |
| ANTI-NEUN ANTIBODY CLONE A60 | Millipore | MAB377A5MI | mouse anti-NeuN conjugated to a fluorescent compound AF555 (excitation, 553 nm; emission, 568 nm) |
| ANTI-OLIG2 ANTIBODY CLONE 211 | Millipore | MABN50A4MI | mouse anti-OLIG2 conjugated to a fluorescent compound AF488 (excitation, 499 nm; emission, 520 nm) |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | BP9704-100 | |
| Bright-Line Counting Chamber | Hausser Scientific | 3110V | |
| Calcium Chloride Anhydrous | Fisher | C614-3 | |
| Cell Strainers, 40 µM | SP Scienceware | 136800040 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma | 43815-1G | |
| DNA Library Kit | Illumina, Nextera | FC-121–1030 | |
| DNAse I | Worthington | LS002139 | |
| Dounce Tissue Grinder | WHEATON | 357542 | |
| FACS Sorter | BD Biosciences | BD FACSAria III | |
| Magnesium Acetate Tetrahydrate | Fisher | M13-500 | |
| PAX6 (PAX6/496) – 100 TESTS | Novus | NBP234705J | |
| RNA Clean & Concentrator | Zymo Research | R1013 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico Input Mammalian | Clontech Laboratories | 635005 | Fragmentation time of 2.5 minutes, as recommended for low RIN RNA values. |
| Sucrose, crystal certified, ACS, 500 mg | Fisher | S5500 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure | Thermo Scientific | J22638AE | |
| TritonX-100 | Fisher | BP151-500 | non-ionic surfactant in lysis buffer |
| TRIzol LS Reagent | Invitrogen | 10296028 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | reagent for isolation of RNA |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Optima XE-100 | A94516 | |
| Ultracentrifuge tubes PP 9/16 X 3-1/2 | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure Distilled Water (RNAse-, DNAse-free) | Invitrogen | 10977023 | referred to as distilled water |
| Ultrapure EDTA | Life Technologies | 15576-028 |
Referências
- Mitchell, A., Roussos, P., Peter, C., Tsankova, N., Akbarian, S. The future of neuroepigenetics in the human brain. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 128, 199-228 (2014).
- Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. Isolation of neuronal chromatin from brain tissue. BMC Neuroscience. 9, 42 (2008).
- Akbarian, S., et al. The PsychENCODE project. Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).
- Matevossian, A., Akbarian, S. Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (20), e914 (2008).
- Tome-Garcia, J., et al. Cell type-specific isolation and transcriptomic profiling informs glial pathology in human temporal lobe epilepsy. BioRxiv. , (2020).
- Zhang, Y., et al. Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse. Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).
- Sun, W., et al. SOX9 Is an astrocyte-specific nuclear marker in the adult brain outside the neurogenic regions. Journal of Neuroscience. 37 (17), 4493-4507 (2017).
- Manuel, M. N., Mi, D., Mason, J. O., Price, D. J. Regulation of cerebral cortical neurogenesis by the Pax6 transcription factor. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 70 (2015).
- Sakurai, K., Osumi, N. The neurogenesis-controlling factor, Pax6, inhibits proliferation and promotes maturation in murine astrocytes. Journal of Neuroscience. 28 (18), 4604-4612 (2008).
- Zhong, S., et al. Decoding the development of the human hippocampus. Nature. 577 (7791), 531-536 (2020).
- Pollen, A., et al. Molecular identity of human outer radial glia during cortical development. Cell. 163 (1), 55-67 (2015).
- Cvekl, A., Callaerts, P. PAX6: 25th anniversary and more to learn. Experimental Eye Research. 156, 10-21 (2017).
- Goc, J., Liu, J. Y., Sisodiya, S. M., Thom, M. A spatiotemporal study of gliosis in relation to depth electrode tracks in drug-resistant epilepsy. European Journal of Neuroscience. 39 (12), 2151-2162 (2014).
- Monoranu, C. M., et al. pH measurement as quality control on human post mortem brain tissue: a study of the BrainNet Europe consortium. Neuropathology and Applied Neurobiology. 35 (3), 329-337 (2009).
- Ninkovic, J., et al. The transcription factor Pax6 regulates survival of dopaminergic olfactory bulb neurons via crystallin αA. Neuron. 68 (4), 682-694 (2010).
