형광 활성화 핵 분류를 사용하여 신선 냉동 피질로부터 성인 인간 성상세포 집단의 분리
Summary
우리는 하류 분자 분석에 사용하기 위해 인간 성상 세포 집단을 신선하게 냉동 된 조직으로부터 풍부하게하고 분리하는 방법을 개발했습니다.
Abstract
인간 성상세포의 복잡성은 일차 인간 조직에서 제대로 정의되지 않은 상태로 남아 있으며, 격리 및 분자 특성화를위한 더 나은 도구가 필요합니다. 형광 활성화 핵 분류(FANS)는 동결된 보관 조직에서 인간 뉴런 핵(NeuN+) 집단을 성공적으로 분리하고 연구하는 데 사용할 수 있으므로 신선한 조직 취급과 관련된 문제를 피할 수 있습니다. 그러나, 유사하게 비신경세포(NeuN-) 요소로부터 아스트로아교세포를 분리하려는 노력은 결여되어 있다. 최근에 개발되고 검증된 면역태깅 전략은 세 개의 전사인자 항체를 사용하여 농축된 뉴런(NeuN+), 성상세포(쌍을 이룬 박스 단백질 6(PAX6)+NeuN-) 및 희소돌기아교세포 전구세포(OLIG2+NeuN-) 핵 집단을 병에 걸리지 않은, 신선한(고정되지 않은) 스냅 냉동 사후 인간 측두엽 신피질 조직으로부터 동시에 분리한다.
이 기술은 원발성 병리학적 간질 신피질에서 세포 유형 특이적 전사체 변경의 특성화에 유용한 것으로 나타났다. 전사체 분석은 PAX6+NeuN-분류된 집단이 범성상세포 마커에 대해 견고하게 풍부해지고 휴식 및 반응성 조건 모두에서 성상세포를 포획한다는 것을 확인했다. 이 논문은 단일 핵 (sn) 현탁액으로의 조직 해리를 포함하여 신선하고 냉동 된 인간 피질로부터 성상 세포가 풍부한 핵 집단을 분리하기위한 FANS 방법론을 설명합니다. 항-NeuN 및 항-PAX6 형광 접합된 항체를 사용한 핵의 면역태깅; 분류 중 민감도와 특이성을 최적화하고 성상세포 농축을 확인하기 위한 FANS 게이팅 전략 및 품질 관리 지표; 그리고 대량 또는 sn 해상도에서 다운스트림 전사체 및 크로마틴 접근성 시퀀싱에 대한 조달을 권장한다. 이 프로토콜은 다양한 병리를 가진 비 괴사성, 신선하고 냉동 된 인간 피질 표본에 적용 가능하며 24 시간 이내에 사후 조직 수집을 권장합니다.
Introduction
인간 성상세포의 분자 복잡성은 일차 조직에서 제대로 정의되지 않은 상태로 남아 있으며, 건강과 질병 모두에서 고해상도로 분리 및 특성화를위한 더 나은 도구가 필요합니다. 손상되지 않은 인간 뉴런과 글리아를 틈새 시장으로부터 분리하는 것은 신선한 뇌 조직 샘플의 제한된 접근, 신경교 및 신경 세포의 심하게 상호 연결된 특성, 처리 중 필연적 인 세포 활성화로 인해 어려운 것으로 입증되었으며, 이들 모두는 이러한 세포 유형의 분자 특성화를 제한합니다 생체 외1 . 형광 활성화 핵 분류 (FANS)는 살아있는 세포 분류의 대안으로 등장하여 동결 된 조직에서 핵 집단의 해리 및 면역 태깅을 가능하게합니다. 지난 10 년 동안 FANS는 다양한 뇌 표본 및 해부학 적 영역1,2,3,4에서 인간 신경 (NeuN +) 핵 집단을 분리하고 분자적으로 특성화하는 데 널리 사용되었습니다.
그러나, 인간 피질로부터 특정 신경교세포 하위집단을 분리하기 위한 유사한 방법들이 제한되어, 정상 및 병든 조직 둘 다에서 성상세포 복잡성에 대한 이해에서 정교함의 상대적 부족으로 이어졌다. 이를 위해, 이전에 발표된 프로토콜이 FANS4를 사용하여 인간 뉴런 집단을 단리하기 위해 채택되었고, 삼중-항체 조합을 사용하여 성상세포(및 올리고덴드로아교세포 전구인자)를 풍부하게 하는 방법이 검증되었고, 휴지 및 반응성 조건 모두에서 성상세포를 포획하였다5. NeuN-분획에서 성상세포에 대해 특이적으로 농축하기 위해, 성상세포 집단에 걸쳐 차등적으로 발현되는 것으로 알려진 두 개의 전사 인자 중 하나인 PAX6 또는 SRY-box 전사 인자 9 (SOX9)6,7에 대한 항체를 사용하였다. PAX6는 발아 영역에서 방사상 신경교세포 유사 전구물질 내에서 초기 태아 발달 동안 고도로 발현되며, 신경발생 및 교형성8,9,10,11 뿐만 아니라 망막 신경세포 사양 12에도 기여한다. 성인에서, PAX6는 휴지 인간 성상세포(6)에서 차별적으로 과발현되고, 인간 간질 조직 성상세포(13)에서 신경교모세서 산성 단백질(GFAP)과 단백질 공동발현을 나타낸다.
이 프로토콜은 FANS에 의한 신피질 뉴런 및 성상세포 풍부 핵 집단의 동시 분리를 기술한다. 성인 피질로부터 수집된 신선한(고정되지 않은) 스냅-냉동(즉, 신선한-냉동된) 사후 조직은 먼저 기계적으로 그리고 화학적으로 해리된다. 수크로오스 구배에서 용해 및 초원심분리 후, 핵이 유지되는 동안 세포질 및 세포외 성분은 폐기된다. 그런 다음 핵을 원하는 표적 혈통에 상응하는 형광 접합된 핵 항체로 표지하고 FANS를 사용하여 분류한다. 이 접근법에 따라, 성상세포의 농축은 수집된 PAX6+NeuN-집단에서 입증되며, 표적화된 qPCR 패널뿐만 아니라 하류 핵 RNA 시퀀싱에 의해 모두 검증된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
개략적인 프로토콜에 따른 실험 설계는 몇 가지 생물학적 및 기술적 요인을 고려한 후에 마무리되어야 한다. 출발 조직 샘플은 신선-고정되지 않고 신선하게 동결되고, 바람직하게는 핵 회복을 최대화하기 위해 짧은 사후 수집 간격을 갖는다. 경험에 비추어 볼 때, 최대 24 시간의 PMI는 적절한 핵 회복을 가능하게합니다. 그러나, 12 h 이하의 PMI는 무손상 핵 회복을 최적화하기 위해 바람직하다. 신?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 마운트 시나이 (Mount Sinai)의 이칸 의과 대학 (Icahn School of Medicine)의 병리학 및 신경 외과 회원들에게 비 식별 뇌 조직 조달과 ISMMS의 유세포 측정 CORE에 대한 전문가의 조언을 구해 주신 것에 감사드립니다. 이 연구는 NIH RF1DA048810, R01NS106229, R03NS101581 (N.M.T.), R61DA048207 (S.A.까지)에 의해 부분적으로 자금을 지원받았다.
Materials
| 10x PBS pH 7.2 | Invitrogen | 70013073 | |
| ANTI-NEUN ANTIBODY CLONE A60 | Millipore | MAB377A5MI | mouse anti-NeuN conjugated to a fluorescent compound AF555 (excitation, 553 nm; emission, 568 nm) |
| ANTI-OLIG2 ANTIBODY CLONE 211 | Millipore | MABN50A4MI | mouse anti-OLIG2 conjugated to a fluorescent compound AF488 (excitation, 499 nm; emission, 520 nm) |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | BP9704-100 | |
| Bright-Line Counting Chamber | Hausser Scientific | 3110V | |
| Calcium Chloride Anhydrous | Fisher | C614-3 | |
| Cell Strainers, 40 µM | SP Scienceware | 136800040 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma | 43815-1G | |
| DNA Library Kit | Illumina, Nextera | FC-121–1030 | |
| DNAse I | Worthington | LS002139 | |
| Dounce Tissue Grinder | WHEATON | 357542 | |
| FACS Sorter | BD Biosciences | BD FACSAria III | |
| Magnesium Acetate Tetrahydrate | Fisher | M13-500 | |
| PAX6 (PAX6/496) – 100 TESTS | Novus | NBP234705J | |
| RNA Clean & Concentrator | Zymo Research | R1013 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico Input Mammalian | Clontech Laboratories | 635005 | Fragmentation time of 2.5 minutes, as recommended for low RIN RNA values. |
| Sucrose, crystal certified, ACS, 500 mg | Fisher | S5500 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure | Thermo Scientific | J22638AE | |
| TritonX-100 | Fisher | BP151-500 | non-ionic surfactant in lysis buffer |
| TRIzol LS Reagent | Invitrogen | 10296028 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | reagent for isolation of RNA |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Optima XE-100 | A94516 | |
| Ultracentrifuge tubes PP 9/16 X 3-1/2 | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure Distilled Water (RNAse-, DNAse-free) | Invitrogen | 10977023 | referred to as distilled water |
| Ultrapure EDTA | Life Technologies | 15576-028 |
Referências
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