Aislamiento de poblaciones adultas de astrocitos humanos de la corteza recién congelada utilizando la clasificación de núcleos activados por fluorescencia
Summary
Hemos desarrollado un método que enriquece y aísla poblaciones de astrocitos humanos a partir de tejido fresco congelado para su uso en análisis moleculares posteriores.
Abstract
La complejidad de los astrocitos humanos sigue estando mal definida en el tejido humano primario, requiriendo mejores herramientas para su aislamiento y caracterización molecular. La clasificación de núcleos activados por fluorescencia (FANS) se puede utilizar para aislar y estudiar con éxito las poblaciones de núcleos neuronales humanos (NeuN +) a partir de tejido de archivo congelado, evitando así problemas asociados con el manejo de tejido fresco. Sin embargo, faltan esfuerzos para aislar de manera similar la astroglía del elemento no neuronal (NeuN-). Una estrategia de inmunoetiquetado recientemente desarrollada y validada utiliza tres anticuerpos de factor de transcripción para aislar simultáneamente poblaciones de núcleos neuronales enriquecidos (NeuN+), astrocitos (proteína de caja pareada 6 (PAX6)+NeuN-) y progenitores de oligodendrocitos (OLIG2+NeuN-) de tejido neocórtex temporal humano no enfermo, fresco (no fijo) congelado al instante.
Esta técnica demostró ser útil para la caracterización de alteraciones del transcriptoma específico del tipo celular en neocórtex de epilepsia patológica primaria. Los análisis transcriptómicos confirmaron que las poblaciones clasificadas con PAX6 + NeuN- están sólidamente enriquecidas para marcadores de pan-astrocitos y capturan astrocitos tanto en condiciones de reposo como reactivas. Este artículo describe la metodología FANS para el aislamiento de poblaciones de núcleos enriquecidos con astrocitos de la corteza humana recién congelada, incluida la disociación de tejidos en suspensión de un solo núcleo (sn); inmunoetiquetado de núcleos con anticuerpos conjugados fluorescentemente anti-NeuN y anti-PAX6; Estrategias de cierre de FANS y métricas de control de calidad para optimizar la sensibilidad y la especificidad durante la clasificación y para confirmar el enriquecimiento de astrocitos; y la adquisición recomendada para la secuenciación de la accesibilidad al transcriptoma y la cromatina aguas abajo a resolución masiva o sn. Este protocolo es aplicable para especímenes corticales humanos no necróticos, recién congelados, con diversas patologías y recolección de tejido postmortem recomendada dentro de las 24 h.
Introduction
La complejidad molecular de los astrocitos humanos sigue estando mal definida en el tejido primario, requiriendo mejores herramientas para su aislamiento y caracterización a alta resolución, tanto en salud como en enfermedad. La separación de las neuronas y glías humanas intactas de su nicho ha demostrado ser difícil debido al acceso limitado de muestras de tejido cerebral fresco, la naturaleza fuertemente interconectada de los procesos gliales y neuronales, y la inevitable activación celular durante el procesamiento, todo lo cual limita la caracterización molecular de estos tipos de células ex vivo1 . La clasificación de núcleos activados por fluorescencia (FANS) ha surgido como una alternativa a la clasificación de células vivas, permitiendo la disociación e inmunoetiquetado de poblaciones de núcleos de tejido congelado. En la última década, FANS se ha utilizado ampliamente para aislar y caracterizar molecularmente poblaciones de núcleos neuronales humanos (NeuN +) en una variedad de especímenes cerebrales y regiones anatómicas 1,2,3,4.
Sin embargo, los métodos similares para aislar subpoblaciones específicas de núcleos gliales de la corteza humana han sido limitados, lo que lleva a una relativa falta de sofisticación en la comprensión de la complejidad de los astrocitos tanto en tejidos normales como enfermos. Para ello, se adaptó un protocolo previamente publicado para aislar poblaciones neuronales humanas utilizando FANS4, y se validó un método para enriquecer para astrocitos (y para progenitores oligodendrogliales) utilizando una combinación de triple anticuerpo, capturando astrocitos tanto en condiciones de reposo comoreactivas 5. Para enriquecer específicamente los astrocitos en la fracción NeuN-, se utilizaron anticuerpos contra uno de los dos factores de transcripción que se sabe que se expresan diferencialmente entre las poblaciones de astrocitos, PAX6 o factor de transcripción SRY-box 9 (SOX9)6,7. PAX6 se expresa altamente durante el desarrollo fetal temprano dentro de progenitores radiales similares a la glía en zonas germinales y contribuye tanto a la neurogénesis como a la gliogénesis 8,9,10,11, así como a la especificación neuronal retiniana12. En el adulto, PAX6 se sobreexpresa diferencialmente en astrocitos humanosen reposo 6 y muestra coexpresión proteica con proteína ácida fibrilar glial (GFAP) en astrocitos tisulares de epilepsia humana13.
Este protocolo describe el aislamiento simultáneo de poblaciones de núcleos neuronales y astrocitos neocorticales por FANS. El tejido postmortem fresco (no fijo) congelado al instante (es decir, fresco congelado) recolectado de la corteza adulta primero se disocia mecánica y químicamente. Después de la lisis y la ultracentrifugación en un gradiente de sacarosa, los componentes citoplasmáticos y extracelulares se descartan mientras que los núcleos se retienen. Los núcleos se etiquetan con anticuerpos nucleares conjugados fluorescentemente correspondientes a los linajes objetivo deseados y se clasifican utilizando FANS. Siguiendo este enfoque, el enriquecimiento de astrocitos se demuestra en las poblaciones PAX6 + NeuN- recolectadas, validado tanto por un panel de qPCR dirigido como por la secuenciación de ARN nuclear aguas abajo.
Protocol
Representative Results
Discussion
El diseño experimental siguiendo el protocolo esbozado debe finalizarse después de considerar varios factores biológicos y técnicos. Las muestras de tejido iniciales se congelan frescamente, sin haber sido fijadas, y preferiblemente tienen un corto intervalo de recolección post mortem para maximizar la recuperación de los núcleos. Según la experiencia, un PMI de hasta 24 h permite una adecuada recuperación de los núcleos; sin embargo, un PMI de 12 h o menos es preferible para optimizar la recuperación de núcl…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría agradecer a los miembros de Patología y Neurocirugía de la Escuela de Medicina Icahn en Mount Sinai por su ayuda con la adquisición de tejido cerebral no identificado y al CORE de Citometría de Flujo de ISMMS por el asesoramiento de expertos. El estudio fue parcialmente financiado por NIH RF1DA048810, R01NS106229, R03NS101581 (a N.M.T.) y R61DA048207 (a S.A.).
Materials
| 10x PBS pH 7.2 | Invitrogen | 70013073 | |
| ANTI-NEUN ANTIBODY CLONE A60 | Millipore | MAB377A5MI | mouse anti-NeuN conjugated to a fluorescent compound AF555 (excitation, 553 nm; emission, 568 nm) |
| ANTI-OLIG2 ANTIBODY CLONE 211 | Millipore | MABN50A4MI | mouse anti-OLIG2 conjugated to a fluorescent compound AF488 (excitation, 499 nm; emission, 520 nm) |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | BP9704-100 | |
| Bright-Line Counting Chamber | Hausser Scientific | 3110V | |
| Calcium Chloride Anhydrous | Fisher | C614-3 | |
| Cell Strainers, 40 µM | SP Scienceware | 136800040 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma | 43815-1G | |
| DNA Library Kit | Illumina, Nextera | FC-121–1030 | |
| DNAse I | Worthington | LS002139 | |
| Dounce Tissue Grinder | WHEATON | 357542 | |
| FACS Sorter | BD Biosciences | BD FACSAria III | |
| Magnesium Acetate Tetrahydrate | Fisher | M13-500 | |
| PAX6 (PAX6/496) – 100 TESTS | Novus | NBP234705J | |
| RNA Clean & Concentrator | Zymo Research | R1013 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico Input Mammalian | Clontech Laboratories | 635005 | Fragmentation time of 2.5 minutes, as recommended for low RIN RNA values. |
| Sucrose, crystal certified, ACS, 500 mg | Fisher | S5500 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure | Thermo Scientific | J22638AE | |
| TritonX-100 | Fisher | BP151-500 | non-ionic surfactant in lysis buffer |
| TRIzol LS Reagent | Invitrogen | 10296028 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | reagent for isolation of RNA |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Optima XE-100 | A94516 | |
| Ultracentrifuge tubes PP 9/16 X 3-1/2 | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure Distilled Water (RNAse-, DNAse-free) | Invitrogen | 10977023 | referred to as distilled water |
| Ultrapure EDTA | Life Technologies | 15576-028 |
Referências
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