Isolamento di popolazioni di astrociti umani adulti dalla corteccia appena congelata mediante selezione dei nuclei attivati dalla fluorescenza
Summary
Abbiamo sviluppato un metodo che arricchisce e isola le popolazioni di astrociti umani da tessuti freschi congelati per l’uso in analisi molecolari a valle.
Abstract
La complessità degli astrociti umani rimane scarsamente definita nel tessuto umano primario, richiedendo strumenti migliori per il loro isolamento e caratterizzazione molecolare. Lo smistamento dei nuclei attivati dalla fluorescenza (FANS) può essere utilizzato per isolare e studiare con successo le popolazioni di nuclei neuronali umani (NeuN +) dal tessuto d’archivio congelato, evitando così problemi associati alla manipolazione di tessuto fresco. Tuttavia, mancano sforzi per isolare in modo simile l’astroglia dall’elemento non neuronale (NeuN-). Una strategia di immunotagging recentemente sviluppata e convalidata utilizza tre anticorpi del fattore di trascrizione per isolare simultaneamente popolazioni di nuclei neuronali arricchiti (NeuN +), astrociti (paired box protein 6 (PAX6) + NeuN-) e oligodendrociti progenitori (OLIG2 + NeuN-) da tessuto temporale temporale umano postmortem non malato, fresco (non fisso) congelato a scatto.
Questa tecnica si è dimostrata utile per la caratterizzazione delle alterazioni del trascrittoma specifiche del tipo cellulare nella neocorteccia patologica primaria dell’epilessia. Le analisi trascrittomiche hanno confermato che le popolazioni selezionate pax6 + NeuN sono robustamente arricchite per i marcatori pan-astrocitari e catturano gli astrociti sia in condizioni di riposo che reattive. Questo articolo descrive la metodologia FANS per l’isolamento di popolazioni di nuclei arricchiti di astrociti dalla corteccia umana appena congelata, compresa la dissociazione dei tessuti in sospensione a nucleo singolo (sn); immunotagging di nuclei con anticorpi coniugati fluorescenti anti-NeuN e anti-PAX6; FANS gating strategie e metriche di controllo qualità per ottimizzare la sensibilità e la specificità durante lo smistamento e per confermare l’arricchimento degli astrociti; e l’approvvigionamento raccomandato per il sequenziamento dell’accessibilità del trascrittoma e della cromatina a valle alla risoluzione bulk o sn. Questo protocollo è applicabile per campioni corticali umani non necrotici, congelati freschi, con varie patologie e raccolta di tessuto post mortem raccomandata entro 24 ore.
Introduction
La complessità molecolare degli astrociti umani rimane scarsamente definita nel tessuto primario, richiedendo strumenti migliori per il loro isolamento e caratterizzazione ad alta risoluzione, sia in salute che in malattia. La separazione dei neuroni umani intatti e della glia dalla loro nicchia si è dimostrata difficile a causa dell’accesso limitato di campioni di tessuto cerebrale fresco, della natura fortemente interconnessa dei processi gliali e neuronali e dell’inevitabile attivazione cellulare durante l’elaborazione, che limitano la caratterizzazione molecolare di questi tipi di cellule ex vivo1 . Lo smistamento dei nuclei attivati dalla fluorescenza (FANS) è emerso come alternativa allo smistamento delle cellule vive, consentendo la dissociazione e l’immunotagging delle popolazioni di nuclei dal tessuto congelato. Negli ultimi dieci anni, FANS è diventato ampiamente utilizzato per isolare e caratterizzare molecolarmente le popolazioni di nuclei neuronali umani (NeuN +) in una varietà di campioni cerebrali e regioni anatomiche 1,2,3,4.
Tuttavia, metodi simili per isolare specifiche sottopopolazioni di nuclei gliali dalla corteccia umana sono stati limitati, portando a una relativa mancanza di sofisticazione nella comprensione della complessità degli astrociti sia nei tessuti normali che in quelli malati. A tal fine, un protocollo precedentemente pubblicato è stato adattato per isolare le popolazioni neuronali umane utilizzando FANS4 e un metodo è stato convalidato per arricchire gli astrociti (e per i progenitori oligodendrogliali) utilizzando una combinazione di tripli anticorpi, catturando gli astrociti sia in condizioni di riposo che reattive5. Per arricchire specificamente gli astrociti nella frazione NeuN-, sono stati utilizzati anticorpi contro uno dei due fattori di trascrizione noti per essere espressi in modo differenziale tra le popolazioni di astrociti, PAX6 o SRY-box transcription factor 9 (SOX9)6,7. PAX6 è altamente espresso durante lo sviluppo fetale precoce all’interno di progenitori radiali simili a glia nelle zone germinali e contribuisce sia alla neurogenesi e alla gliogenesi 8,9,10,11, sia alla specifica neuronale retinica12. Nell’adulto, PAX6 è differenzialmente sovraespresso negli astrociti umani a riposo6 e mostra co-espressione proteica con la proteina acida fibrillare gliale (GFAP) negli astrociti del tessuto epilettico umano13.
Questo protocollo descrive l’isolamento simultaneo di popolazioni di nuclei neocorticali neuronali e arricchiti di astrociti da parte di FANS. Il tessuto post-mortem fresco (non fissato) congelato a scatto (cioè fresco-congelato) raccolto dalla corteccia adulta viene prima dissociato meccanicamente e chimicamente. Dopo la lisi e l’ultracentrifugazione in un gradiente di saccarosio, i componenti citoplasmatici ed extracellulari vengono scartati mentre i nuclei vengono trattenuti. I nuclei vengono quindi etichettati con anticorpi nucleari coniugati fluorescentemente corrispondenti ai lignaggi bersaglio desiderati e ordinati utilizzando FANS. Seguendo questo approccio, l’arricchimento degli astrociti è dimostrato nelle popolazioni PAX6+ NeuN- raccolte, convalidate sia da un pannello qPCR mirato che dal sequenziamento dell’RNA nucleare a valle.
Protocol
Representative Results
Discussion
La progettazione sperimentale secondo il protocollo delineato dovrebbe essere finalizzata dopo aver considerato diversi fattori biologici e tecnici. I campioni di tessuto di partenza sono freschi di congelamento, senza essere stati fissati, e preferibilmente hanno un breve intervallo di raccolta post-mortem per massimizzare il recupero dei nuclei. Sulla base dell’esperienza, un PMI fino a 24 ore consente un adeguato recupero dei nuclei; tuttavia, un PMI di 12 ore o meno è preferibile per ottimizzare il recupero dei nucl…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ci piace ringraziare i membri in Patologia e Neurochirurgia presso la Icahn School of Medicine del Monte Sinai per l’aiuto con l’approvvigionamento di tessuto cerebrale de-identificato e la citometria a flusso CORE di ISMMS per la consulenza di esperti. Lo studio è stato parzialmente finanziato da NIH RF1DA048810, R01NS106229, R03NS101581 (a N.M.T.) e R61DA048207 (a S.A.).
Materials
| 10x PBS pH 7.2 | Invitrogen | 70013073 | |
| ANTI-NEUN ANTIBODY CLONE A60 | Millipore | MAB377A5MI | mouse anti-NeuN conjugated to a fluorescent compound AF555 (excitation, 553 nm; emission, 568 nm) |
| ANTI-OLIG2 ANTIBODY CLONE 211 | Millipore | MABN50A4MI | mouse anti-OLIG2 conjugated to a fluorescent compound AF488 (excitation, 499 nm; emission, 520 nm) |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | BP9704-100 | |
| Bright-Line Counting Chamber | Hausser Scientific | 3110V | |
| Calcium Chloride Anhydrous | Fisher | C614-3 | |
| Cell Strainers, 40 µM | SP Scienceware | 136800040 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma | 43815-1G | |
| DNA Library Kit | Illumina, Nextera | FC-121–1030 | |
| DNAse I | Worthington | LS002139 | |
| Dounce Tissue Grinder | WHEATON | 357542 | |
| FACS Sorter | BD Biosciences | BD FACSAria III | |
| Magnesium Acetate Tetrahydrate | Fisher | M13-500 | |
| PAX6 (PAX6/496) – 100 TESTS | Novus | NBP234705J | |
| RNA Clean & Concentrator | Zymo Research | R1013 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico Input Mammalian | Clontech Laboratories | 635005 | Fragmentation time of 2.5 minutes, as recommended for low RIN RNA values. |
| Sucrose, crystal certified, ACS, 500 mg | Fisher | S5500 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure | Thermo Scientific | J22638AE | |
| TritonX-100 | Fisher | BP151-500 | non-ionic surfactant in lysis buffer |
| TRIzol LS Reagent | Invitrogen | 10296028 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | reagent for isolation of RNA |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Optima XE-100 | A94516 | |
| Ultracentrifuge tubes PP 9/16 X 3-1/2 | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure Distilled Water (RNAse-, DNAse-free) | Invitrogen | 10977023 | referred to as distilled water |
| Ultrapure EDTA | Life Technologies | 15576-028 |
Referências
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