蛍光活性化核選別を用いた新鮮凍結皮質からの成人ヒトアストロサイト集団の単離
Summary
我々は、下流の分子分析に使用するために、ヒトアストロサイト集団を新鮮凍結組織から濃縮し、単離する方法を開発しました。
Abstract
ヒトアストロサイトの複雑さは、一次ヒト組織において十分に定義されていないままであり、それらの単離および分子特性評価のためのより良いツールを必要とする。蛍光活性化核ソーティング(FANS)は、凍結アーカイブ組織からヒトニューロン核(NeuN+)集団を首尾よく単離および研究するために使用され、それによって新鮮な組織の取り扱いに関連する問題を回避できる。しかし、同様にアストログリアを非ニューロン(NeuN-)元素から単離する努力は欠けている。最近開発され、検証された免疫タグ付け戦略は、3つの転写因子抗体を使用して、非罹患、新鮮(非固定)スナップ凍結死後ヒト側頭新皮質組織から、富化ニューロン(NeuN+)、アストロサイト(ペアボックスタンパク質6(PAX6)+NeuN-)、および希突起膠細胞前駆細胞前駆細胞(OLIG2+NeuN-)核集団を同時に単離する。
この技術は、原発性病理学的てんかん新皮質における細胞型特異的トランスクリプトーム変化の特性評価に有用であることが示された。トランスクリプトーム解析により、PAX6+NeuN-選別集団は汎アストロサイトマーカーに対してロバストに濃縮され、安静状態と反応性条件の両方でアストロサイトを捕捉することが確認された。この論文では、単一核(sn)懸濁液への組織解離を含む、新鮮な凍結ヒト皮質からアストロサイト富化核集団を単離するためのFANS方法論について説明します。抗NeuNおよび抗PAX6蛍光結合抗体による核の免疫タグ付け;FANSゲーティング戦略と品質管理メトリックは、選別中の感度と特異度を最適化し、アストロサイト濃縮を確認するためのものです。下流のトランスクリプトームおよびクロマチンアクセシビリティシーケンシング(バルクまたはsn分解能)の調達を推奨します。このプロトコルは、さまざまな病状および24時間以内に推奨される死後組織収集を伴う非壊死性、新鮮凍結、ヒト皮質標本に適用可能である。
Introduction
ヒトアストロサイトの分子的複雑さは、一次組織において依然として十分に定義されておらず、健康と疾患の両方において、高解像度での単離および特性評価のためのより良いツールを必要とする。新鮮な脳組織サンプルの限られたアクセス、グリアおよびニューロンプロセスの高度に相互接続された性質、および処理中の不可避の細胞活性化のために、無傷のヒトニューロンおよびグリアをそれらのニッチから分離することは困難であることが証明されており、これらはすべてex vivoでのこれらの細胞型の分子特性評価を制限する1.蛍光活性化核ソーティング(FANS)は、生細胞ソーティングの代替として登場し、凍結組織からの核集団の解離および免疫タグ付けを可能にしている。過去10年間で、FANSは、さまざまな脳標本および解剖学的領域におけるヒトニューロン(NeuN+)核集団を単離し、分子的に特徴付けるために広く使用されるようになった1,2,3,4。
しかしながら、ヒト皮質から特異的グリア核亜集団を単離するための同様の方法は限られており、正常組織と罹患組織の両方におけるアストロサイトの複雑さの理解において、比較的洗練されていない。この目的のために、以前に公開されたプロトコルがFANS4を使用してヒトニューロン集団を単離するために適合され、トリプル抗体の組み合わせを使用してアストロサイト(および希突起膠突起前駆細胞)について濃縮する方法が検証され、安静時および反応性条件の両方でアストロサイトを捕捉する5。NeuN−画分中のアストロサイトについて特異的に富化するために、アストロサイト集団全体で差次的に発現されることが知られている2つの転写因子のうちの1つ、PAX6またはSRY−box転写因子9(SOX9)6、7に対する抗体を使用した。PAX6は、胚帯の橈骨グリア様前駆細胞内で胎児の早期発育中に高発現し、神経新生および神経膠形成の両方に寄与する8、9、10、11ならびに網膜ニューロン仕様12に寄与する。成人において、PAX6は、安静時ヒトアストロサイト6において差次的に過剰発現し、ヒトてんかん組織アストロサイト13においてグリア線維性酸性タンパク質(GFAP)とのタンパク質共発現を示す。
このプロトコルは、FANSによる新皮質ニューロンおよびアストロサイト富化核集団の同時単離を記載している。成体皮質から収集された新鮮な(固定されていない)スナップ凍結(すなわち、新鮮な凍結)死後組織は、最初に機械的および化学的に解離される。スクロース勾配での溶解および超遠心分離の後、細胞質および細胞外成分は、核が保持されている間に廃棄される。次いで、核を所望の標的系統に対応する蛍光結合核抗体で標識し、FANSを用いて選別する。このアプローチに続いて、アストロサイトの濃縮が、標的 qPCR パネルと下流核 RNA シーケンシングの両方によって検証された、収集された PAX6+NeuN- 集団において実証されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
概説されたプロトコルに従った実験計画は、いくつかの生物学的および技術的要因を考慮した後に完成されるべきである。出発組織サンプルは、新鮮・凍結され、固定されていることなく、好ましくは核回収を最大化するために短い死後収集間隔を有する。経験に基づいて、最大24時間のPMIは適切な核回復を可能にする。ただし、無傷の核回収を最適化するには、12時間以下のPMIが好ましい。…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、シナイ山のアイカーン医科大学の病理学および脳神経外科のメンバーに、同定解除された脳組織の調達を支援してくれたこと、および専門家のアドバイスを求めるISMMSのフローサイトメトリーCOREに感謝します。この研究は、NIH RF1DA048810、R01NS106229、R03NS101581(N.M.T.へ)、およびR61DA048207(SAへ)から部分的に資金提供を受けた。
Materials
| 10x PBS pH 7.2 | Invitrogen | 70013073 | |
| ANTI-NEUN ANTIBODY CLONE A60 | Millipore | MAB377A5MI | mouse anti-NeuN conjugated to a fluorescent compound AF555 (excitation, 553 nm; emission, 568 nm) |
| ANTI-OLIG2 ANTIBODY CLONE 211 | Millipore | MABN50A4MI | mouse anti-OLIG2 conjugated to a fluorescent compound AF488 (excitation, 499 nm; emission, 520 nm) |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | BP9704-100 | |
| Bright-Line Counting Chamber | Hausser Scientific | 3110V | |
| Calcium Chloride Anhydrous | Fisher | C614-3 | |
| Cell Strainers, 40 µM | SP Scienceware | 136800040 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma | 43815-1G | |
| DNA Library Kit | Illumina, Nextera | FC-121–1030 | |
| DNAse I | Worthington | LS002139 | |
| Dounce Tissue Grinder | WHEATON | 357542 | |
| FACS Sorter | BD Biosciences | BD FACSAria III | |
| Magnesium Acetate Tetrahydrate | Fisher | M13-500 | |
| PAX6 (PAX6/496) – 100 TESTS | Novus | NBP234705J | |
| RNA Clean & Concentrator | Zymo Research | R1013 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico Input Mammalian | Clontech Laboratories | 635005 | Fragmentation time of 2.5 minutes, as recommended for low RIN RNA values. |
| Sucrose, crystal certified, ACS, 500 mg | Fisher | S5500 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure | Thermo Scientific | J22638AE | |
| TritonX-100 | Fisher | BP151-500 | non-ionic surfactant in lysis buffer |
| TRIzol LS Reagent | Invitrogen | 10296028 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | reagent for isolation of RNA |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Optima XE-100 | A94516 | |
| Ultracentrifuge tubes PP 9/16 X 3-1/2 | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure Distilled Water (RNAse-, DNAse-free) | Invitrogen | 10977023 | referred to as distilled water |
| Ultrapure EDTA | Life Technologies | 15576-028 |
Referências
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