Isolering av vuxna mänskliga astrocytpopulationer från färskfryst cortex med fluorescensaktiverad kärnsortering
Summary
Vi har utvecklat en metod som berikar för och isolerar humana astrocytpopulationer från färskfryst vävnad för användning i nedströms molekylära analyser.
Abstract
Komplexiteten hos humana astrocyter förblir dåligt definierad i primär mänsklig vävnad, vilket kräver bättre verktyg för deras isolering och molekylära karakterisering. Fluorescensaktiverad kärnsortering (FANS) kan användas för att framgångsrikt isolera och studera humana neuronala kärnor (NeuN+) populationer från frusen arkivvävnad och därigenom undvika problem i samband med hantering av färsk vävnad. Emellertid saknas ansträngningar för att på liknande sätt isolera astroglia från det icke-neuronala (NeuN-) elementet. En nyligen utvecklad och validerad immuntaggningsstrategi använder tre transkriptionsfaktorantikroppar för att samtidigt isolera berikade neuronala (NeuN+), astrocyt (parat lådprotein 6 (PAX6)+NeuN-) och oligodendrocytförfäder (OLIG2+NeuN-) kärnor från icke-sjuka, färska (ofixerade) snapfrysta human temporal neocortexvävnader.
Denna teknik visade sig vara användbar för karakterisering av celltypspecifika transkriptomförändringar vid primär patologisk epilepsi neocortex. Transkriptomiska analyser bekräftade att PAX6+NeuN-sorterade populationer är robust berikade för pan-astrocytmarkörer och fångar astrocyter under både vilande och reaktiva förhållanden. Detta dokument beskriver FANS-metoden för isolering av astrocytberikade kärnpopulationer från nyfryst mänsklig cortex, inklusive vävnadsdissociation till enkärnig (sn) suspension; immunotagging av kärnor med anti-NeuN och anti-PAX6 fluorescerande konjugerade antikroppar; FANS gating strategier och kvalitetskontroll mätvärden för att optimera känslighet och specificitet under sortering och för att bekräfta astrocytberikning; och rekommenderad upphandling för nedströms transkriptom- och kromatintillgänglighetssekvensering vid bulk- eller sn-upplösning. Detta protokoll är tillämpligt för icke-nekrotiska, färskfrysta, humana kortikala prover med olika patologier och rekommenderad vävnadsuppsamling efter döden inom 24 timmar.
Introduction
Den molekylära komplexiteten hos humana astrocyter förblir dåligt definierad i primär vävnad, vilket kräver bättre verktyg för deras isolering och karakterisering vid hög upplösning, både i hälsa och sjukdom. Separation av intakta mänskliga neuroner och glia från deras nisch har visat sig vara svårt på grund av begränsad tillgång till färska hjärnvävnadsprover, den starkt sammankopplade naturen hos glial- och neuronala processer och oundviklig cellulär aktivering under bearbetningen, som alla begränsar den molekylära karakteriseringen av dessa celltyper ex vivo1 . Fluorescensaktiverad kärnsortering (FANS) har dykt upp som ett alternativ till levande cellsortering, vilket möjliggör dissociation och immunotagging av kärnor från frusen vävnad. Under det senaste decenniet har FANS blivit allmänt använt för att isolera och molekylärt karakterisera mänskliga neuronala (NeuN+) kärnorpopulationer i en mängd olika hjärnprover och anatomiska regioner 1,2,3,4.
Liknande metoder för att isolera specifika glialkärnor subpopulationer från human cortex har dock begränsats, vilket leder till en relativ brist på sofistikering i förståelsen av astrocytkomplexitet i både normala och sjuka vävnader. För detta ändamål anpassades ett tidigare publicerat protokoll för att isolera humana neuronala populationer med hjälp av FANS4, och en metod validerades för att berika för astrocyter (och för oligodendrogliala förfäder) med hjälp av en trippel-antikroppskombination, som fångar astrocyter i både vilande och reaktiva förhållanden5. För att specifikt berika för astrocyter i NeuN-fraktionen användes antikroppar mot en av två transkriptionsfaktorer som är kända för att uttryckas differentiellt över astrocytpopulationer, PAX6 eller SRY-box transkriptionsfaktor 9 (SOX9)6,7. PAX6 uttrycks starkt under tidig fosterutveckling inom radiella glialiknande förfäder i germinalzoner och bidrar till både neurogenes och gliogenes 8,9,10,11 samt till retinal neuronal specifikation 12. Hos vuxna är PAX6 differentiellt överuttryckt i vilande humana astrocyter6 och visar proteinsamuttryck med glialfibrillärt surt protein (GFAP) i humana epilepsivävnadsastrocyter13.
Detta protokoll beskriver samtidig isolering av neokortikala neuronala och astrocytberikade kärnorpopulationer av FANS. Färsk (ofixerad) snapfryst (dvs. färskfryst) postmortemvävnad som samlats in från vuxen cortex dissocieras först mekaniskt och kemiskt. Efter lys och ultracentrifugering i en sackarosgradient kasseras de cytoplasmatiska och extracellulära komponenterna medan kärnorna behålls. Kärnor märks sedan med fluorescerande konjugerade kärnantikroppar som motsvarar de önskade mållinjerna och sorteras med hjälp av FANS. Efter detta tillvägagångssätt demonstreras anrikning av astrocyter i de insamlade PAX6 + NeuN-populationerna, validerade både av en riktad qPCR-panel och genom nedströms kärn-RNA-sekvensering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Experimentell design enligt det skisserade protokollet bör slutföras efter att ha beaktat flera biologiska och tekniska faktorer. Startvävnadsprover är färskfrysta, utan att ha fixats, och har helst ett kort insamlingsintervall efter döden för att maximera kärnåtervinningen. Baserat på erfarenhet möjliggör ett PMI på upp till 24 timmar tillräcklig kärnåtervinning; emellertid är ett PMI på 12 h eller mindre att föredra för att optimera intakt kärnåtervinning. Ytterligare faktorer förutom PMI, inklus…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka medlemmar i patologi och neurokirurgi vid Icahn School of Medicine vid Mount Sinai för hjälp med upphandling av avidentifierad hjärnvävnad och ISMMS: s Flow Cytometry CORE för expertråd. Studien finansierades delvis av NIH RF1DA048810, R01NS106229, R03NS101581 (till N.M.T.) och R61DA048207 (till S.A.).
Materials
| 10x PBS pH 7.2 | Invitrogen | 70013073 | |
| ANTI-NEUN ANTIBODY CLONE A60 | Millipore | MAB377A5MI | mouse anti-NeuN conjugated to a fluorescent compound AF555 (excitation, 553 nm; emission, 568 nm) |
| ANTI-OLIG2 ANTIBODY CLONE 211 | Millipore | MABN50A4MI | mouse anti-OLIG2 conjugated to a fluorescent compound AF488 (excitation, 499 nm; emission, 520 nm) |
| Bovine Serum Albumin | Fisher | BP9704-100 | |
| Bright-Line Counting Chamber | Hausser Scientific | 3110V | |
| Calcium Chloride Anhydrous | Fisher | C614-3 | |
| Cell Strainers, 40 µM | SP Scienceware | 136800040 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Invitrogen | D1306 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma | 43815-1G | |
| DNA Library Kit | Illumina, Nextera | FC-121–1030 | |
| DNAse I | Worthington | LS002139 | |
| Dounce Tissue Grinder | WHEATON | 357542 | |
| FACS Sorter | BD Biosciences | BD FACSAria III | |
| Magnesium Acetate Tetrahydrate | Fisher | M13-500 | |
| PAX6 (PAX6/496) – 100 TESTS | Novus | NBP234705J | |
| RNA Clean & Concentrator | Zymo Research | R1013 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| SMARTer Stranded Total RNA-Seq Kit Pico Input Mammalian | Clontech Laboratories | 635005 | Fragmentation time of 2.5 minutes, as recommended for low RIN RNA values. |
| Sucrose, crystal certified, ACS, 500 mg | Fisher | S5500 | |
| SW 41 Ti Swinging-Bucket Rotor | Beckman Coulter | 331362 | |
| Tris-HCl, 1M Solution, pH 8.0, Molecular Biology Grade, Ultrapure | Thermo Scientific | J22638AE | |
| TritonX-100 | Fisher | BP151-500 | non-ionic surfactant in lysis buffer |
| TRIzol LS Reagent | Invitrogen | 10296028 | |
| TRIzol Reagent | Invitrogen | 15596026 | reagent for isolation of RNA |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | 15250061 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter Optima XE-100 | A94516 | |
| Ultracentrifuge tubes PP 9/16 X 3-1/2 | Beckman Coulter | 331372 | |
| UltraPure Distilled Water (RNAse-, DNAse-free) | Invitrogen | 10977023 | referred to as distilled water |
| Ultrapure EDTA | Life Technologies | 15576-028 |
Referências
- Mitchell, A., Roussos, P., Peter, C., Tsankova, N., Akbarian, S. The future of neuroepigenetics in the human brain. Progress in Molecular Biology and Translational Science. 128, 199-228 (2014).
- Jiang, Y., Matevossian, A., Huang, H. S., Straubhaar, J., Akbarian, S. Isolation of neuronal chromatin from brain tissue. BMC Neuroscience. 9, 42 (2008).
- Akbarian, S., et al. The PsychENCODE project. Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).
- Matevossian, A., Akbarian, S. Neuronal nuclei isolation from human postmortem brain tissue. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (20), e914 (2008).
- Tome-Garcia, J., et al. Cell type-specific isolation and transcriptomic profiling informs glial pathology in human temporal lobe epilepsy. BioRxiv. , (2020).
- Zhang, Y., et al. Purification and characterization of progenitor and mature human astrocytes reveals transcriptional and functional differences with mouse. Neuron. 89 (1), 37-53 (2016).
- Sun, W., et al. SOX9 Is an astrocyte-specific nuclear marker in the adult brain outside the neurogenic regions. Journal of Neuroscience. 37 (17), 4493-4507 (2017).
- Manuel, M. N., Mi, D., Mason, J. O., Price, D. J. Regulation of cerebral cortical neurogenesis by the Pax6 transcription factor. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, 70 (2015).
- Sakurai, K., Osumi, N. The neurogenesis-controlling factor, Pax6, inhibits proliferation and promotes maturation in murine astrocytes. Journal of Neuroscience. 28 (18), 4604-4612 (2008).
- Zhong, S., et al. Decoding the development of the human hippocampus. Nature. 577 (7791), 531-536 (2020).
- Pollen, A., et al. Molecular identity of human outer radial glia during cortical development. Cell. 163 (1), 55-67 (2015).
- Cvekl, A., Callaerts, P. PAX6: 25th anniversary and more to learn. Experimental Eye Research. 156, 10-21 (2017).
- Goc, J., Liu, J. Y., Sisodiya, S. M., Thom, M. A spatiotemporal study of gliosis in relation to depth electrode tracks in drug-resistant epilepsy. European Journal of Neuroscience. 39 (12), 2151-2162 (2014).
- Monoranu, C. M., et al. pH measurement as quality control on human post mortem brain tissue: a study of the BrainNet Europe consortium. Neuropathology and Applied Neurobiology. 35 (3), 329-337 (2009).
- Ninkovic, J., et al. The transcription factor Pax6 regulates survival of dopaminergic olfactory bulb neurons via crystallin αA. Neuron. 68 (4), 682-694 (2010).
