Summary
Questo protocollo presenta una tecnica per sondare le interazioni proteina-proteina utilizzando perle donatrici legate al glutatione con co-chaperoni tPR fusi GST e perle accettori accoppiate con un peptide derivato da Hsp90. Abbiamo usato questa tecnica per lo screening di piccole molecole per interrompere le interazioni Hsp90-FKBP51 o Hsp90-FKBP52 e identificato inibitori di interazione Hsp90-FKBP51 potenti e selettivi.
Abstract
Il targeting delle interazioni con la proteina 90 (Hsp90)-cochaperone offre la possibilità di regolare specificamente i processi intracellulari Hsp90-dipendenti. Il pentapeptide MEEVD conservato al C-terminus di Hsp90 è responsabile dell'interazione con il motivo della ripetizione tetratricopeptidica (TPR) dei co-chaperoni. La proteina legante FK506 (FKBP) 51 e FKBP52 sono due co-chaperoni simili con motivo TPR coinvolti in malattie steroidee ormono-dipendenti con funzioni diverse. Pertanto, l'identificazione di molecole che bloccano specificamente le interazioni tra Hsp90 e FKBP51 o FKBP52 fornisce un potenziale terapeutico promettente per diverse malattie umane. Qui, descriviamo il protocollo per un saggio omogeneo di prossimità luminescente amplificato per sondare le interazioni tra Hsp90 e i suoi co-accompagnatori partner FKBP51 e FKBP52. In primo luogo, abbiamo purificato le proteine contenenti il motivo TPR FKBP51 e FKBP52 in forma di glutatione S-transferasi (GST). Utilizzando le perle donatrici legate al glutatione con proteine TPR-motif fuse GST e le perle accettori accoppiate con un peptide C-terminale 10 mer di Hsp90, abbiamo sondato le interazioni proteina-proteina in un ambiente omogeneo. Abbiamo utilizzato questo test per lo screening di piccole molecole per interrompere le interazioni Hsp90-FKBP51 o Hsp90-FKBP52 e identificato inibitori di interazione Hsp90-FKBP51 potenti e selettivi.
Introduction
Gli chaperoni molecolari contribuiscono all'omeostasi delle proteine, compreso il ripiegamento, il trasporto e la degradazione delle proteine. Regolano diversi processi cellulari e sono legati a numerose malattie come il cancro e le malattie neurodegenerative1. Heat shock protein 90 (Hsp90) è uno dei più importanti chaperoni la cui funzione dipende dai cambiamenti conformazionali guidati dall'idrolisi dell'ATP e dal legame con le proteine client mediate dai suoi co-chaperoni2. Nonostante un evidente potenziale di Hsp90 come bersaglio terapeutico, la messa a punto della sua funzione rappresenta una grande sfida. Esistono diversi inibitori di Hsp90 che prendono di mira la regione di legame con l'ATP N-terminale, che sono stati valutati in studi clinici, ma nessuno di essi è stato approvato per lacommercializzazione 3. A causa della mancanza di una tasca legante bendefinita 4, mirata alla regione C-terminale di Hsp90 ha avuto un successo limitato4. Recentemente, l'interruzione delle interazioni Hsp90-cochaperone da parte di piccole molecole è stata studiata come strategia alternativa5. Il targeting delle interazioni Hsp90-cochaperone non susciterebbe una risposta generale allo stress cellulare e offre la possibilità di regolare specificamente vari processi intracellulari. Il pentapeptide MEEVD conservato al C-terminus di Hsp90 è responsabile dell'interazione con il motivo della ripetizione tetratricopeptidica (TPR) dei co-chaperoni6. Delle 736 proteine contenenti motivi TPR annotate nel database delle proteine umane, ~ 20 diverse proteine interagiscono con Hsp90 tramite questo peptide7. Le molecole che competono per il legame peptidico MEEVD interromperebbero le interazioni tra Hsp90 e co-chaperoni contenenti un dominio TPR. Il sito di legame peptidico ha una struttura terziaria simile, ma l'omologia complessiva tra diversi domini del motivo TPR è relativamente bassa7, fornendo l'opportunità di identificare molecole specificamente in grado di bloccare le interazioni tra Hsp90 e particolari co-chaperoni del motivo TPR. Tra questi co-chaperoni del motivo TPR, la proteina legante FK506 (FKBP) 51 e FKBP52 sono regolatori della segnalazione del recettore dell'ormone steroideo (SHR) e coinvolti in diverse malattie steroidee ormono-dipendenti tra cui cancro, malattie legate allo stress, malattie metaboliche e morbo di Alzheimer8. Sebbene FKBP51 e FKBP52 condividano > somiglianza di sequenza dell'80%, le loro funzioni differiscono: FKBP52 è un regolatore positivo dell'attività SHR, mentre FKBP51 è un regolatore negativo nella maggior parte dei casi8. Pertanto, l'identificazione delle molecole, bloccando in particolare le interazioni tra Hsp90 e FKBP51 o FKBP52, fornisce un potenziale terapeutico promettente per le malattie correlate.
Unsaggio Luminescente Pomogeno A(AlphaScreen) è stato sviluppato per la prima volta nel 1994 da Ullman EF et al.9. Ora è ampiamente usato per rilevare diversi tipi di interazioni biologiche, come il peptide10, la proteina11, il DNA12, l'RNA13e lo zucchero14. In questa tecnica, ci sono due tipi di perle (diametro 200 nm), una è la perle donatrice e l'altra è la perle accettore. Le biomolecole sono immobilizzate su queste perle; le loro interazioni biologiche portano le perle del donatore e dell'accettore nelle vicinanze. A 680 nm, un fotosensibilizzatore nel cordone donatore illumina e converte l'ossigeno in ossigeno singoletto. Poiché l'ossigeno singoletto ha una vita breve, può diffondersi solo fino a 200 nm. Se il perle accettore è in prossimità, il suo derivato tiosseno reagisce con l'ossigeno singoletto generando chemiluminescenza a 370 nm. Questa energia attiva ulteriormente i fluorofori nello stesso perle accettore per emettere luce a 520-620 nm15. Se le interazioni biologiche vengono interrotte, il perno accettore e il perno donatore non possono raggiungere la vicinanza, con conseguente decadimento dell'ossigeno singoletto e segnale basso prodotto.
Qui descriviamo un protocollo che utilizza questa tecnica per lo screening di piccole molecole che inibiscono le interazioni tra co-chaperoni Hsp90 e TPR, in particolare FKBP51 e FKBP52. I 10 peptidi lunghi di amminoacidi corrispondenti a Hsp90 estremo C-terminus sono attaccati a perline accettori. I co-chaperoni TPR purificati con tag GST interagiscono con le perle di donatore legate al glutatione. Quando l'interazione tra peptidi derivati da Hsp90 e co-chaperoni del motivo TPR riunisce le perle, viene prodotto un segnale amplificato (Figura 1A). Se le piccole molecole schermate possono inibire le interazioni tra Hsp90 e co-chaperoni del motivo TPR, questo segnale amplificato sarà diminuito (Figura 1B). Il loro IC50 può essere calcolato mediante misurazione quantitativa. Questo protocollo può essere esteso a qualsiasi interazione di co-chaperone chaperone chaperone - TPR-motif ed è di grande importanza nello sviluppo di nuove molecole, bloccando in particolare l'interazione tra Hsp90 e FKBP51 o FKBP52.
Figura 1: Il principio di base di questo saggio. (A) GST-FKBP51 purificato interagisce con le perle donatrici legate al glutatione. I 10 peptidi lunghi di amminoacidi corrispondenti all'estremo C-terminus di Hsp90 sono attaccati alle perle accettori. L'interazione tra i peptidi derivati da Hsp90 e il dominio TPR di FKBP51 porta le perle del donatore e dell'accettore in prossimità. A 680 nm, un fotosensibilizzatore nel cordone donatore illumina e converte l'ossigeno in ossigeno singoletto. Il derivato tiossene sul perle accettore reagisce con l'ossigeno singoletto e genera chemiluminescenza a 370 nm. Questa energia attiva ulteriormente i fluorofori nello stesso perle accettore per emettere luce a 520-620 nm. (B) Quando piccole molecole inibiscono le interazioni tra Hsp90 e FKBP51, le perle del donatore e dell'accettore non possono raggiungere la prossimità. Quindi l'ossigeno singoletto con breve durata decade e non viene prodotto alcun segnale rilevabile. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Protocol
NOTA: una panoramica di questo protocollo è illustrata nella Figura 2.
1. Espressione e purificazione di GST-FKBP51 e GST-FKBP52 (Figura 2A)
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Plasmidi
NOTA: Ottenere cDNA cloni per FKBP51 umano (id clone: 5723416) e per FKBP52 umano (id clone: 7474554) dal consorzio IMAGE.- Amplificare il DNA umano FKBP51 mediante PCR con primer (in avanti; 5'GGATCCATGACTACTGATGAAGGT-3', inverso; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCCAC-3') contenenti sporgenze BamHI e XhoI e clonare in vettore pGEX6-1 nei siti di restrizione BamHI / XhoI.
- Amplificare il DNA umano FKBP52 mediante PCR con primer (in avanti; 5'-GAATTCATGAGAGCCGAGGAGATG-3', inverso; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCCAC-3') contenenti sporgenze EcoRI e XhoI e clonare in vettore pGEX6-2 nei siti di restrizione EcoRI / XhoI.
NOTA: Impostazione e condizioni della reazione PCR sono mostrate nella Tabella 1 e nella Tabella 2. - Verificare la sequenza inserita e trasformare i plasmidi nell'E. coli chimicamente competente secondo il protocollo di fabbricazione.
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Espressione e purificazione delle proteine
- Aggiungere 25 g di base di brodo di Luria (LB) in 1 L di acqua distillata per produrre la soluzione LB. Autoclave a 121 °C per 15 min. Dopo il raffreddamento, aggiungere 50 μg/mL di ampicillina.
- Prendere una colonia di batteri che esprimono GST-FKBP51 o GST-FKBP52 e mescolare con 500 μL di soluzione LB in un tubo da 1,5 ml. Vortice.
- Aggiungere la miscela di "1.2.2" in 1 L di soluzione LB nel matraccio Erlenmeyer coperto con un foglio di alluminio. Incubare il matraccio Erlenmeyer nello shaker durante la notte a 37 °C.
- Indurre l'espressione proteica aggiungendo 1 mM di isopropil-β-D-tiogalattoside (IPTG) al matraccio di Erlenmeyer e continuare l'incubazione per altre 2 ore.
- Per ottenere pellet di cella, centrifugare a 5.000 x g per 15 minuti. Rimuovere il surnatante.
NOTA: Il pellet cellulare può essere conservato a -20 °C. - Riaspendare i pellet di cella in 40 ml di PBS e sonicare 3 x 20 s sul ghiaccio. Aggiungere 1 mM PMSF, 1 mM EDTA e cocktail inibitore della proteasi (1 compressa) per prevenire la proteolisi.
- Centrifugare la sospensione per 30 min 50.000 x g per rimuovere i detriti cellulari e applicare il surnatante su una colonna GST-trap da 5 ml.
- Dopo aver lavato la colonna con 30 mL PBS, elute GST-FKBP51 e GST-FKBP52 con 5 mL di glutatione 10 mM in PBS.
- Concentrare le proteine su un'unità di centrifugazione da 15 mL 10.000 MWCO. Per rimuovere il glutatione libero, passare i concentrati attraverso la colonna PD-10 bilanciata con PBS 0,5x e concentrarsi nuovamente sul dispositivo di centrifuga filtrante.
- Raccogliere frazioni contenenti proteine. Verificare le proteine in SDS-PAGE e regolare le concentrazioni proteiche a 1 mg/ml.
NOTA: La resa proteica tipica è di 2-5 mg/L di coltura. La proteina può essere immagazzinata a -20 °C.
2. Accoppiamento del peptide C-terminale Hsp90 alle perle accettori (Figura 2B)
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Preparazione del peptide Hsp90
- Sintetizzare dieci peptidi aminoacidi NH2-EDASRMEEVD-COOH corrispondenti agli amminoacidi 714-724 dell'isoforma Hsp90 beta umana (UniProt ID: P08238) mediante un servizio di sintesi peptidica.
- Diluire il peptide Hsp90 in PBS alla concentrazione di 1 mg/mL.
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Preparazione per perle accettori
- Diluire le perle accettori non coniugate in PBS a 1 mg/mL di concentrazione e trasferirle in un tubo da 1,5 mL.
- Eseguire il lavaggio per centrifugazione a 16.000 x g per 15 min. Rimuovere con attenzione il surnatante.
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Coniugazione
- Impostare il rapporto tra pere e peptide come 10:1. Nel tubo da 1,5 mL contenente 1 mg di pellet di perle accettore (preparato come descritto sopra), aggiungere 1 mL di PBS (pH 7,4), 0,1 mg di peptide diluito, 1,25 μL di Tween-20, 10 μL di una soluzione da 400 mM di cianoboroidrato di sodio (NaBH3CN) in acqua.
ATTENZIONE: NaBH3CN è tossico; utilizzare un cappuccio e guanti per fumi. LasoluzionenaBH 3 CN deve essere preparata al momento. - Incubare per 24 ore a 37 °C con agitazione end-over-end (10-20 rpm) su uno shaker rotativo.
- Impostare il rapporto tra pere e peptide come 10:1. Nel tubo da 1,5 mL contenente 1 mg di pellet di perle accettore (preparato come descritto sopra), aggiungere 1 mL di PBS (pH 7,4), 0,1 mg di peptide diluito, 1,25 μL di Tween-20, 10 μL di una soluzione da 400 mM di cianoboroidrato di sodio (NaBH3CN) in acqua.
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Tempra di reazione e lavaggio delle pere
- Aggiungere 20 μL di soluzione 1 M Tris-HCl (pH 8,0) alla reazione per bloccare i siti non reazionati. Incubare per 1 ora a 37 °C.
- Centrifugare a 16.000 x g (o velocità massima) per 15 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante e risuspenare il pellet di perle in 1 mL di soluzione di Tris-HCl (100 mM, pH 8,0).
- Ripetere la fase di lavaggio tre volte.
- Dopo l'ultima centrifugazione, riconsegrega le perle a 1 mg/mL nel tampone di conservazione (1 mL di 0,5 × PBS con 0,01% di azide di sodio come conservante). Conservare la soluzione di perle accettore coniugate a 4 °C protetta dalla luce.
ATTENZIONE: l'azide di sodio è tossico; utilizzare un cappuccio e guanti per fumi.
3. Il test che sonda l'interazione tra GST-FKBP51 o GST-FKBP52 e il peptide C-terminale Hsp90 e l'inibizione con composti di piccola massa molecolare (Figura 2C)
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Proteine marcate con GST che interagiscono con le perine donatrici di glutatione
- Impostare le reazioni in piastre a 384 pozzi.
- Preparare la soluzione contenente 10 μg/mL di perle donatrici di glutatione in 0,5x PBS, pH 7,4.
NOTA: Dopo una conservazione prolungata, le perine si depositano e devono essere vorticose. - Aggiungere GST-FKBP51 o GST-FKBP52 a una concentrazione finale di 10 μg/mL.
- Incubare al buio a 25 °C per 10 min.
NOTA: In questa fase, le proteine con tag GST interagiranno con il glutatione attaccato alle perine. Per ogni pozzo verranno utilizzati 22,5 μL di questa miscela. La concentrazione dei partner vincolanti deve essere determinata empiricamente. Titolare GST-FKBP51 e GST-FKBP52 e scegliere la concentrazione che dà il segnale migliore.
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Aggiunta composta
- Effettuare diluizioni seriali di composti di prova in DMSO.
NOTA: le concentrazioni utilizzate sono in genere 10, 30, 100, 300, 1.000 e 3.000 μM. - Aggiungere 0,25 μL di DMSO (controllo negativo) o peptide C-terminale Hsp90 (controllo positivo, 30 μM) o composti in DMSO all'angolo di ciascun pozzettino della piastra. Utilizzare triplicati per ogni concentrazione di composti.
- Aggiungere 22,5 μL della soluzione contenente perle donatrici di glutatione con proteine marcate GST a ciascun pozzo.
- Agitare delicatamente il piatto con la mano ma accuratamente. Incubare al buio a 25 °C per 15 min.
NOTA: Durante questo periodo, i composti interagiranno con il dominio TPR nel sito di legame peptidico C-terminale Hsp90.
- Effettuare diluizioni seriali di composti di prova in DMSO.
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Aggiunta di perle accettori
- Diluire le perle accettori con peptide C-terminale Hsp90 collegato a 100 μg/mL in 0,5x PBS.
- Aggiungere 2,25 μL di perle accettori diluite a ciascun pozzo.
- Mescolare delicatamente ma accuratamente. Incubare al buio a 25 °C per 15 min.
NOTA: In questa fase, le perle del donatore e dell'accettore vengono portate in prossimità dalle interazioni proteina-peptide. Il volume finale della miscela di reazione è di 25 μL. Pertanto, le concentrazioni finali di composti vanno da 0,1 a 30 μM.
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Lettura targhe
NOTA: Leggere la piastra utilizzando un lettore di piastre impostato nella modalità pertinente.- Accendi lo strumento e apri il software
- Scegli il protocollo pertinente.
- Fare clic su Modifica mappa piastra e selezionare il benessere utilizzato nella piastra per la misurazione.
- Fare clic su Avanti per continuare ed eseguire il protocollo selezionato.
- Dopo la misurazione, fare clic su Mostra risultati per visualizzare i risultati.
- Esportare i dati.
4. Analisi dei dati
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Fattore Z' e rapporto segnale-sfondo (S/B)
- Calcolare il fattore Z' e il rapporto S/B per il saggio utilizzando la seguente equazione:
Z'=1-(3σpos+3σneg)/│μpos-μneg│16
S/B=μneg/pos μ
dove, σ e μ rappresentano le deviazioni standard e le medie dei controlli positivi (peptide C-terminale Hsp90, 30 μM) e negativi (DMSO), rispettivamente. Un fattore Z > 0,5 assicurerà che il test sia abbastanza robusto per lo screening. Per monitorare la sensibilità del test, è stato calcolato anche il rapporto S/B.
- Calcolare il fattore Z' e il rapporto S/B per il saggio utilizzando la seguente equazione:
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Curva dose-risposta e IC 50
NOTA: utilizzare l'analisi di regressione non lineare per adattare i dati degli inibitori PPI di Hsp90-cochaperones tramite software.- Creare una tabella dati XY nella finestra di dialogo Benvenuto e selezionare NumeriX e Immetti Y 3 (se triplicato) replicare i valori in colonne affiancate.
- Normalizzare i dati del segnale dei campioni al gruppo di controllo negativo. Importare i valori di concentrazione nella colonna X e i valori del segnale nella colonna Y.
- Fare clic su Analizza e scegliere Trasforma concentrazione (X) in Trasforma | Normalizza. Selezionate Trasforma in logaritmi.
NOTA: questo trasformerà la concentrazione in una scala di log. Se la tua concentrazione iniziale è zero, impostala su un numero molto piccolo che è effettivamente zero (ad esempio, 0,1 nM) per non perdere quei valori poiché il logaritmo di zero non è definito. - Fare clic su Analizza e scegliere Regressione non lineare (adattamento della curva) in Analisi XY, aprire Dose-Risposta-Inibizione e scegliere Log(inibitore) vs. risposta -- Pendenza variabile.
- Fare clic su OK per visualizzare i risultati (contenenti il valore IC50) e i grafici.
Figura 2: Schema di questo protocollo. (A) Espressione e purificazione di GST-FKBP51 e GST-FKBP52. (B) Accoppiamento del peptide C-terminale Hsp90 alle perle accettori. (C) Il saggio che sonda l'interazione tra GST-FKBP51 o GST-FKBP52 e il peptide C-terminale Hsp90. Inibizione con composti di piccola massa molecolare. Creato con BioRender.com Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Representative Results
Nel nostro test, il fattore Z e il rapporto S/B sono rispettivamente 0,82 e 13,35 (Figura 3A), dimostrando che il nostro test è robusto e affidabile per lo screening ad alto rendimento. L'abbiamo quindi usato per lo screening di piccoli composti di massa molecolare. La Figura 3B presenta l'inibizione dose-dipendente delle interazioni chaperone-cochaperone con una piccola molecola selezionata (D10). Le curve dose-risposta per D10 sono generate dall'analisi di regressione non lineare, sulla base della quale vengono calcolati i valori di IC50. D10 mostra un'inibizione dose-dipendente sia su Hsp90 - GST-FKBP51 che su Hsp90 - GST-FKBP52 I. Ma i valori di IC50 sono diversi: le sue interazioni IC50 per Hsp90 - GST-FKBP51 sono 65 nM, mentre, per le interazioni Hsp90 - GST-FKBP52, l'inibizione completa non è stata raggiunta con la più alta concentrazione di composti (100 μM), il suo IC50 è stimato > 30 μM. Questi risultati forniscono la prova che è possibile ottenere l'inibizione selettiva degli IPP Hsp90-HKBP51 o Hsp90-FKBP52 con piccole molecole (i domini TPR di FKBP51 e FKBP52 hanno un'identità di sequenza del 60% e > somiglianza di sequenza dell'80%), e questo test può essere applicato per questo screening.
Figura 3: Analisi e risultati delsaggio. (A) Fattore Z' e rapporto segnale-fondo (S/B) di questo saggio. I dati rappresentano segnali di (○) controllo positivo (peptide C-terminale Hsp90, 30 μM) e (●) controllo negativo (DMSO) da 48 pozzi. Un valore Z' di 0,82 e un rapporto S/B di 13,35 sono stati calcolati da queste due popolazioni di dati. (B) L'inibizione del composto selezionato (D10) sulle interazioni di Hsp90 con FKBP51 (●) o FKBP52 (○) in questo saggio. D10 inibisce Hsp90-FKBP51 o Hsp90-FKBP52 in modo dose-dipendente. Il suo IC50 è 65 nM per l'interazione Hsp90-FKBP51 ma superiore a 30 μM per l'interazione Hsp90-FKBP52. I dati vengono normalizzati al gruppo di controllo ed espressi come mezzi ± SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Componente di reazione | Volume (μL) |
| Tampone PCR (5 x concentrato) | 4 |
| Primer in avanti | 1 |
| Primer inverso | 1 |
| Plasmide | 0.5 |
| Miscela dNTP (10 mM ciascuna) | 0.5 |
| Phusion DNA polimerasi | 0.5 |
| Acqua (grado DNA) | 12.5 |
| Totale | 20 |
Tabella 1: Reazione PCR impostata per l'amplificazione del DNA FKBP51 e FKBP52 umano.
| Palco | Temperatura (°C) | Ore | Cicli |
| Denaturazione iniziale | 94 | 3 minuti | 1 |
| Denaturazione | 94 | 30 secondi | 35 |
| Ricottura | 56 | 30 secondi | |
| Estensione | 72 | 1 min | |
| Estensione finale | 72 | 5 minuti | 1 |
| Nota: la temperatura del coperchio è di 105 °C. |
Tabella 2: Condizioni del termociatore per l'amplificazione del DNA FKBP51 e FKBP52 umano.
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Discussion
Qui descriviamo un protocollo che utilizza il test per lo screening di piccole molecole che inibiscono le interazioni tra I co-chaperoni Hsp90 e TPR, in particolare FKBP51 e FKBP52. Il suo punteggio Z' elevato (>0,8) dimostra la robustezza e l'affidabilità per un formato ad alto throughput. I risultati possono essere ottenuti entro un'ora e sono necessarie piccole quantità di perle, proteine e composti. Inoltre, questo protocollo potrebbe essere facilmente esteso a qualsiasi interazione di co-chaperone Hsp90/Hsp70 - TPR-motif di interesse. Diversi co-chaperoni del motivo TPR di Hsp90 sono stati implicati in vari disturbi umani che vanno dal morbo di Alzheimer alle malattie autoimmuni, al cancro, ecc. Il protocollo qui descritto fornisce un test in vitro robusto e poco costoso per lo screening ad alto rendimento di piccole molecole che inibiscono le interazioni chaperone-cochaperone di elevata importanza medica.
Inoltre, i farmaci che prendono di mira i domini TPR e inibiscono l'interazione con Hsp90 devono essere valutati non solo per la loro affinità verso il bersaglio, ma anche per la loro selettività verso altre proteine TPR-motif. Il genoma umano codifica > 20 proteine del motivo TPR in grado di interagire con il peptide C-terminale Hsp90. Questo test che utilizza perle di glutatione e proteine marcate con GST consente di valutare l'effetto del farmaco su più partner TPR leganti. Il nostro laboratorio possiede una libreria di 20 proteine TPR umane nella loro forma marcata GST e può ottenere profili di affinità e selettività per ogni piccola molecola testata.
È stato precedentemente dimostrato che il PPI tra I co-chaperoni Hsp90 e TPR è mediato dal peptide C-terminale di Hsp90; la cancellazione di Hsp90 C-terminus abolisce completamente il legame dei co-chaperonidel motivoTPR 6 . Abbiamo scoperto che i composti efficienti nel nostro test in cui è stato utilizzato il peptide C-terminale Hsp90 sono stati anche in grado di inibire l'interazione di Hsp90 a lunghezza intera con GST-FKBP51/52 in un test pull-down utilizzando perline di sefarosio glutatione (dati non mostrati). Alcuni dei composti selezionati mostrano anche l'affinità di legame con FKBP51 mediante la tecnologia di risonanza plasmonica di superficie, e i loro specifici siti di legame determinati dalla co-cristallizzazione sono attualmente in fase di studio.
Un passo fondamentale nel nostro protocollo è l'ordine di aggiunta; per prima cosa formiamo un complesso tra una piccola molecola e il suo bersaglio TPR. Se sono già stati formati complessi tra FKBP51 e Hsp90 C-terminale peptide, sono necessari tempi di incubazione più lunghi e concentrazioni più elevate di composti farmacologici per rompere gli IPP. Ciò è dovuto principalmente all'ostacolo sterico del perlo che limita l'accesso delle molecole al sito di interazione.
È possibile accoppiare covalentemente proteine TPR e peptidi C-terminali Hsp90 rispettivamente a perle donatori e accettori e sondare direttamente gli IPP. Tuttavia, non è consigliabile attaccare covalentemente entrambi i partner leganti alle perle a causa del ridotto movimento delle molecole in soluzione che influenzano la cinetica delle interazioni. Ciò aumenta anche il rischio di ostacolo sterico a causa delle dimensioni del perlo. Pertanto, scegliamo perline accettori accoppiate con peptide C-terminale Hsp90 e perle donatrici di glutatione che interagiscono con proteine marcate GST nel nostro test, dove possono essere valutati più partner TPR.
In questo test, è probabile che alcuni composti identificati possano essere falsi positivi a causa della loro interferenza con la tecnologia di analisi, come la tempra dell'ossigeno singoletto, la tempra della luce e la diffusione della luce. I risultati falsi positivi possono anche essere indotti interrompendo il legame del tag GST con le pere dei donatori di glutatione. Questi risultati falsi positivi possono essere evitati quando si va lo screening delle molecole sia su PID Hsp90-FKBP51 che Hsp90-FKBP52 per identificare inibitori selettivi. Altri metodi di rilevamento degli IPP dovrebbero essere applicati anche per verificare gli inibitori selezionati.
Il limite del nostro test è che non può essere utilizzato per rilevare l'interazione tra Hsp90 e co-chaperoni del motivo TPR in campioni biologici grezzi, come i lasati cellulari. Dopo lo screening ad alto rendimento, le inibizioni di composti selezionati su PPI co-chaperoni Hsp90 - TPR-motif in campioni biologici devono essere verificate con altri metodi, come la co-immunoprecipitazione e il test di legatura di prossimità.
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Disclosures
Gli autori non segnalano conflitti di interesse.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni del Consiglio svedese della ricerca (2018-02843), Brain Foundation (Fo 2019-0140), Foundation for Geriatric Diseases presso Karolinska Institutet, Gunvor and Josef Anérs Foundation, Magnus Bergvalls Foundation, Gun and Bertil Stohnes Foundation, Tore Nilssons Foundation for medical research, Margaretha af Ugglas foundation e Foundation for Old Servants.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 384-well plates | Perkin Elmer | 6008350 | Assay volume 25 ml |
| Amicon 10.000 MWCO centrifugation unit | Millipore | UFC901008 | Concentrate protein |
| Ampicillin | Sigma | A0166 | Antibiotics |
| Bacteria shaker Unimax 1010 | Heidolph | Culture bacteria | |
| cDNA clones for human FKBP51 | Source BioScience | clone id: 5723416 | pCMV-SPORT6 vector |
| cDNA clones for human FKBP52 | Source BioScience | clone id: 7474554 | pCMV-SPORT6 vector |
| Chemically Competent E. coli | Invitrogen | C602003 | One Shot BL21 Star (DE3) |
| Data analysis software | GraphPad Prism | 9.0.0 | Analysis data and make figures |
| Data analysis software | Excel | Analysis data | |
| DMSO | Supelco | 1.02952.1000 | Dilute compounds |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | Prepare solution |
| EDTA | Calbiochem | 344504 | Prevent proteolysis during sonication |
| Glutathione | Sigma | G-4251 | Elute GST-tagged proteins |
| Glutathione donor beads | Perkin Elmer | 6765300 | Donor bead |
| GST-trap column | Cytiva (GE Healthcare) | 17528201 | Purify GST-tagged proteins |
| Isopropyl-β-D-thiogalactoside | Thermo Fisher Scientific | R0392 | Induce protein expression |
| LB Broth (Miller) | Sigma | L3522 | Microbial growth medium |
| PCR instrument | BIO-RAD | S1000 Thermal Cycler | Amplification/PCR |
| PD-10 column | Cytiva (GE Healthcare) | 17085101 | Solution exchange |
| pGEX-6P-1 vector | Cytiva (GE Healthcare) | 28954648 | Plasmid |
| pGEX-6P-2 vector | Cytiva (GE Healthcare) | 28954650 | Plasmid |
| Plate reader | Perkin Elmer | EnSpire 2300 Multilabel Reader | Read alpha plate |
| Plate reader software | Perkin Elmer | EnSpire Manager | Plate reader software |
| Plate reader software protocol | Perkin Elmer | Alpha 384-well Low volume | Use this protocol to read plate |
| PMSF | Sigma | P7626 | Prevent proteolysis during sonication |
| protease inhibitor cocktail | Sigma | S8830 | Prevent proteolysis during sonication |
| Sodium azide | Sigma | S2002 | As a preservative |
| Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) | Sigma | 156159 | Activates matrix for coupling |
| Ten amino acid peptide NH2-EDASRMEEVD-COOH corresponding to amino acids 714-724 of human Hsp90 beta isoform | Peptide 2.0 inc | Synthesize Hsp90 C-terminal peptide | |
| Test-Tube Rotator | LABINCO | Make end-over-end agitation | |
| Tris-HCl | Sigma | 10708976001 | Block unreacted sites of acceptor beads |
| Tween-20 | Sigma | P1379 | Prevent beads aggregation |
| Ultra centrifuge Avanti J-20 XP | Beckman Coulter | Centrifuge to get bacteria cell pellets | |
| Ultrasonic cell disruptor | Microson | Sonicate cells to release protein | |
| Unconjugated acceptor beads | Perkin Elmer | 6762003 | Acceptor beads |
| XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module | Invitrogen | EI0002 | SDS-PAGE |
References
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