Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Studier av förkläde-cokaperoninteraktioner med homogen pärlbaserad analys

Published: July 21, 2021 doi: 10.3791/62762
Automatic Translation
1, 1, 1,2, 1,3, 1
1Department of Neuroscience Care and Society, Division of Neurogeriatrics, Karolinska Institutet, 2Department of Pharmaceutical Engineering & Technology, Indian Institute of Technology (BHU), 3Theme Inflammation and Aging, Karolinska University Hospital

Summary

Detta protokoll presenterar en teknik för sondering protein-protein interaktioner med glutation-kopplade donator pärlor med GST-smälta TPR-motiv co-chaperones och acceptor pärlor i kombination med en Hsp90-härledda peptid. Vi har använt denna teknik för att screena små molekyler för att störa Hsp90-FKBP51 eller Hsp90-FKBP52 interaktioner och identifierat potenta och selektiva Hsp90-FKBP51 interaktionshämmare.

Abstract

Inriktning på värmechockprotein 90 (Hsp90)-cochaperone interaktioner ger möjlighet att specifikt reglera Hsp90-beroende intracellulära processer. Den bevarade MEEVD pentapeptiden vid C-ändstationen i Hsp90 är ansvarig för interaktionen med tetratricopeptidrepetitionsmotivet (TPR) av co-chaperones. FK506-bindande protein (FKBP) 51 och FKBP52 är två liknande TPR-motiv co-chaperones inblandade i steroidhormon-beroende sjukdomar med olika funktioner. Att identifiera molekyler som specifikt blockerar interaktioner mellan Hsp90 och FKBP51 eller FKBP52 ger därför en lovande terapeutisk potential för flera mänskliga sjukdomar. Här beskriver vi protokollet för en förstärkt luminescent närhet homogen analys för sond interaktioner mellan Hsp90 och dess partner co-chaperones FKBP51 och FKBP52. För det första har vi renat TPR-motivinnehållande proteiner FKBP51 och FKBP52 i glutation S-transferase (GST)-märkt form. Med hjälp av glutation-kopplade donatorpärlor med GST-smälta TPR-motiv proteiner och acceptor pärlor i kombination med en 10-mer C-terminal peptid av Hsp90, har vi sonderat protein-protein interaktioner i en homogen miljö. Vi har använt denna analys för att screena små molekyler för att störa Hsp90-FKBP51 eller Hsp90-FKBP52 interaktioner och identifierat potenta och selektiva Hsp90-FKBP51 interaktionshämmare.

Introduction

Molekylära förkläde bidrar till proteinhomeostas, inklusive proteinveckning, transport och nedbrytning. De reglerar flera cellulära processer och är kopplade till många sjukdomar som cancer och neurodegenerativa sjukdomar1. Värmechockprotein 90 (Hsp90) är ett av de viktigaste förklädena vars funktion är beroende av konformationsförändringar som drivs av ATP-hydrolys och bindning med klientproteiner medierade av dess co-chaperones2. Trots en uppenbar potential hos Hsp90 som terapeutiskt mål, finjusterar dess funktion representerar en stor utmaning. Det finns flera Hsp90-hämmare riktade mot N-terminal ATP-bindningsregionen, som har utvärderats i kliniska prövningar, men ingen av dem har godkänts för marknadsföring3. På grund av bristen på en väldefinierad ligand-bindandeficka 4, inriktning på C-terminal regionen Hsp90 har haft begränsad framgång4. Nyligen har störningar av Hsp90-cochaperone interaktioner av små molekyler undersökts som en alternativ strategi5. Att rikta in sig på Hsp90-cochaperone interaktioner skulle inte framkalla allmänna cell stress svar och ger möjlighet att specifikt reglera olika intracellulära processer. Den bevarade MEEVD pentapeptiden vid C-ändstationen i Hsp90 är ansvarig för interaktionen med tetratricopeptidrepetitionsmotivet (TPR) av co-chaperones6. Av de 736 TPR-motivinnehållande proteinerna som kommenteras i den mänskliga proteindatabasen interagerar ~ 20 olika proteiner med Hsp90 via denna peptid7. Molekyler som konkurrerar om MEEVD-peptidbindning skulle störa interaktionerna mellan Hsp90 och co-chaperones som innehåller en TPR-domän. Peptidbindningsstället har liknande tertiär struktur men den övergripande homologin mellan olika TPR-motivdomäner är relativtlåg 7, vilket ger en möjlighet att identifiera molekyler som specifikt kan blockera interaktioner mellan Hsp90 och vissa TPR-motiv co-chaperones. Bland dessa TPR-motiv co-chaperones, FK506-bindande protein (FKBP) 51 och FKBP52 är regulatorer av steroidhormon receptorn (SHR) signalering och inblandade i flera steroidhormon-beroende sjukdomar inklusive cancer, stressrelaterade sjukdomar, metabola sjukdomar, och Alzheimers sjukdom8. Även om FKBP51 och FKBP52 delar > 80% sekvenslikhet, skiljer sig deras funktioner: FKBP52 är en positiv regulator för SHR-aktivitet, medan FKBP51 i de flesta fall är en negativ regulator8. Att identifiera molekyler, som specifikt blockerar interaktioner mellan Hsp90 och FKBP51 eller FKBP52, ger därför en lovande terapeutisk potential för relaterade sjukdomar.

Enmplified Luminescent Proximity Homogen Assay (AlphaScreen) utvecklades först 1994 av Ullman EF et al.9. Nu används det ofta för att upptäcka olika typer av biologiska interaktioner, såsom peptid10, protein11,DNA12,RNA13, och socker14. I denna teknik finns det två typer av pärlor (diameter 200 nm), en är donatorplädren och den andra är acceptorpläd. Biomolekylerna är immobiliserade på dessa pärlor; deras biologiska interaktioner för donator- och acceptorpärlor i närheten. Vid 680 nm lyser en ljuskänslig i donatorpärlan upp och omvandlar syre till singlet syre. Eftersom singlet syre har en kort livslängd, det kan bara diffusa upp till 200 nm. Om acceptorpärlan är i närheten reagerar dess tiooxenderivat med singlet syre som genererar chemiluminescens vid 370 nm. Denna energi aktiverar ytterligare fluorforer i samma acceptorpläde för att avge ljus vid 520-620 nm15. Om de biologiska interaktionerna störs kan acceptorpläd och donatorplädla inte nå närheten, vilket resulterar i singlet syreförfall och lågproducerad signal.

Här beskriver vi ett protokoll med denna teknik för screening av små molekyler som hämmar interaktioner mellan Hsp90 och TPR co-chaperones, särskilt FKBP51 och FKBP52. De 10 aminosyra långa peptiderna som motsvarar Hsp90 extrema C-ändstation är fästa vid acceptorpärlor. Renade GST-märkta TPR-co-chaperones interagerar med glutation-länkade donatorpärlor. När interaktionen mellan Hsp90-härledda peptider och TPR-motiv co-chaperones för samman pärlor, produceras en förstärkt signal (Figur 1A). Om de screenade små molekylerna kan hämma interaktionerna mellan Hsp90- och TPR-motivsamförkläde, kommer denna förstärkta signal att minskas (figur 1B). Deras IC50 kan beräknas genom kvantitativ mätning. Detta protokoll kan utvidgas till alla förkläde - TPR-motiv samförkläde interaktioner av intresse och är av stor betydelse i utvecklingen av nya molekyler, specifikt blockerar interaktionen mellan Hsp90 och FKBP51 eller FKBP52.

Figure 1
Figur 1: Den grundläggande principen i dennaanalys. (A) Renad GST-FKBP51 interagerar med glutation-kopplade donatorpärlor. De 10 aminosyra långa peptiderna som motsvarar den extrema C-ändstationen av Hsp90 är fästa vid acceptorpärlor. Interaktionen mellan Hsp90-härledda peptider och TPR-domänen i FKBP51 för donatorn och acceptorpärlor i närheten. Vid 680 nm lyser en ljuskänslig i donatorpärlan upp och omvandlar syre till singlet syre. Tiooxenderivatet på acceptorpärlan reagerar med singlet syre och genererar chemiluminescens vid 370 nm. Denna energi aktiverar ytterligare fluorforer i samma acceptorpläde för att avge ljus vid 520-620 nm. B)När små molekyler hämmar samspelet mellan Hsp90 och FKBP51 kan donatorn och acceptorpärlorna inte nå närheten. Sedan sönderfaller singlet syret med kort livslängd, och ingen detekterbar signal produceras. Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

En översikt över detta protokoll visas i figur 2.

1. Uttryck och rening av GST-FKBP51 och GST-FKBP52 (figur 2A)

  1. Plasmider
    OBS: Skaffa cDNA-kloner för human FKBP51 (klon-ID: 5723416) och för human FKBP52 (klon-ID: 7474554) från IMAGE-konsortiet.
    1. Förstärk det mänskliga FKBP51-DNA:t med PCR med primers (framåt; 5 'GGATCCATGACTACTGATGAAGGT-3', omvänd; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCCAC-3') som innehåller BamHI- och XhoI-överhäng och klonas till pGEX6-1-vektor vid BamHI / XhoI-begränsningsplatser.
    2. Förstärk det mänskliga FKBP52-DNA:t med PCR med primers (framåt; 5'-GAATTCATGACAGCCGAGGAGATG-3', omvänd; 5'-CTCGAGCTATGCTTCTGTCTCCAC-3') som innehåller EcoRI- och XhoI-överhäng och klonas till pGEX6-2-vektor på EcoRI / XhoI-begränsningsplatser.
      OBS: PCR-reaktionsuppsättning och villkor visas i tabell 1 och tabell 2.
    3. Kontrollera den infogade sekvensen och omvandla plasmiderna till den kemiskt kompetenta E. coli enligt tillverkningsprotokollet.
  2. Proteinuttryck och rening
    1. Tillsätt 25 g Luriabuljongbas (LB) i 1 L destillerat vatten för att göra LB-lösningen. Autoklav den vid 121 °C i 15 min. Efter kylning, tillsätt 50 μg/mL ampicillin.
    2. Ta en koloni av bakterier som uttrycker GST-FKBP51 eller GST-FKBP52 och blanda med 500 μL LB-lösning i ett 1,5 ml-rör. Vortex.
    3. Tillsätt blandningen av "1.2.2" i 1 L LB-lösning i Erlenmeyerkolven täckt med en aluminiumfolie. Inkubera Erlenmeyerkolven i skakapparaten över natten vid 37 °C.
    4. Inducera proteinuttryck genom att tillsätta 1 mM isopropyl-β-D-thiogalactoside (IPTG) till Erlenmeyerkolven och fortsätta inkubationen i ytterligare 2 timmar.
    5. För att få cellpellets, centrifug vid 5000 x g i 15 min. Ta bort supernaten.
      OBS: Cellpelletsen kan förvaras vid -20 °C.
    6. Återanvänd cellpelletsen i 40 ml PBS och sonicate 3 x 20 s på is. Tillsätt 1 mM PMSF, 1 mM EDTA och proteashämmarcocktail (1 tablett) för att förhindra proteolys.
    7. Centrifugera suspensionen i 30 min 50 000 x g för att ta bort cellskräp och applicera supernaten på 5 ml GST-fälla.
    8. Efter tvättning av kolonnen med 30 ml PBS, elute GST-FKBP51 och GST-FKBP52 med 5 ml 10 mM glutation i PBS.
    9. Koncentrera proteinerna på 15 ml 10 000 MWCO centrifugeringsenhet. För att ta bort fri glutation, passera koncentrat genom PD-10 kolumn jämvikt med 0,5x PBS och koncentrera igen på filter centrifugeringsanordningen.
    10. Samla in proteinhaltiga fraktioner. Kontrollera proteinerna i SDS-PAGE och justera proteinkoncentrationerna till 1 mg/ml.
      OBS: Typisk proteinutbyte är 2-5 mg/L kultur. Proteinet kan förvaras vid -20 °C.

2. Koppling av Hsp90 C-terminalpeptid till acceptorpärlorna (Figur 2B)

  1. Hsp90 peptidberedning
    1. Syntetisera tio aminosyrapeptid NH2-EDASRMEEVD-COOH motsvarande aminosyror 714-724 av human Hsp90 betaisoform (UniProt ID: P08238) av en peptidsyntestjänst.
    2. Späd Hsp90-peptiden i PBS till 1 mg/ml koncentration.
  2. Acceptorpärlor förberedelse
    1. Späd ut de okonjugerade acceptorpärlorna i PBS till 1 mg/ml koncentration och överför till ett 1,5 ml-rör.
    2. Utför tvättningen med centrifugering vid 16 000 x g i 15 min. Ta försiktigt bort supernaten.
  3. Konjugation
    1. Ställ in förhållandet mellan pärlor och peptid som 10:1. I 1,5 ml-röret som innehåller 1 mg acceptorpärlapellet (framställd enligt beskrivningen ovan) tillsätt 1 ml PBS (pH 7.4), 0,1 mg utspädd peptid, 1,25 μL tween-20, 10 μL av en 400 mM lösning av natriumcyanoborohydrid (NaBH3CN) i vatten.
      VARNING: NaBH3CN är giftigt; använd en rökhuv och handskar. NaBH3CN-lösningen ska beredas ny.
    2. Inkubera i 24 timmar vid 37 °C med end-over-end agitation (10-20 rpm) på en roterande skakapparat.
  4. Reaktionssläckande och pärlor tvätt
    1. Tillsätt 20 μL 1 M Tris-HCl (pH 8.0) lösning på reaktionen för att blockera oredovisade platser. Inkubera i 1 timme vid 37 °C.
    2. Centrifugera vid 16 000 x g (eller högsta hastighet) i 15 minuter vid 4 °C. Ta bort supernatanten och återanvänd pärlpellet i 1 ml Tris-HCl-lösning (100 mM, pH 8,0).
    3. Upprepa tvättsteget tre gånger.
    4. Efter den sista centrifugeringen, återanvända pärlor vid 1 mg/ml i lagringsbuffert (1 ml 0,5 × PBS med 0,01% natriumazid som konserveringsmedel). Förvara den konjugerade acceptorplädlösningen vid 4 °C ljusskyddad.
      VARNING: Natriumazid är giftigt; använd en rökhuv och handskar.

3. Analysen undersöker interaktionen mellan GST-FKBP51 eller GST-FKBP52 och Hsp90 C-terminalpeptid och hämning med små molekylära massaföreningar (Figur 2C)

  1. GST-märkta proteiner som interagerar med glutationdonatorpärlor
    1. Ställ in reaktionerna i 384-brunnsplattor.
    2. Förbered lösningen som innehåller 10 μg/ml glutationdonatorpärlor i 0,5x PBS, pH 7.4.
      OBS: Efter långvarig förvaring sätter sig pärlor ner och måste virvlas.
    3. Tillsätt GST-FKBP51 eller GST-FKBP52 till en slutlig koncentration på 10 μg/ml.
    4. Inkubera i mörker vid 25 °C i 10 min.
      OBS: I detta steg kommer GST-märkta proteiner att interagera med glutation som är fäst vid pärlorna. För varje brunn kommer 22,5 μL av denna blandning att användas. Koncentrationen av de bindande partnerna måste bestämmas empiriskt. Titrera GST-FKBP51 och GST-FKBP52 och välj den koncentration som ger den bästa signalen.
  2. Sammansatt tillsats
    1. Gör seriella utspädningar av testföreningar i DMSO.
      OBS: De koncentrationer som används är vanligtvis 10, 30, 100, 300, 1 000 och 3 000 μM.
    2. Tillsätt 0,25 μL DMSO (negativ kontroll) eller Hsp90 C-terminalpeptid (positiv kontroll, 30 μM) eller föreningar i DMSO i hörnet av varje brunn på plattan. Använd triplikater för varje sammansatt koncentration.
    3. Tillsätt 22,5 μL av lösningen som innehåller glutationdonatorpärlor med GST-märkta proteiner till varje brunn.
    4. Skaka plattan försiktigt med handen men noggrant. Inkubera i mörker vid 25 °C i 15 min.
      OBS: Under denna tid kommer föreningar att interagera med TPR-domänen vid Hsp90 C-terminal peptidbindningsstället.
  3. Tillägg av acceptorpärlor
    1. Späd ut acceptorpärlorna med fäst Hsp90 C-terminalpeptid till 100 μg/ml i 0,5x PBS.
    2. Tillsätt 2,25 μL utspädda acceptorpärlor till varje brunn.
    3. Blanda försiktigt men noggrant. Inkubera i mörker vid 25 °C i 15 min.
      OBS: I detta steg förs donator- och acceptorpärlor i närheten av proteinpeptidinteraktionerna. Reaktionsblandningens slutliga volym är 25 μL. Därför varierar de slutliga koncentrationerna av föreningar från 0,1 till 30 μM.
  4. Avläsning av tallrik
    OBS: Läs plattan med hjälp av en plåtläsare inställd i relevant läge.
    1. Slå på instrumentet och öppna programvaran
    2. Välj relevant protokoll.
    3. Klicka på Redigera plåtkarta och välj den brunn som används i plattan för mätning.
    4. Klicka på Nästa om du vill fortsätta och köra det markerade protokollet.
    5. När du har måttet klickar du på Visa resultat om du vill visa resultat.
    6. Exportera data.

4. Dataanalys

  1. Z- faktor- och signal-till-bakgrundsförhållande (S/B)
    1. Beräkna Z-faktorn och S/B-förhållandet för analysen med hjälp av följande ekvation:
      Z'=1-(3σpos+3σ neg)/▼μpos-μneg▼16
      S/B=μneg/μpos
      där σ och μ representerar standardavvikelserna och metoderna för de positiva (Hsp90 C-terminalpeptiden, 30 μM) respektive negativa (DMSO) kontroller. En Z- > 0,5 säkerställer att analysen är tillräckligt robust för screening. För att övervaka analyskänsligheten har S/B-förhållandet också beräknats.
  2. Dosresponskurva och IC 50
    OBS: Använd icke-linjär regressionsanalys för att passa data från Hsp90-cochaperones PPI-hämmare med programvara.
    1. Skapa en XY-datatabell i dialogrutan Välkommen och välj X-nummeroch replikera värden för Y Enter 3 (om tre exemplar) replikerar värden i kolumner sida vid sida.
    2. Normalisera signaldata för prover till den negativa kontrollgruppen. Importera koncentrationsvärden till X-kolumnen och signalvärdena till Y-kolumnen.
    3. Klicka på Analysera och välj Omforma koncentration (X) under Omforma | Normalisera. Välj Omforma till Logarithms.
      OBS: Detta omvandlar koncentrationen till en stockskala. Om din startkoncentration är noll, ställ in den på ett mycket litet tal som i själva verket är noll (t.ex. 0,1 nM) för att inte förlora dessa värden eftersom logaritmen på noll inte definieras.
    4. Klicka på Analysera och välj Ickelinar regression (kurvpassning) under XY-analyser, öppna dos-responshämningen och välj Log(inhibitor) vs. svar -- Variabel lutning.
    5. Klicka på OK om du vill visa värdet Resultat (som innehållerIC 50-värdet) och Diagram.

Figure 2
Figur 2: Schematisk för detta protokoll. (A) Uttryck och rening av GST-FKBP51 och GST-FKBP52. B)Koppling av Hsp90 C-terminalpeptid till acceptorpärlorna. C)Den analys som undersöker interaktionen mellan GST-FKBP51 eller GST-FKBP52 och Hsp90 C-terminalpeptid. Hämning med små molekylära massaföreningar. Skapad BioRender.com Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I vår analys är Z faktor- och S/B-förhållande 0,82 respektive 13,35 (figur 3A), vilket visar att vår analys är robust och tillförlitlig för screening med hög genomströmning. Vi använde den sedan för att screena små molekylära massaföreningar. Figur 3B presenterar dosberoende hämning av förkläde-cochaperone interaktioner med en vald liten molekyl (D10). Dos-responskurvorna för D10 genereras av icke-linjär regressionsanalys, baserad på vilken värdena för IC50 beräknas. D10 visar dosberoende hämning både på Hsp90 - GST-FKBP51 och Hsp90 - GST-FKBP52 PROTONPUMPSHÄMMARE. Men värdena för IC50 är olika: dess IC50 för Hsp90 - GST-FKBP51 interaktioner är 65 nM, medan, för Hsp90 - GST-FKBP52 interaktioner, fullständig hämning uppnåddes inte med den högsta sammansatta koncentrationen (100 μM), dess IC50 uppskattas vara > 30 μM. Dessa resultat ger bevis för att selektiv hämning av Hsp90-HKBP51 eller Hsp90-FKBP52 PROTON med små molekyler kan uppnås (TPR-domäner av FKBP51 och FKBP52 har 60% sekvensidentitet och > 80% sekvenslikhet), och denna analys kan tillämpas för denna screening.

Figure 3
Figur 3:Analysanalys och analysresultat. Data representerar signaler om (₂) positiv kontroll (Hsp90 C-terminalpeptid, 30 μM) och (●) negativ kontroll (DMSO) från 48 brunnar. Ett Z- värde på 0,82 och ett S/B-tal på 13,35 beräknades utifrån dessa två populationer av data. (B) Hämning av vald förening (D10) på interaktioner mellan Hsp90 och FKBP51 (●) eller FKBP52 (₂) i denna analys. D10 hämmar Hsp90-FKBP51 eller Hsp90-FKBP52 dosberoende. Dess IC50 är 65 nM för Hsp90-FKBP51 interaktion men över 30 μM för Hsp90-FKBP52 interaktion. Data normaliseras till kontrollgruppen och uttrycks som medel ± SEM. Klicka här för att se en större version av den här siffran.

Reaktionskomponent Volym (μL)
PCR-buffert (5 x koncentrat) 4
Framåt primer 1
Omvänd primer 1
Plasmid 0.5
dNTP-blandning (10 mM vardera) 0.5
Phusion DNA-polymeras 0.5
Vatten (DNA-klass) 12.5
Total 20

Tabell 1: PCR-reaktion inställd för mänsklig FKBP51- och FKBP52 DNA-förstärkning.

Etapp Temperatur (°C) Tid Cykler
Inledande denaturering 94 3 min 1
Denaturering 94 30 sek 35
Glödgning 56 30 sek
Förlängning 72 1 min
Slutlig förlängning 72 5 min 1
Obs: Lockets temperatur är 105 °C.

Tabell 2: Termokylerförhållanden för dna-förstärkning av MÄNNISKA FKBP51 och FKBP52.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Här beskriver vi ett protokoll med hjälp av analysen för screening av små molekyler som hämmar interaktioner mellan Hsp90 och TPR-motiv co-chaperones, särskilt FKBP51 och FKBP52. Dess höga Z- poäng (>0,8) visar robustheten och tillförlitligheten för ett höggenomströmningsformat. Resultat kan erhållas inom en timme, och små mängder pärlor, protein och föreningar krävs. Dessutom kan detta protokoll enkelt utvidgas till alla Hsp90/Hsp70 - TPR-motiv samförkläde interaktioner av intresse. Flera TPR-motiv co-chaperones av Hsp90 har varit inblandade i olika mänskliga störningar som sträcker sig från Alzheimers sjukdom till autoimmuna sjukdomar, cancer, etc. Protokollet som beskrivs här ger en in vitro robust och billig analys för screening med hög genomströmning av små molekyler som hämmar förkläde-cochaperone interaktioner av hög medicinsk betydelse.

Dessutom måste läkemedel som är inriktade på TPR-domäner och hämmande interaktion med Hsp90 bedömas inte bara för deras affinitet mot målet utan också för deras selektivitet mot andra TPR-motivproteiner. Det mänskliga genomet kodar > 20 TPR-motivproteiner som kan interagera med Hsp90 C-terminalpeptiden. Denna analys med glutation pärlor och GST-märkta proteiner gör det möjligt att bedöma läkemedelseffekten på flera bindande TPR partners. Vårt laboratorium har ett bibliotek med 20 mänskliga TPR-proteiner i sin GST-märkta form och kan få affinitets- och selektivitetsprofiler för varje liten molekyl som testas.

Det har tidigare visats att PPI mellan Hsp90 och TPR co-chaperones förmedlas av C-terminal peptiden i Hsp90; Borttagningen av Hsp90 C-ändstation avskaffar helt bindningen av TPR-motiv co-chaperones6. Vi har funnit att föreningar effektiva i vår analys där Hsp90 C-terminal peptid användes också kunde hämma interaktionen mellan Hsp90 i full längd med GST-FKBP51/52 i en pull-down analys med glutation sepharose pärlor (data visas inte). Några av de utvalda föreningarna visar också den bindande affiniteten med FKBP51 med ytplasmonresonansteknik, och deras specifika bindningsplatser som bestäms av samkristallisering är för närvarande under utredning.

Ett kritiskt steg i vårt protokoll är tilläggsordningen; vi bildar först ett komplex mellan en liten molekyl och dess TPR-mål. Om komplex mellan FKBP51 och Hsp90 C-terminal peptid redan har bildats krävs längre inkubationstider och högre läkemedelskoncentrationer för att bryta protonpumpshämmarna. Detta beror främst på det steriska hindret för pärl som begränsar tillgången till molekyler till interaktionsplatsen.

Det är möjligt att kovalent par TPR proteiner och Hsp90 C-terminal peptider till givare och acceptor pärlor, respektive, och direkt sond protonpumpshämmare. Det rekommenderas dock inte att kovalent fästa båda bindningspartnerna på pärlorna på grund av minskad rörelse av molekyler i lösning som påverkar interaktionens kinetik. Detta ökar också risken för steriska hinder på grund av pärlstorleken. Därför väljer vi acceptorpärlor i kombination med Hsp90 C-terminalpeptid och glutationdonatorpärlor som interagerar med GST-märkta proteiner i vår analys, där flera TPR-partners kan bedömas.

I denna analys är det troligt att vissa identifierade föreningar kan vara falskt positiva på grund av deras interferens med analystekniken, såsom släckning av singlet syre, släckljus och spridande ljus. Falskt positiva resultat kan också induceras genom att störa bindningen av GST-taggen med glutatione donatorpärlor. Dessa falskt positiva resultat kan undvikas vid screening av molekyler både på Hsp90-FKBP51 och Hsp90-FKBP52 PROTON för att identifiera selektiva hämmare. Andra metoder för att upptäcka protonpumpshämmare bör också tillämpas för att verifiera de valda hämmarna.

Begränsningen av vår analys är att den inte kan användas för att upptäcka interaktionen mellan Hsp90 och TPR-motiv co-chaperones i råbiologiska prover, såsom celllysater. Efter screening med hög genomströmning måste hämningarna av utvalda föreningar på Hsp90 - TPR-motiv co-chaperones PPI i biologiska prover verifieras med andra metoder, såsom co-immunoprecipitation och närhet ligatur analys.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författare rapporterar inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Studien fick stöd av anslag från Vetenskapsrådet (2018-02843), Hjärnfonden (Fo 2019-0140), Stiftelsen för geriatriska sjukdomar vid Karolinska Institutet, Gunvor och Josef Anérs Stiftelse, Magnus Bergvalls Stiftelse, Gun och Bertil Stohnes Stiftelse, Tore Nilssons Stiftelse för medicinsk forskning, Margaretha af Ugglas stiftelse och Stiftelsen för gamla tjänstemän.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
384-well plates Perkin Elmer 6008350 Assay volume 25 ml
Amicon 10.000 MWCO centrifugation unit Millipore UFC901008 Concentrate protein
Ampicillin Sigma A0166 Antibiotics
Bacteria shaker Unimax 1010 Heidolph Culture bacteria
cDNA clones for human FKBP51 Source BioScience clone id: 5723416 pCMV-SPORT6 vector
cDNA clones for human FKBP52 Source BioScience clone id: 7474554 pCMV-SPORT6 vector
Chemically Competent E. coli Invitrogen C602003 One Shot BL21 Star (DE3)
Data analysis software GraphPad Prism 9.0.0 Analysis data and make figures
Data analysis software Excel Analysis data
DMSO Supelco 1.02952.1000 Dilute compounds
DPBS Gibco 14190-144 Prepare solution
EDTA Calbiochem 344504 Prevent proteolysis during sonication
Glutathione Sigma G-4251 Elute GST-tagged proteins
Glutathione donor beads Perkin Elmer 6765300 Donor bead
GST-trap column Cytiva (GE Healthcare) 17528201 Purify GST-tagged proteins
Isopropyl-β-D-thiogalactoside Thermo Fisher Scientific R0392 Induce protein expression
LB Broth (Miller) Sigma L3522 Microbial growth medium
PCR instrument BIO-RAD S1000 Thermal Cycler Amplification/PCR
PD-10 column Cytiva (GE Healthcare) 17085101 Solution exchange
pGEX-6P-1 vector Cytiva (GE Healthcare) 28954648 Plasmid
pGEX-6P-2 vector Cytiva (GE Healthcare) 28954650 Plasmid
Plate reader Perkin Elmer EnSpire 2300 Multilabel Reader Read alpha plate
Plate reader software Perkin Elmer EnSpire Manager Plate reader software
Plate reader software protocol Perkin Elmer Alpha 384-well Low volume Use this protocol to read plate
PMSF Sigma P7626 Prevent proteolysis during sonication
protease inhibitor cocktail Sigma S8830 Prevent proteolysis during sonication
Sodium azide Sigma S2002 As a preservative
Sodium cyanoborohydride (NaBH3CN) Sigma 156159 Activates matrix for coupling
Ten amino acid peptide NH2-EDASRMEEVD-COOH corresponding to amino acids 714-724 of human Hsp90 beta isoform Peptide 2.0 inc Synthesize Hsp90 C-terminal peptide
Test-Tube Rotator LABINCO Make end-over-end agitation
Tris-HCl Sigma 10708976001 Block unreacted sites of acceptor beads
Tween-20 Sigma P1379 Prevent beads aggregation
Ultra centrifuge Avanti J-20 XP Beckman Coulter Centrifuge to get bacteria cell pellets
Ultrasonic cell disruptor Microson Sonicate cells to release protein
Unconjugated acceptor beads Perkin Elmer 6762003 Acceptor beads
XCell SureLock Mini-Cell and XCell II Blot Module Invitrogen EI0002 SDS-PAGE

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Muchowski, P. J., Wacker, J. L. Modulation of neurodegeneration by molecular chaperones. Nature Reviews Neuroscience. 6 (1), 11-22 (2005).
  2. Eckl, J. M., Richter, K. Functions of the Hsp90 chaperone system: lifting client proteins to new heights. International Journal of Biochemistry and Molecular Biology. 4 (4), 157-165 (2013).
  3. Yuno, A. Clinical evaluation and biomarker profiling of Hsp90 inhibitors. Methods in Molecular Biology. 1709, 426-441 (2018).
  4. Dutta Gupta, S., Bommaka, M. K., Banerjee, A. Inhibiting protein-protein interactions of Hsp90 as a novel approach for targeting cancer. European Journal of Medicinal Chemistry. 178, 48-63 (2019).
  5. Pavlov, P. F., Hutter-Paier, B., Havas, D., Windisch, M., Winblad, B. Development of GMP-1 a molecular chaperone network modulator protecting mitochondrial function and its assessment in fly and mice models of Alzheimer's disease. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 22 (7), 3464-3474 (2018).
  6. Young, J. C., Obermann, W. M., Hartl, F. U. Specific binding of tetratricopeptide repeat proteins to the C-terminal 12-kDa domain of hsp90. Journal of Biological Chemistry. 273 (29), 18007-18010 (1998).
  7. Scheufler, C., et al. Structure of TPR domain-peptide complexes: critical elements in the assembly of the Hsp70-Hsp90 multichaperone machine. Cell. 101 (2), 199-210 (2000).
  8. Storer, C. L., Dickey, C. A., Galigniana, M. D., Rein, T., Cox, M. B. FKBP51 and FKBP52 in signaling and disease. Trends in Endocrinology & Metabolism. 22 (12), 481-490 (2011).
  9. Ullman, E. F., et al. Luminescent oxygen channeling immunoassay: measurement of particle binding kinetics by chemiluminescence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (12), 5426-5430 (1994).
  10. Wigle, T. J., et al. Screening for inhibitors of low-affinity epigenetic peptide-protein interactions: an AlphaScreen-based assay for antagonists of methyl-lysine binding proteins. Journal of Biomolecular Screening. 15 (1), 62-71 (2010).
  11. Guenat, S., et al. Homogeneous and nonradioactive high-throughput screening platform for the characterization of kinase inhibitors in cell lysates. Journal of Biomolecular Screening. 11 (8), 1015-1026 (2006).
  12. Sabatucci, A., et al. A new methodological approach for in vitro determination of the role of DNA methylation on transcription factor binding using AlphaScreen(R) analysis: Focus on CREB1 binding at hBDNF promoter IV. Journal of Neuroscience Methods. 341, 108720 (2020).
  13. Mills, N. L., Shelat, A. A., Guy, R. K. Assay Optimization and Screening of RNA-Protein Interactions by AlphaScreen. Journal of Biomolecular Screening. 12 (7), 946-955 (2007).
  14. Huang, X., et al. A competitive alphascreen assay for detection of hyaluronan. Glycobiology. 28 (3), 137-147 (2018).
  15. Roger Bosse, C. I., Chelsky, D. Principles of alphascreen amplified luinescent proximmity homogenous assay. PerkinElmer Life Sciences. , Available from: https://www.perkinelmer.com/lab-solutions/resources/docs/APP_AlphaScreen_Principles.pdf (2021).
  16. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).

Tags

Biokemi utgåva 173 AlphaScreen proteinproteininteraktioner molekylärt förkläde Hsp90 FKBP51 FKBP52 TPR-proteiner sammansatt screening
Studier av förkläde-cokaperoninteraktioner med homogen pärlbaserad analys
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wang, L., Bergkvist, L., Kumar, R.,… More

Wang, L., Bergkvist, L., Kumar, R., Winblad, B., Pavlov, P. F. Studies of Chaperone-Cochaperone Interactions using Homogenous Bead-Based Assay. J. Vis. Exp. (173), e62762, doi:10.3791/62762 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter