Summary
Este protocolo descreve como usar o sistema microbiano de cultura de microdroplet (MMC) para realizar o cultivo microbiano automatizado e a evolução adaptativa. A MMC pode cultivar e subsu cultivar microrganismos automaticamente e continuamente e monitorar on-line seu crescimento com rendimento relativamente alto e boa paraleloização, reduzindo o consumo de mão-de-obra e reagente.
Abstract
Os métodos convencionais de cultivo microbiano geralmente têm operações complicadas, baixo rendimento, baixa eficiência e grande consumo de mão-de-obra e reagentes. Além disso, os métodos de cultivo de alto rendimento baseados em microplaca desenvolvidos nos últimos anos têm baixo status de crescimento microbiano e paraleloização de experimentos devido ao seu baixo oxigênio dissolvido, mistura pobre e evaporação severa e efeito térmico. Devido a muitas vantagens das micro-gotículas, como pequeno volume, alto rendimento e forte controlabilidade, a tecnologia microfluidica baseada em gotículas pode superar esses problemas, que tem sido usado em muitos tipos de pesquisa de cultivo microbiano de alto rendimento, triagem e evolução. No entanto, a maioria dos estudos anteriores permanece na fase de construção e aplicação laboratorial. Algumas questões-chave, como altos requisitos operacionais, alta dificuldade de construção e falta de tecnologia de integração automatizada, restringem a ampla aplicação da tecnologia microfluidica gotícula em pesquisa microbiana. Aqui, um sistema automatizado de Microdroplet Culture (MMC) foi desenvolvido com sucesso com base na tecnologia microfluida de gotículas, alcançando a integração de funções como inoculação, cultivo, monitoramento on-line, subculo, classificação e amostragem exigidas pelo processo de cultivo de gotículas microbianas. Neste protocolo, escherichia coli (E. coli) MG1655 e uma cepa E. coli (MeSV2.2) de tipo selvagem foram tomadas como exemplos para introduzir como usar o MMC para realizar o cultivo microbiano automatizado e relativamente de alto rendimento e a evolução adaptativa em detalhes. Este método é fácil de operar, consome menos mão-de-obra e reagentes, e tem alto rendimento experimental e boa paraleloidade de dados, o que tem grandes vantagens em comparação com os métodos convencionais de cultivo. Fornece uma plataforma experimental de baixo custo, amigável à operação e confiável para pesquisadores científicos realizarem pesquisas microbianas relacionadas.
Introduction
O cultivo microbiano é uma importante base para pesquisas científicas microbiológicas e aplicações industriais, amplamente utilizadas no isolamento, identificação, reconstrução, triagem e evolução dos microrganismos 1,2,3. Os métodos convencionais de cultivo de microbianos usam principalmente tubos de ensaio, frascos de shake e placas sólidas como recipientes de cultivo, combinados com incubadoras de agitação, espectrofotômetros, leitores de microplaca e outros equipamentos para cultivo, detecção e triagem de microbianas. No entanto, esses métodos têm muitos problemas, como operações complicadas, baixo rendimento, baixa eficiência e grande consumo de mão-de-obra e reagentes. Os métodos de cultivo de alto rendimento desenvolvidos nos últimos anos são baseados principalmente na microplaca. Mas a microplacão tem um baixo nível de oxigênio dissolvido, má mistura de propriedade, e evaporação severa e efeito térmico, que muitas vezes levam a um baixo status de crescimento e paraleloização de experimentos de microrganismos 4,5,6,7; por outro lado, ele precisa ser equipado com equipamentos caros, como estações de trabalho de manuseio líquido e leitores de microplaca, para alcançar o cultivo automatizado e detecção de processos 8,9.
Como um importante ramo da tecnologia microfluidica, os microfluidos de gotículas foram desenvolvidos nos últimos anos com base em sistemas microfluidos tradicionais de fluxo contínuo. É uma tecnologia microfluida de fluxo discreto que usa duas fases líquidas imiscíveis (geralmente óleo-água) para gerar micro-gotículas dispersas e operá-las10. Como as micro-gotículas têm as características de pequeno volume, grande área de superfície específica, alta taxa interna de transferência de massa e nenhuma contaminação cruzada causada pela compartimentação, e as vantagens da forte controlabilidade e alto rendimento de gotículas, houve muitos tipos de pesquisa aplicando tecnologia microfluidica gotícula no cultivo de alto rendimento, triagem e evolução dos microrganismos11 . No entanto, ainda há uma série de questões-chave para tornar a tecnologia microfluidica gotícula popularizada e amplamente aplicada. Em primeiro lugar, o funcionamento de microfluidos de gotículas é complicado e intrincado, resultando em altos requisitos técnicos para os operadores. Em segundo lugar, a tecnologia microfluidica de gotículas combina componentes ópticos, mecânicos e elétricos e precisa estar associada a cenários de aplicação de biotecnologia. É difícil para um único laboratório ou equipe construir sistemas eficientes de controle microfluídico gotícula se não houver colaboração multidisciplinar. Em terceiro lugar, por conta do pequeno volume de micro-gotículas (do picoliter (pL) ao microliter (μL),é preciso muita dificuldade para realizar o controle automatizado preciso e a detecção on-line em tempo real de gotículas para algumas operações microbianas básicas, como subculto, triagem e amostragem, e também é difícil construir um sistema de equipamento integrado12.
Para resolver os problemas acima, um sistema automático de Microdroplet Culture (MMC) foi desenvolvido com sucesso com base na tecnologia microfluídicagotícula 13. O MMC consiste em quatro módulos funcionais: um módulo de reconhecimento de gotículas, um módulo de detecção de espectro de gotículas, um módulo de chip microfluido e um módulo de amostragem. Através da integração e controle do sistema de todos os módulos, o sistema de operação automatizado inclui a geração, cultivo, medição (densidade óptica (OD) e fluorescência), divisão, fusão, classificação de gotículas é precisamente estabelecida, alcançando a integração de funções como inoculação, cultivo, monitoramento, subculonça, triagem e amostragem exigidas pelo processo de cultivo de gotículas microbianas. O MMC pode conter até 200 unidades de cultivo de gotículas de réplica de volume de 2-3 μL, o que equivale a 200 unidades de cultivo de frascos de shake. O sistema de cultivo de micro-gotículas pode satisfazer os requisitos de não contaminação, oxigênio dissolvido, mistura e troca de massa-energia durante o crescimento de microrganismos, e atender às várias necessidades de pesquisa microbiana através de múltiplas funções integradas, por exemplo, medição da curva de crescimento, evolução adaptativa, análise e análise metabólica de fator único (baseada na detecção e análise de fluorescência)13,14.
Aqui, o protocolo introduz como usar o MMC para realizar o cultivo automatizado e microbiano e a evolução adaptativa em detalhes (Figura 1). Tomamos escherichia coli (E. coli) MG1655 como exemplo para demonstrar a medição da curva de crescimento e uma cepa E. coli essencial de metanol MeSV2.215 para demonstrar a evolução adaptativa no MMC. Foi desenvolvido um software de operação para MMC, o que torna a operação muito simples e clara. Em todo o processo, o usuário precisa preparar a solução inicial de bactérias, definir as condições do MMC e, em seguida, injetar a solução de bactérias e reagentes relacionados no MMC. Posteriormente, o MMC executará automaticamente operações como geração de gotículas, reconhecimento e numeração, cultivo e evolução adaptativa. Ele também executará a detecção on-line (OD e fluorescência) das gotículas com resolução de alto tempo e exibirá os dados relacionados (que podem ser exportados) no software. O operador pode parar o processo de cultivo a qualquer momento de acordo com os resultados e extrair as gotículas-alvo para experimentos subsequentes. O MMC é fácil de operar, consome menos mão-de-obra e reagentes, e tem rendimento experimental relativamente alto e boa paraleloidade de dados, que tem vantagens significativas em comparação com os métodos convencionais de cultivo. Fornece uma plataforma experimental de baixo custo, amigável à operação e robusta para os pesquisadores realizarem pesquisas microbianas relacionadas.
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Protocol
1. Instalação de instrumentos e software
- Escolha um ambiente limpo e estéril (como um banco limpo) como um espaço permanente dedicado para mmc. Instale o MMC de forma constante no espaço.
NOTA: Mantenha o MMC longe da interferência de fortes campos elétricos, campos magnéticos e fortes fontes de radiação térmica. Evite que vibrações severas afetem os componentes de detecção óptica. Fornecer a fonte de alimentação de AC220 V, 50 HZ para o MMC. Para obter detalhes sobre o MMC, consulte a Tabela de Materiais e o site da MMC16. - Instale o software de operação do arquivo MMC.zip
NOTA: Entre em contato com os autores do arquivo .zip MMC.- Crie uma pasta dedicada e salve o arquivo zip nele.
- Crie outra pasta dedicada como o "Diretório de Instalação". Descompacte o MMC.zip e salve os arquivos na nova pasta.
NOTA: A configuração do computador é melhor para atender: (1) Sistema operacional Windows 7 de 64 bits ou superior; (2) CPU: i5 ou superior; (3) memória: 4 GB ou superior; (4) disco rígido: 300 GB ou superior (velocidade rotacional superior a 7200 rpm ou disco de estado sólido).
2. Preparativos
- Conecte a agulha da seringa (o diâmetro interno é de 0,41 mm e o diâmetro externo é de 0,71 mm), conector rápido A e garrafa de reagente (Figura 2C) e autoclave-os a 121 °C por 15 min.
NOTA: Desaparafusar ligeiramente a tampa da garrafa de reagente durante a esterilização. Mais algumas garrafas de reagente podem ser preparadas cada vez para uso. - Use um filtro de fluoreto de polivinida de 0,22 μm (PVDF) para filtrar o óleo MMC. Coloque o chip microfluídico (Figura 2B) e o óleo MMC no banco limpo com antecedência e esterilize-os por irradiação ultravioleta por 30 minutos antes do uso.
NOTA: Para obter detalhes do conector Rápido A, garrafa de reagente, óleo MMC e chip microfluidic consulte a Tabela de Materiais. - Instale o chip microfluido
- Abra a porta da câmara de operação (Figura 2A) e levante a sonda de fibra óptica.
- Alinhe os orifícios de campo elétrico com as agulhas de campo elétrico e coloque suavemente o chip no pedestal do chip. Em seguida, insira as duas colunas de posicionamento nos orifícios de posicionamento e coloque a sonda de fibra óptica (Figura 2D).
- Conecte o conector rápido A no chip à porta correspondente do MMC de acordo com o número de posição (C5-O5, C4-O4, C6-O6, C2-O2, CF-OF, C1-O1, C3-O3). Então feche a porta da câmara de operação.
- Reabasteca o óleo MMC (cerca de 80 mL) na garrafa de óleo e esvazie o líquido de resíduos na garrafa de resíduos antes de usar.
NOTA: O líquido de resíduos geralmente é resíduos orgânicos. Consulte o direito regional e a regulamentação mediante disposição, sujeito a alterações com base na configuração experimental.
3. Medição da curva de crescimento no MMC
- Preparação para solução bacteriana inicial
- Siga as normas padrão relacionadas para preparar luria-bertani média e autoclave a 121°C por 15 min.
NOTA: Componentes do meio LB: NaCl (10 g/L), extrato de levedura (5 g/L) e triptona (10 g/L). - Retire a cepa E. coli MG1655 do caldo de glicerol e cultive-a em um frasco de shake de 50 mL com 10 mL de meio LB em uma incubadora de agitação (200 rpm) a 37 °C por 5-8 h.
NOTA: O tempo de cultivo depende das cepas específicas. É ideal cultivar a cepa até o período/fase logarítmica. - Diluir a solução E. coli MG1655 cultivada com meio fresco a um OD600 de 0,05-0,1 para obter uma solução inicial de bactérias (prepare cerca de 10 mL).
- Siga as normas padrão relacionadas para preparar luria-bertani média e autoclave a 121°C por 15 min.
- Clique em Inicialização para inicializar o MMC. Após a realização da interface de inicialização, defina a temperatura de cultivo como 37 °C e o valor do sinal fotoelétrico como 0,6 (Figura 3A). A inicialização levará cerca de 20 minutos.
- Ligue a lâmpada UV (comprimento de onda 254 nm) durante a inicialização.
- Injete a solução inicial de bactérias e o óleo MMC no frasco de reagente.
- Pegue uma garrafa de reagente esterilizada no banco limpo e aperte a tampa.
- Use uma seringa estéril de 10 mL para injetar 3-5 mL de óleo MMC da agulha de seringa do tubo lateral. Incline e gire a garrafa de reagente lentamente para fazer o óleo se infiltrar totalmente na parede interna.
- Injete cerca de 5 mL de solução inicial de bactérias e, em seguida, encha o frasco de reagente injetando 5-7 mL do óleo novamente.
- Retire o conector rápido independente A e insira o conector rápido A da garrafa de reagente em seu conector rápido B para completar a operação de injeção de amostra (Figura 4A).
- Aguarde o término da inicialização e, em seguida, desligue a lâmpada UV (comprimento de onda 254 nm).
- Abra a porta da câmara de operação, e coloque a garrafa de reagente no banho de metal.
- Retire o conector C2 do chip e o conector rápido A da garrafa de reagente. Conecte o conector do tubo lateral da garrafa de reagente ao conector C2 e ao conector superior do tubo ao conector O2. Então feche a porta da câmara de operação.
- Clique na Curva de Crescimento para escolher a função de medição da curva de crescimento (Figura 3A). Na interface de configuração do parâmetro, insira o número como 15, ligue o interruptor de detecção de OD e defina o comprimento de onda como 600 nm. Clique em Iniciar a geração de gotículas. Vai levar cerca de 10 minutos.
NOTA: Aqui, o número refere-se ao número de gotículas a serem geradas. O comprimento de onda refere-se ao comprimento de onda do OD a ser detectado. Defina o Número (máximo 200) e o comprimento de onda (350-800 nm) de acordo com os requisitos do experimento. - Quando uma janela pop-up aparecer na interface principal, solicitando "Remova a garrafa de reagente entre C2 e O2, clique no botão OK após a conclusão", abra a porta da câmara de operação para retirar a garrafa de reagente e conectar os conectores C2 e O2.
- Feche a porta e clique no botão OK na janela pop-up para cultivar automaticamente as gotículas e detectar os valores de OD.
NOTA: O MMC detecta o valor OD quando a gota passa pela sonda de fibra óptica. Portanto, o período de detecção depende do número de gotículas geradas. - Quando a curva de crescimento chegar à fase estacionária, clique no botão Exportação de dados para exportar os dados OD. Selecione o caminho de salvamento de dados e exporte o valor OD registrado durante o período de cultivo no formato .csv, que pode ser aberto por software apropriado (por exemplo, Microsoft Excel). Em seguida, use um software de mapeamento (por exemplo, EXCEL e Origin 9.0) para traçar a curva de crescimento.
NOTA: Durante o processo de cultivo, é viável clicar na Exportação de Dados a qualquer momento para exportar os dados de OD de todas as gotículas atuais.
4. Evolução adaptativa no MMC
- Preparação para solução bacteriana inicial
- Siga as normas padrão relacionadas para preparar as placas médias e sólidas líquidas especiais para o MeSV2.2 e autoclave a 121 °C por 15 min.
NOTA: Para os componentes do meio especial consulte a Tabela 1 e a Tabela de Materiais. - Cultive o MeSV2.2 utilizando a placa sólida (diâmetro = 90 mm) em uma incubadora de temperatura constante de 37 °C por 72 h. Em seguida, escolha uma colônia independente e cultive-a em um frasco de shake de 50 mL com 10 mL do meio líquido especial em uma incubadora de agitação (200 rpm) a 37 °C por 72 h.
- Diluir a solução MeSV2.2 cultivada com o médio para um OD600 de 0,1-0.2 (certifique-se de que o volume total não seja inferior a 10 mL) e continue cultivando-o no frasco de shake por 5h para obter a solução inicial de bactérias.
NOTA: O MeSV2.2 é uma cepa E. coli essencial para metanol. O meio líquido especial contém 500 mmol/L metanol, o que é um forte estresse para o MeSV2.2, resultando em um crescimento muito lento. Observe que a obtenção da solução inicial de bactérias aqui é diferente da descrita na etapa 3.1.
- Siga as normas padrão relacionadas para preparar as placas médias e sólidas líquidas especiais para o MeSV2.2 e autoclave a 121 °C por 15 min.
- Inicialize o MMC como explicado nas etapas 3.2, 3.3 e 3.5.
- Tire duas garrafas de reagente esterilizadas, uma delas para a solução inicial de bactérias e a outra é para o meio fresco. Injete a solução inicial de bactérias (5 mL), meio fresco (12-15 mL) e óleo MMC nas garrafas de reagente, conforme explicado na etapa 3.4.
NOTA: Como a evolução adaptativa é um processo de longo prazo envolvendo múltiplos subcultos, armazene o máximo possível de meios frescos no MMC. O meio não pode ser reabastecido durante a execução do experimento. - Instale as duas garrafas de reagente no MMC conforme explicado na etapa 3.6. Instale um para a solução inicial de bactérias entre o conector C2 e O2 e o outro para o meio fresco entre o conector C4 e O4.
- Clique em ALE para escolher a função de evolução adaptativa (Figura 3B). Na interface de configuração do parâmetro, ligue o interruptor de detecção de OD .
- Definir o número como 50, comprimento de onda como 600 nm, Concentração como 0%, Tipo como Tempo, Parâmetro como 30 h e Repetições como 99. Clique em Iniciar a geração de gotículas. Vai levar cerca de 25 minutos.
NOTA: Aqui, "Concentração" refere-se à concentração máxima de fatores químicos para evolução adaptativa. Para diferentes gotículas, é realizado no MMC introduzir diferentes concentrações de fatores químicos para fornecer diferentes condições de crescimento. Calcule as concentrações introduzidas usando a seguinte equação:
Aqui "C" refere-se à concentração de fatores químicos introduzidos em gotículas; "a" refere-se à concentração de fatores químicos nas garrafas de reagente entre o conector C4 e O4; "b" refere-se à concentração de fatores químicos nas garrafas de reagente entre o conector C6 e O6; e "i" refere-se à concentração disponível. Há oito concentrações disponíveis no MMC. Como o fator químico aqui tem uma única concentração (500 mmol/L metanol) e é um dos ingredientes do meio, apenas uma garrafa de reagente contendo o fator químico é instalada aqui, e a Concentração é definida como 0%. O tipo refere-se ao modo de subculto, que é dividido em três tipos: modo tempo, modo de valor OD e modo fluorescência. O primeiro significa cultivar as gotículas por um tempo fixo e, em seguida, sub-cultivar, enquanto os dois últimos significam cultivar as gotículas para a intensidade pré-definida de valor/fluorescência do OD e, em seguida, sub-cultivar. O parâmetro refere-se ao parâmetro relacionado necessário ao escolher um modo de subculto. Repetições referem-se ao número de subcultos. - Remova a garrafa de reagente colocada entre o conector C2 e O2 conforme explicado na etapa 3.8.
- Observe se os valores máximos de OD das gotículas durante cada período de subculto aumentaram significativamente. Se o aumento ocorrer e atender aos requisitos do experimento, clique no botão Exportação de dados para exportar os dados OD conforme explicado na etapa 3.9.
NOTA: Aqui, o período de subculgênio depende do Parâmetro. Por exemplo, ao definir Tipo como Tempo e Parâmetro como 30 h, o período de subculgão é de 30 h. Durante cada período de subculgênio, existem os valores máximos de OD das gotículas. Estimar se a evolução adaptativa atende aos requisitos do experimento pelo aumento dos valores máximos de OD (O aumento depende do processo real de cultivo da cepa, por exemplo, aumentado em mais de 20%).
ATENÇÃO: Preste atenção se o meio fresco armazenado está esgotado. Se o aumento significativo não ocorreu mesmo após o esgotamento do meio, extraia as gotículas de melhor crescimento e realize uma nova rodada de evolução adaptativa. - Extrair as gotículas de destino do MMC.
- Clique no botão Triagem para escolher a função de extração de gotícula (Figura 3C). Escolha a opção Coletar , clique nos números das gotículas de destino e clique em OK.
NOTA: A triagem de gotículas inclui "Coletar", "Descartar" e "Extratar solução de sementes". "Extrato de solução de sementes" significa coletar as gotículas restantes13 após a operação de subculto. - Aguarde a janela pop-up para solicitar: "Por favor, puxe o conector rápido CF e coloque-o no tubo EP". Coloque o conector rápido CF no tubo de microcentrifutura para coleta de acordo com o prompt do software e clique em OK (Figura 4D).
- Após 1-2 min, a interface de software aparecerá em uma nova janela solicitando: "Por favor, insira o conector de volta e clique em OK se terminar". Em seguida, insira o conector rápido CF para trás e clique em OK para fazer o MMC continuar a ser executado (Figura 4D). Quando a próxima gotícula de destino chegar ao site de reconhecimento de gotículas, repita 4.9.2-4.9.3 para recolhê-lo.
NOTA: Depois que todas as gotículas de destino forem coletadas, o MMC continuará cultivando as gotículas restantes. Se o cultivo não for necessário, clique em Parar para encerrar diretamente a operação. - Extrair a gotícula usando uma pipeta de 2,5 μL, solte-a na placa de 90 mm de agarose e espalhe-a uniformemente com uma haste de vidro triangular com um comprimento lateral de 3 cm. Em seguida, cultive-o em uma incubadora de temperatura constante de 37 °C por 72 h.
- Escolha 3-5 colônias independentes e cultive-as separadamente nos frascos de shake de 50 mL com 10 mL de meio fresco em uma incubadora de agitação (200 rpm) a 37 °C por 48-72 h. Siga as normas padrão relacionadas para armazenar a solução de bactérias cultivadas no tubo de glicerol para experimentos subsequentes.
- Clique no botão Triagem para escolher a função de extração de gotícula (Figura 3C). Escolha a opção Coletar , clique nos números das gotículas de destino e clique em OK.
5. Limpo do MMC
- Após a conclusão do experimento, clique em Parar para parar todas as operações. Em seguida, clique em Limpar o chip e os tubos. Vai levar cerca de 15 minutos.
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Representative Results
Este protocolo usa e. coli MG1655 e uma cepa MeSV2.2 como exemplos para demonstrar o cultivo microbiano e a evolução adaptativa essencial do metanol com uma estratégia automatizada e relativamente alta no MMC. A medição da curva de crescimento foi utilizada principalmente para caracterizar o cultivo microbiano. A evolução adaptativa foi conduzida pelo subculto contínuo automatizado e adicionando uma alta concentração de metanol como pressão seletiva durante cada subculto. Se a evolução adaptativa foi realizada foi estimada através da tendência de variação do valor máximo de OD das gotículas durante cada período de subculto. Os parâmetros tunable e os parâmetros de precisão do MMC são mostrados na Tabela 2.
Resultados da medição da curva de crescimento
Os valores de600 OD das 15 gotículas detectadas durante o processo de cultivo foram exportados do MMC após o cultivo por cerca de 20 h (Figura 5A). Observa-se que a detecção foi realizada aproximadamente a cada 14 minutos. Esse período de detecção depende do número de gotículas geradas porque as gotículas são ciclodidas para frente e para trás nos tubos para cultivo, e o módulo de detecção só detecta os valores de OD (a detecção e o cálculo do valor de OD são mostrados na Figura Suplementar 1) quando as gotículas passam pela sonda de fibra óptica. Portanto, o 14 min é um período de detecção muito curto, proporcionando um processo de detecção de resolução de alto tempo para refletir o crescimento dos microrganismos com mais precisão.
De acordo com os dados exportados, foram calculados os valores médios de600 valores e desvio padrão (DS) de 15 gotículas em cada ponto de tempo, e a curva de crescimento de E. coli MG1655 (Figura 5B). Os resultados mostram que a curva de crescimento apresenta uma forma "S", incluindo fase de lag, fase logarítmica e fase estacionária, o que é muito consistente com o modelo clássico de crescimento microbiano. Ao mesmo tempo, os desvios padrão de 15 gotículas são muito pequenos, indicando boa consistência de crescimento e paralelo. Assim, demonstra plenamente o bom desempenho de cultivo e detecção microbiana do MMC. Além disso, verificou-se também que há pouco cruzamento entre gotículas durante o cultivo (Figura Suplementar 2 e Tabela Suplementar 1).
Resultados da evolução adaptativa
Realizamos uma evolução adaptativa de longo prazo do MeSV2.2 no MMC. No dia18, de acordo com a tendência crescente dos valores máximos deOD 600 das gotículas durante cada período de subculto das curvas de crescimento exibidas na interface do software, acreditamos que uma boa evolução adaptativa foi alcançada nas 50 gotículas. Os dados de OD600 foram exportados e 8 gotículas (incluindo gotículas 6) com desempenho de crescimento relativamente bom foram extraídos13. A Figura 6A mostra as curvas de crescimento de 50 gotículas em todo o processo de evolução adaptativa. Em 18 dias, a MMC realizou automaticamente 13 operações de subculgão. Pode-se ver a partir da Figura 6A que o MeSV2.2 cresce lentamente primeiro e rápido depois, o que indica a trilha da evolução adaptativa no MeSV2.2. Para suprir uma pressão de seleção, o metanol foi adicionado ao meio MeSV2.2. Inicialmente, o metanol inibiu o crescimento celular. Após a evolução adaptativa, as células enriquecidas adaptadas ao metanol apresentaram maior taxa de crescimento. A curva de crescimento da gotícula 6 em todo o processo de evolução adaptativa foi traçada separadamente (Figura 6B). Os valores máximos deOD 600 na primeira geração e no último período de subculto foram de 0,37 e 0,58, respectivamente, aumento de 56,8%. Indica que a tensão na gotícula 6 percebeu uma evolução adaptativa óbvia.
Posteriormente, a cepa gotícula 6 e a tensão inicial em frascos de shake foram cultivadas, e suas curvas de crescimento foram comparadas (Figura 6C). De acordo com os métodos dados na literatura17,18, foram calculadas as taxas máximas de crescimento específico (μmáximo) da cepa gotícula 6 e a cepa inicial, que foram de 0,096 h-1 e 0,072 h-1, respectivamente. A Figura 6C revela que a cepa gotícula 6 apresentou maior taxa máxima de crescimento específico (aumento de 54,8%) e apresentou maior concentração celular na fase estacionária (aumento de 20,0%) do que a cepa inicial quando cultivada em frascos de shake, o que sugere ainda que a evolução adaptativa no MeSV2.2 foi realizada.
Figura 1: Fluxo de trabalho global de medição da curva de crescimento e evolução adaptativa no MMC. (A) Medição da curva de crescimento em MMC. Em primeiro lugar, cultivar a cepa em frasco de shake para preparar a solução bacteriana inicial. Em seguida, injete a solução inicial de bactérias no frasco de reagente. Em seguida, gere as gotículas no MMC. O MMC faz com que as gotículas pedalem para frente e para trás no chip microfluido e tubos para cultivá-las. Quando as gotículas passarem pelo local de detecção, os dados de OD serão detectados e registrados. Por fim, exporte os dados para análise. (B) Evolução adaptativa no MMC. Escolha uma única colônia da placa de agarose e cultive-a em um frasco de shake para preparar a solução bacteriana inicial. Depois de injetar a solução inicial de bactérias no frasco de reagente, conduza a evolução adaptativa no MMC. A evolução adaptativa envolve o subcultor contínuo, que pode ser operado automaticamente através da divisão e fusão de gotículas. Após a evolução adaptativa, exporte os dados para análise. As gotículas-alvo podem ser extraídas e, em seguida, espalhadas na placa para obter colônias únicas. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Estrutura e ferramentas essenciais do MMC. (A) Câmara externa e de operação da MMC. (B) O chip microfluídico de MMC. O chip tem sete canais (C1-C6 e CF). (C) Garrafa de reagente. Tem um tubo superior e um tubo lateral. Antes de injetar a amostra no frasco de reagente, ela precisa conectar uma agulha de seringa a um conector rápido A primeiro e, em seguida, conectar o conector rápido A ao tubo lateral. (D) Instalação do chip microfluido. O chip microfluido está instalado no pedestal. Em seguida, os sete canais (C1-C6 e CF) estão respectivamente conectados às portas correspondentes do MMC (O1-O6 e OF).
1 - Câmara de Operação da MMC.
2 - Garrafa de óleo contendo o óleo MMC.
3 - Frasco de resíduos para coleta de líquido de resíduos.
4 - Lâmpada UV (comprimento de onda 254 nm) para esterilização. Esta lâmpada pode ser ligada com antecedência para esterilizar o chip e os tubos.
5 - Laser (620 nm) para reconhecimento de gotículas. O ponto onde o laser é irradiado no chip é o local de reconhecimento de gotículas.
6 - Sonda de temperatura para medir a temperatura dentro da câmara de operação.
7 - Aquecedor para a câmara de operação. Pode ser usado para manter a temperatura do cultivo microbiano. A faixa de temperatura que pode ser definida é de 25 ± 0,5 °C a 40 ± 0,5 °C.
8 - Sonda de fibra óptica para medir o OD ou fluorescência de gotículas.
9 - Chip pedestal para instalar o chip Microfluidic.
10 - Banho de metal para fixar as garrafas de reagente e aquecê-las para elevar rapidamente a temperatura de um reagente à temperatura do cultivo microbiano.
11 - Portas para o chip microfluido (O1-O6 e OF). O chip microfluido está conectado ao MMC através dessas portas.
12 - Tubos para armazenamento e cultivo de gotículas.
13 - Blocos de ímãs para localizar rapidamente o chip microfluido durante a instalação.
14 - Agulha de seringa para injetar as amostras nas garrafas de reagente. Seu diâmetro interno é de 0,41 mm, e seu diâmetro externo é de 0,71 mm.
15 - Conector rápido A. Conecte-se com conector rápido B.
16 - Conector rápido B. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Interfacede software de operação do MMC. (A) A interface principal do software. (1) Temperatura na câmara de operação. (2) Valor do sinal fotoelétrico do reconhecimento de gotículas. Quando a gota passa, o valor do sinal é alto (>2 V). Quando o óleo passa, o valor do sinal é baixo (<1 V). (3) Seleção de funções. Há quatro funções para escolher: medição da curva de crescimento (Curva de Crescimento), evolução adaptável laboratorial (ALE), análise multinúfito de fator único (Um fator) e personalização das operações de acordo com necessidades experimentais (Personalização). (4) Interface de configuração do parâmetro. Defina os parâmetros experimentais correspondentes aqui após a escolha de uma função. (5) Área de execução de comando. (6) Interruptor da câmera. A câmera é instalada diretamente acima do chip, que pode ser usado para observar online as gotículas no chip. (7) Área de exibição de processos. Mostra o tempo de execução, os dados de monitoramento e a operação que está sendo executada. (B) A interface de configuração do parâmetro da evolução adaptativa. (C) A interface de triagem de gotículas. O MMC pode numerar automaticamente as gotículas. Aqui, as gotículas de destino podem ser selecionadas e extraídas do MMC. (D) Interface de observação da câmera. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Injeção de amostra, geração de gotículas e extração de gotículas. (A) O frasco de reagente após a injeção de solução de bactérias e óleo MMC. Tanto a solução de bactérias quanto o óleo MMC são injetados do tubo lateral. A fase do óleo está na camada superior e a solução de bactérias está na camada inferior. Após a injeção, conecte o conector rápido A e B e instale-o no MMC. (B) Geração de gotículas no chip microfluido. Para aumentar a visibilidade das gotículas, foi utilizada uma solução de pigmento vermelho para demonstrar o processo de geração de gotículas. (C) Gotícula armazenada no tubo observado pelo microscópio. Barra de escala: 400 μm. (D) Prompts de janela pop-up e as operações correspondentes. Quando o prompt "Por favor, puxe o conector rápido CF e coloque-o no tubo EP", puxe o conector CF e coloque-o no tubo EP para coletar a gotícula de destino; quando o prompt "Por favor, insira o conector de volta", a coleção de gotículas estiver completa, insira o conector CF de volta na porta OF. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Exportação de dados e plotagem de números da curva de crescimento. (A) Captura de tela de parte dos dados exportados. Os dados exportados incluem cada ponto de tempo de detecção das 15 gotículas geradas e os valores correspondentes deOD 600. (B) Curva de crescimento de E. coli MG1655 plotada com base nos dados exportados. Calcule os valores médios de600 valores e o desvio padrão (SD) de 15 gotículas em cada ponto de tempo e plote a curva de crescimento. É claro que essa curva de crescimento inclui a fase de defasagem, fase logarítmica e fase estacionária. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Resultados da evolução adaptativa do MeSV2.2 no MMC. (A) Curvas de crescimento de 50 gotículas em todo o processo de evolução adaptativa. Os dados de detecção deOD 600 de 50 gotículas durante o processo de evolução adaptativa de 18 dias foram exportados do MMC e plotados. No 18º dia, foram extraídos 8 gotículas, incluindo gotícula 6. (B) Curva de crescimento da gotícula 6 em todo o processo de evolução adaptativa. Os valores máximos deOD 600 na primeira geração e no último período de subculto foram de 0,37 e 0,58, respectivamente, aumento de 56,8%. (C) Comparação da cepa gotícula 6 e da tensão inicial no frasco de shake. A cepa de gotícula 6 e a cepa inicial foram cultivadas em frascos de shake, e as curvas de crescimento (incluindo SD, n = 3) foram medidas. Este número foi modificado de Jian X. J. et al.13. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Componentes | Concentração |
| Na2HPO4·12H2O | 6,78 g/L |
| KH2PO4 | 3 g/L |
| NaCl | 0,5 g/L |
| NH4Cl | 1 g/L |
| vitamina B1 (esterilizada por filtragem) | 0,34 g/L |
| Mgso4·7H2O | 0,049 g/L |
| CaCl2·2H2O | 1,5 mg/L |
| Microélmentos: | |
| FeCl3·6H2O | 0,5 mg/L |
| ZnSO4·7H2O | 0,09 mg/L |
| Cuso4·5H2O | 0,088 mg/L |
| MnCl2 | 0,045 mg/L |
| CoCl2·6H2O | 0,09 mg/L |
| Gluconato | 1,09 g/L |
| metanol | 500 mmol/L |
| isopropílico-β-d-thiogalactopyranoside | 0,1 mmol/L |
| sulfato de estreptomicina | 20 μg/mL |
| sulfato de kanamycin | 50 μg/mL |
| Adicione 15 g/L extras para preparar o meio sólido. | |
Tabela 1: Componentes do meio especial para MeSV2.2.
| Parâmetros tunable | |
| Parâmetro | Gama |
| Temperatura do cultivo | 25-40 °C ± 0,5 °C |
| Número de gotículas | 0–200 |
| Concentração de inóculo | 13.3–86.7 % |
| Concentração de fator químico | 8 concentrações diferentes, até a concentração máxima de fator químico armazenado |
| O tempo do subculto | Até o usuário |
| O número de subcultos | Até o usuário |
| Comprimento de onda da detecção de OD | 350-800 nm |
| Comprimento de onda de detecção de fluorescência | Excitação: 470, 528 nm Emissão: 350-800 nm |
| Parâmetros de precisão | |
| Parâmetro | C.V. |
| Volume de gotículas | 1.88% |
| Concentração de inóculo | <5,0% |
Tabela 2: Parâmetros t impossibilitados e parâmetros de precisão do MMC. Os parâmetros tunable referem-se aos parâmetros que podem ser ajustados de acordo com os requisitos específicos dos usuários; os parâmetros de precisão referem-se aos parâmetros que refletem a precisão e a reprodutibilidade das diferentes operações fluidas.
Figura suplementar 1: Reconhecimento e detecção de gotículas no MMC. (A) A forma de onda de uma gotícula no MMC. Esta forma de onda vem dos dados espectrais brutos do espectrômetro MMC. Depois de processar os dados espectrais brutos em segundo plano, o MMC dará o valor OD medido. (B) Cálculo de OD de gotículas em MMC. Na forma de onda da gotícula, 'a' representa o comprimento máximo da gotícula, 'c' representa a interface em forma de arco formada pela fase do óleo e fase da água, e 'b' representa a parte principal da gotícula. Com base na lei Lambert-Beer, o valor de OD da gotícula é calculado utilizando-se a seguinte fórmula: valor OD = lg(E/D) × 10. 'E' refere-se ao valor médio do sinal espectral da fase do óleo; 'D' refere-se ao valor médio do sinal espectral da parte principal b da gotícula. Deve-se notar que o valor de OD medido pelo MMC é diferente daquele medido por um espectrômetro. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Figura suplementar 2: Teste de crosstalk entre as gotículas. Para verificar se há conversa cruzada entre as gotículas durante o cultivo a longo prazo, a solução E. coli MG1655 foi diluída a uma concentração muito baixa (de acordo com a distribuição de Poisson, λ = 0,1), e então 200 gotículas foram geradas e cultivadas por 5 dias. Após a medição do DM, verificou-se que o E. coli MG1655 cresceu em um pequeno número de gotículas. E quase não houve crescimento bacteriano nas gotículas ao redor dessas gotículas. O resultado também mostra preliminarmente que há pouco crosstalk entre gotículas. Clique aqui para baixar este Arquivo.
Tabela suplementar 1: Estabilidade da geração de gotículas no MMC. Como mostrado na Figura Suplementar 1, a gotícula tem uma forma de onda fixa. O espectrômetro do MMC gera um certo número de pontos de dados por segundo, de modo que o número de pontos de dados da forma de onda de gotícula pode refletir o tamanho da gotícula. A solução de corante vermelho foi utilizada para gerar 397 gotículas no MMC, e o valor de OD foi medido. Os dados espectrais brutos foram exportados, os pontos de dados de cada forma de onda de gotícula foram contados, e o coeficiente de variação (C.V) dos pontos de dados de gotículas foi calculado. Clique aqui para baixar esta Tabela.
Tabela suplementar 2: Evaporação de gotícula em MMC. Aqui a solução de corante vermelho foi utilizada para gerar gotículas no MMC e as gotículas foram armazenadas no tubo de cultivo. O tubo foi então colocado em uma incubadora de temperatura constante de 37 °C por 30 dias, e o comprimento da gota foi medido regularmente (tire fotos sob um microscópio e meça o comprimento com uma barra de escala). Mostra que o volume da gotícula foi reduzido em cerca de 12,3% após 30 dias, o que indica que a evaporação da gotícula é muito pequena no MMC. Clique aqui para baixar esta Tabela.
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Discussion
Este protocolo apresenta como usar o sistema microbiano de cultura de microdroplet (MMC) para realizar o cultivo microbiano automatizado e a evolução adaptativa a longo prazo. MMC é um sistema de cultivo microbiano miniaturizado, automatizado e de alto rendimento. Em comparação com métodos e instrumentos convencionais de cultivo de alto rendimento microbiano, o MMC tem muitas vantagens, como baixo consumo de mão-de-obra e reagente, operação simples, detecção on-line (DCE e fluorescência), coleta de dados de alta resolução e paraleloização superior. O MMC também tem algumas vantagens especiais diferentes da tecnologia microfluídica gotícula convencional, que geralmente usa as gotículas pL e nL. Os sistemas mais relatados anteriormente que usavam gotículas de pL e nL têm baixo desempenho de cultivo e poucos parâmetros detectáveis (geralmente apenas fluorescência)18,19,20,21. Embora tenha havido algumas plataformas que podem alcançar melhor desempenho de cultivo e detecção de vários parâmetros, é difícil e requer muito esforço. Por exemplo, alguns pesquisadores relataram a detecção de DM de gotículas de PI. Baseia-se no reconhecimento de imagem, que não só tem falsos positivos, mas também precisa de uma verificação adicional da precisão22. No entanto, a MMC pode realizá-las de forma relativamente simples. O MMC usa gotículas de microliter (μL) raramente relatadas. O desempenho superior do cultivo microbiano do MMC foi verificado, e também pode detectar diretamente OD e fluorescência. Devido ao grande volume das gotículas μL, a geração de gotículas é menos suscetível a interferências, que tem maior estabilidade. Enquanto isso, operações mais diversas podem ser realizadas nas gotículas de microliter, propícias à realização de operações automatizadas. Além disso, como as gotículas são espaços de gabinete, a volatilidade do conteúdo pode ser suprimida (Tabela Suplementar 2), propícia à realização do cultivo microbiano de longo prazo e evolução adaptativa quando existem substâncias voláteis no meio14. Isso é difícil de conseguir em frascos de agitação e microplacas.
No entanto, alguns pontos críticos do protocolo merecem ser enfatizados. Em primeiro lugar, deve-se notar que o valor de OD medido pelo MMC é diferente do de um espectrofotômetro óptico, pois seus comprimentos de caminho óptico de medição de OD são diferentes (1 mm e 10 mm, respectivamente). Portanto, ao comparar o valor OD do MMC com o de frasco de shake, é necessário medir a curva de calibração13. Felizmente, o processo de evolução adaptativa não requer curvas de calibração porque focamos nas tendências relativas entre as curvas de crescimento. Em seguida, certos microrganismos são não cultivados no MMC. As gotículas dependem da tensão superficial da interface óleo-água para manter a estabilidade23. Se os microrganismos produzem certas substâncias que interrompem a tensão superficial da interface óleo-água, como algumas cepas de bacillus subtilis que produzem surfactantes24, as gotículas não podem manter a estabilidade. Além disso, se o meio em si é um obstáculo para a geração de gotículas, não é viável ser usado em MMC, por exemplo, muito viscoso médio ou médio contendo partículas grandes. Atualmente, as espécies que cultivamos com sucesso no MMC incluem E. coli, Lactobacillus plantarum, Corynebacterium glutamicum, leveduras, extorquias de metilobacterium, aspergillus oryzae, microalgae e assim por diante. Recomenda-se cultivar a cepa em MMC para experimentos preliminares. Finalmente, os conectores e portas entre o chip, a garrafa de reagente e o MMC devem ser conectados de acordo com o protocolo. Caso contrário, a solução de bactérias pode fluir para o MMC e contaminar o interior. Além disso, deve-se ressaltar que o rendimento atual do MMC é limitado (0-200), devido ao tempo necessário para as operações de subculto. No futuro, vamos otimizar o software de controle e o tamanho do chip para encurtar o tempo e melhorar o throughput. Uma vez que o MMC é um sistema modular, apenas peças ou softwares relacionados precisam ser substituídos sem a necessidade de novos equipamentos.
Atualmente, o MMC pode não apenas realizar a medição da curva de crescimento, evolução adaptativa do laboratório e análise multinúfito de um fator único, mas também ser usado para personalizar diferentes procedimentos de operação de gotículas para atender às necessidades experimentais. No futuro, é necessário enriquecer ainda mais as funções de aplicação do sistema MMC em resposta às diferentes necessidades da pesquisa microbiana, como a realização de experimentos ortogonais multifatorial multi-fator, tecnologia de amostragem automática multi-amostra para medir simultaneamente as curvas de crescimento de múltiplas espécies bacterianas e detectar e controlar com precisão mais parâmetros (por exemplo, oxigênio dissolvido (DO) e pH). Ao mesmo tempo, também é necessário desenvolver mais funções no campo da microbiologia para aplicar MMC a cenários mais práticos, como otimização de composições médias, determinação de concentração inibitória mínima (MIC), co-cultivo de microrganismos25, etc.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este estudo foi apoiado pelo Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China (2018YFA0901500), o Projeto Nacional de Instrumentos e Equipamentos Científicos da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (21627812) e o Programa de Pesquisa Científica da Iniciativa Universitária de Tsinghua (20161080108). Agradecemos também à Profª Julia A. Vorholt (Instituto de Microbiologia, Departamento de Biologia, ETH Zurique, Zurique 8093, Suíça) pelo fornecimento da cepa E. coli 2.2 (MeSV2.2).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.22 μm PVDF filter membrane | Merck Millipore Ltd. | SLGPR33RB | Sterilize the MMC oil |
| 4 °C refrigerator | Haier | BCD-289BSW | For reagent storage |
| Agar | Becton, Dickinson and Company | 214010 | For solid plate preparation |
| CaCl2·2H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 20011160 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Clean bench | Beijing Donglian Har Instrument Manufacture Co., Ltd. | DL-CJ-INDII | For aseptic operation and UV sterilization |
| CoCl2·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10007216 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Computer | Lenovo | E450 | Software installation and MMC control |
| Constant temperature incubator | Shanghai qixin scientific instrument co., LTD | LRH 250 | For the microbial cultivation using solid medium |
| CuSO4·5H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10008218 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Electronic balance | OHAUS | AR 3130 | For reagent weighing |
| EP tube | Thermo Fisher | 1.5 mL | For droplet collection |
| FeCl3·6H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10011928 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Freezing Tube | Thermo Fisher | 2.0 mL | For strain preservation |
| Gluconate | Sigma-Aldrich | S2054 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Glycerol | GENERAL-REAGENT | G66258A | For strain preservation |
| High-Pressure Steam Sterilization Pot | SANYO Electric | MLS3020 | For autoclaved sterilization |
| isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG) | Biotopped | 420322 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Kanamycin sulfate | Solarbio | K8020 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| KH2PO4 | MACKLIN | P815661 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Methanol | MACKLIN | M813895 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| MgSO4·7H2O | BIOBYING | 1305715 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Microbial Microdroplet Culture System (MMC) | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-I | Performing growth curve determination and adaptive evolution. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/index.php?v=news&id=110 |
| Microfluidic chip | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-ALE-OD | For various droplet operations. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| MMC oil | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-M/S-OD | The oil phase for droplet microfluidics. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| MnCl2 | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 20026118 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| NaCl | GENERAL-REAGENT | G81793J | Component of the LB medium |
| Na2HPO4·12H2O | GENERAL-REAGENT | G10267B | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| NH4Cl | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10001518 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Petri dish | Corning Incorporated | 90 mm | For the preparation of solid medium |
| Pipette | eppendorf | 2.5 μL, 10 μL, 100μL, 1000μL | For liquid handling |
| Quick connector A | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | — | For the connection of each joint. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| Reagent bottle | Luoyang TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. | MMC-PCB | Sampling and storage of bacteria solution and reagents. Please refer to http://www.tmaxtree.com/en/ |
| Shake flask | Union-Biotech | 50 mL | For microbial cultivation |
| Shaking incubator | Shanghai Sukun Industrial Co., Ltd. | SKY-210 2B | For the microbial cultivation in shake flask |
| Streptomycin sulfate | Solarbio | S8290 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Syringe | JIANGSU ZHIYU MEDICAL INSTRUCTMENT CO., LTD | 10 mL | Draw liquid and inject it into the reagent bottle |
| Syringe needle | OUBEL Hardware Store | 22G | Inner diameter is 0.41 mm and outer diameter is 0.71 mm. |
| Tryptone | Oxoid Ltd. | LP0042 | Component of the LB medium |
| Ultra low temperature refrigerator | SANYO Ultra-low | MDF-U4086S | For strain preservation (-80 °C) |
| UV–Vis spectrophotometer | General Electric Company | Ultrospec 3100 pro | For the measurement of OD values |
| Vitamin B1 | Solarbio | SV8080 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
| Yeast extract | Oxoid Ltd. | LP0021 | Component of the LB medium |
| ZnSO4·7H2O | Sinopharm Chemical Reagent Beijing Co., Ltd. | 10024018 | Component of the special medium for MeSV2.2. |
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