تصوير الميتوكوندريا Ca2 + امتصاص في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية باستخدام ترميز وراثيا Ca2 + مؤشرات (GECIs)
Summary
يهدف هذا proctocol إلى توفير طريقة للتصوير في المختبر وفي الجسم الحي الميتوكوندريا Ca2 + في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية.
Abstract
Mitochondrial Ca2+ يلعب دورا حاسما في السيطرة على التخزين المؤقت Ca2 + السيتوسوليك، واستقلاب الطاقة، ونقل الإشارات الخلوية. يساهم الحمل الزائد للميتوكوندريا Ca2+ في حالات مرضية مختلفة ، بما في ذلك التنكس العصبي وموت الخلايا المبرمج في الأمراض العصبية. هنا نقدم خلية من نوع محدد والميتوكوندريا التي تستهدف النهج الجزيئي للتصوير الميتوكوندريا Ca2 + في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية في المختبر وفي الجسم الحي. قمنا ببناء بلازميدات الحمض النووي ترميز الميتوكوندريا استهداف المشفرة وراثيا Ca2 + مؤشرات (GECIs) GCaMP5G أو GCaMP6s (GCaMP5G/6s) مع الخلايا الفلكية والخلايا العصبية محددة المروجين gfaABC1D وCaMKII وتسلسل استهداف الميتوكوندريا (ميتو-). للتصوير في المختبر الميتوكوندريا Ca2 + ، تم تحويل البلازميدات في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية المستزرعة للتعبير عن GCaMP5G/6s. في الجسم الحي الميتوكوندريا Ca2 + التصوير, تم إعداد ناقلات الفيروس المرتبطة أدينو (AAVs) وحقنها في أدمغة الماوس للتعبير عن GCaMP5G/6s في الميتوكوندريا في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية. نهجنا يوفر وسيلة مفيدة لتصوير الميتوكوندريا Ca2 + ديناميات في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية لدراسة العلاقة بين السيتوسوليك والميتوكوندريا Ca2 + الإشارات، فضلا عن التفاعلات بين الخلايا الفلكية والخلايا العصبية.
Introduction
الميتوكوندريا هي العضيات دون الخلوية الديناميكية وتعتبر مراكز قوة الخلية لإنتاج الطاقة. من ناحية أخرى، يمكن أن يستغرق الميتوكوندريا Ca2 + إلى المصفوفة استجابة لارتفاع Ca2+ المحلي أو الخلوي. الميتوكوندريا Ca2+ امتصاص يؤثر على وظيفة الميتوكوندريا, بما في ذلك عمليات التمثيل الغذائي مثل ردود الفعل في دورة حمض tricarboxylic (TCA) والفوسفور التأكسدي, وينظم Ca2+البروتينات الحساسة في ظل الظروف الفسيولوجية1,2,3,4. الميتوكوندريا Ca2 + الزائد هو أيضا محدد للموت الخلية, بما في ذلك نخر وموت الخلايا المبرمج في اضطرابات الدماغ المختلفة5,6,7. فإنه يسبب فتح المسام انتقال نفاذية الميتوكوندريا (mPTPs) والإفراج عن العامل المساعد كاسباس، والتي تبدأ موت الخلايا المبرمج. لذلك ، من المهم دراسة ديناميات Mitochondrial Ca2 + والتعامل معها في الخلايا الحية لفهم فسيولوجيا الخلايا وعلم الأمراض بشكل أفضل.
الميتوكوندريا الحفاظ على مصفوفة Ca2 + التوازن من خلال التوازن بين امتصاص Ca2 + وefflux. يتم التوسط أساسا الميتوكوندريا كا2 + امتصاص من قبل الميتوكوندريا Ca2 + uniporters (MCUs)، في حين يتم التوسط الميتوكوندريا Ca2 + efflux من قبل نا+-Ca2 +– لي+ المبادلات (NCLXs) وH+/ Ca2 + المبادلات (mHCXs)8. يمكن أن يكون التوازن المضطرب من خلال تحفيز مستقبلات G-البروتين مقرونة (GPCRs)9. الميتوكوندريا Ca2 + التوازن يتأثر أيضا التخزين المؤقت الميتوكوندريا من خلال تشكيل xCa غير قابل للذوبان2 +-xPO4x-xOH المجمعات8.
يمكن تقييم التغيرات داخل الخلايا والميتوكوندريا في تركيز Ca2 + ([Ca2+]) من خلال مؤشرات الفلورسنت أو الإنارة Ca2+ . Ca2 + ملزمة للمؤشرات يسبب تعديلات الطيفية، مما يسمح لتسجيل الخلوية الحرة [Ca2 +] في الوقت الحقيقي في الخلايا الحية. يتوفر حاليا نوعان من المسابير لمراقبة تغيرات Ca2+ في الخلايا: المؤشرات الكيميائية العضوية ومؤشرات Ca2+ المشفرة وراثيا (GECIs). عموما، المتغيرات المختلفة مع مختلف Ca2 + تقارب (على أساس Kد)،خصائص الطيفية (الإثارة والأطوال الموجية الانبعاثات)، والنطاقات الديناميكية، والحساسيات متاحة للأسئلة البيولوجية قيد التحقيق. على الرغم من أن العديد من الاصطناعية العضوية Ca2+ وقد استخدمت مؤشرات للتصوير الخلوي Ca2 + ، إلا أن عدد قليل فقط يمكن تحميلها بشكل انتقائي في مصفوفة الميتوكوندريا للتصوير Mitochondrial Ca2 + ، مع رود – 2 كونها الأكثر استخداما على نطاق واسع (للاستعراضات انظر10،11). ومع ذلك، رود-2 لديه عيب كبير من التسرب خلال التجارب طويلة الوقت بالطبع؛ بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقسيمه بين الميتوكوندريا ، العضيات الأخرى والسيتوسول ، مما يجعل القياسات المطلقة في الأقسام الفرعية المختلفة صعبة. في المقابل ، باستخدام المروجين محددة من نوع الخلية وتسلسل استهداف المقصورة دون الخلوية ، يمكن التعبير عن GECIs في أنواع مختلفة من الخلايا والمقصورات دون الخلوية للتصوير Ca2 + الخاص بالخلايا والمقصورة في المختبر أو في الجسم الحي. وقد ظهرت مؤخرا واحد الطول الموجي الفلورسينس القائم على كثافة GCaMP Ca2 + مؤشرات كبرى GECIs12،13،14،15،16. في هذه المقالة، ونحن نقدم بروتوكولا لاستهداف الميتوكوندريا والتعبير عن نوع الخلية محددة من GCaMP5G وGCaMP6s (GCaMP5G/6s) في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية، والتصوير الميتوكوندريا كا2 + امتصاص في هذه الأنواع من الخلايا. باستخدام هذا البروتوكول، يمكن الكشف عن التعبير عن GCaMP6G/6s في الميتوكوندريا الفردية، ويمكن تحقيق امتصاص Ca2+ في دقة الميتوكوندريا واحدة في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية في المختبر وفي الجسم الحي.
Protocol
Representative Results
Discussion
في هذه المقالة، ونحن نقدم طريقة وبروتوكول لتصوير الميتوكوندريا Ca2 + إشارات في الخلايا الفلكية والخلايا العصبية. قمنا بتنفيذ استراتيجيات استهداف الميتوكوندريا ونوع الخلية الخاصة للتعبير عن GECI GCaMP5G/6s. لاستهداف GCaMP5G/6s في الميتوكوندريا، أدرجنا تسلسل استهداف الميتوكوندريا في البلازميد?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد دعم هذا العمل المعهد الوطني للصحة الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (NINDS) منح R01NS069726 وR01NS094539 إلى SD. نشكر إيريكا ديمرس على التسجيل الصوتي.
Materials
| Artificial tears ointment | Rugby | NDC-0536-6550-91 | 83% white petrolatum |
| Cyanoacrylate glue | World Precision Instruments | 3M Vetbond Adhesive | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon | SMZ 2B | Surgery |
| Dumont forceps with fine tip | Fine Science Tools | 11255-20 | for removal of dura |
| Glass cover slips, 0.13-0.17 mm thick | Fisher Scientific | 12-542A | for cranial window cover |
| High speed micro drill | Fine Science Tools | 18000-17 | with bone polishing drill bit |
| Injection syringe | Hamilton | 2.5 ml | for viral injection |
| Ketamine | VEDCO | NDC-50989-996-06 | 100 mg/kg body weight |
| Low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A9793 | reducing movement artifacts |
| Metal frame | Custom-made | see Fig 1 | for brain attachment to microscope stage |
| MicroSyringe Pump Controller | World Precision Instruments | UMP3 | Injection speed controller |
| Mouse stereotaxic device | Stoelting | 51725 | for holding mice |
| Perfusion chamber | Warner Instruments | 64-0284 | |
| Persfusion system | ALA Scientific Instruments | ALA-VM8 | |
| Self-regulating heating pad | Fine Science Tools | 21061 | to prevent hypothermia of mice |
| Sulforhodamine 101 | Invitrogen | S-359 | red fluorescent dye to label astrocytes |
| Surgical scissors, 12 cm | Fine Science Tools | 14002-12 | for dissection |
| Trephine | Fine Science Tools | 18004-23 | for clearing of material |
| Xylazine | VEDCO | NDC-50989-234-11 | 10 mg/kg body weight |
Referências
- Griffiths, E. J., Rutter, G. A. Mitochondrial calcium as a key regulator of mitochondrial ATP production in mammalian cells. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Bioenergetics. 1787 (11), 1324-1333 (2009).
- Pizzo, P., Drago, I., Filadi, R., Pozzan, T. Mitochondrial Ca2+ homeostasis: mechanism, role, and tissue specificities. Pflugers Archiv – European Journal of Physiology. 464 (1), 3-17 (2012).
- Llorente-Folch, I., et al. Calcium-regulation of mitochondrial respiration maintains ATP homeostasis and requires ARALAR/AGC1-malate aspartate shuttle in intact cortical neurons. The Journal of Neuroscience. 33 (35), 13957-13971 (2013).
- Burkeen, J. F., Womac, A. D., Earnest, D. J., Zoran, M. J. Mitochondrial calcium signaling mediates rhythmic extracellular ATP accumulation in suprachiasmatic nucleus astrocytes. The Journal of Neuroscience. 31 (23), 8432-8440 (2011).
- Duchen, M. Mitochondria, calcium-dependent neuronal death and neurodegenerative disease. Pflugers Archiv – European Journal of Physiology. 464 (1), 111-121 (2012).
- Gouriou, Y., Demaurex, N., Bijlenga, P., De Marchi, U. Mitochondrial calcium handling during ischemia-induced cell death in neurons. Biochimie. 93 (12), 2060-2067 (2011).
- Qiu, J., et al. Mitochondrial calcium uniporter Mcu controls excitotoxicity and is transcriptionally repressed by neuroprotective nuclear calcium signals. Nature Communications. 4, 2034 (2013).
- Filadi, R., Greotti, E. The yin and yang of mitochondrial Ca2+ signaling in cell physiology and pathology. Cell Calcium. 93, 102321 (2021).
- Finkel, T., et al. The ins and outs of mitochondrial calcium. Circulation Research. 116 (11), 1810-1819 (2015).
- Paredes, R. M., Etzler, J. C., Watts, L. T., Zheng, W., Lechleiter, J. D. Chemical calcium indicators. Methods. 46 (3), 143-151 (2008).
- Contreras, L., Drago, I., Zampese, E., Pozzan, T. Mitochondria: The calcium connection. Biochimica et Biophysica Acta (BBA. 1797 (6-7), 607-618 (2010).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nature Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Yamada, Y., et al. Quantitative comparison of genetically encoded Ca2+ indicators in cortical pyramidal cells and cerebellar Purkinje cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 5, 18 (2011).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP Calcium Indicator for Neural Activity Imaging. The Journal of Neuroscience. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Dana, H., et al. High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments. Nature Methods. 16 (7), 649-657 (2019).
- Rizzuto, R., Brini, M., Pizzo, P., Murgia, M., Pozzan, T. Chimeric green fluorescent protein as a tool for visualizing subcellular organelles in living cells. Current Biology: CB. 5 (6), 635-642 (1995).
- Xie, Y., Wang, T., Sun, G. Y., Ding, S. Specific disruption of astrocytic Ca2+ signaling pathway in vivo by adeno-associated viral transduction. Neurociência. 170 (4), 992-1003 (2010).
- Lee, Y., et al. GFAP promoter elements required for region-specific and astrocyte-specific expression. Glia. 56 (5), 481-493 (2008).
- Li, H., et al. Imaging of mitochondrial Ca2+ dynamics in astrocytes using cell-specific mitochondria-targeted GCaMP5G/6s: Mitochondrial Ca2+ uptake and cytosolic Ca2+ availability via the endoplasmic reticulum store. Cell Calcium. 56 (6), 457-466 (2014).
- Zhang, N., Ding, S. Imaging of mitochondrial and cytosolic Ca2+ signals in cultured astrocytes. Current Protocols in Neuroscience. 82, 1-11 (2018).
- Bi, J., Li, H., Ye, S. Q., Ding, S. Pre-B-cell colony-enhancing factor exerts a neuronal protection through its enzymatic activity and the reduction of mitochondrial dysfunction in in vitro ischemic models. Journal of Neurochemistry. 120 (2), 334-346 (2012).
- Wang, X., Li, H., Ding, S. Pre-B-cell colony-enhancing factor protects against apoptotic neuronal death and mitochondrial damage in ischemia. Scientific Reports. 6, 32416 (2016).
- Wang, X., et al. Subcellular NAMPT-mediated NAD+ salvage pathways and their roles in bioenergetics and neuronal protection after ischemic injury. Journal of Neurochemistry. 151 (6), 732-748 (2019).
- Xie, Y., Chen, S., Wu, Y., Murphy, T. H. Prolonged deficits in parvalbumin neuron stimulation-evoked network activity despite recovery of dendritic structure and excitability in the somatosensory cortex following global ischemia in mice. The Journal of Neuroscience. 34 (45), 14890-14900 (2014).
- Ding, S., Milner, R. . In vivo imaging of Ca2+ signaling in astrocytes using two-photon laser scanning fluorescent microscopy in Astrocytes. , 545-554 (2012).
- Li, H., et al. Disruption of IP3R2-mediated Ca2+ signaling pathway in astrocytes ameliorates neuronal death and brain damage while reducing behavioral deficits after focal ischemic stroke. Cell Calcium. 58 (6), 565-576 (2015).
- Ding, S., et al. Photothrombosis ischemia stimulates a sustained astrocytic Ca2+ signaling in vivo. Glia. 57 (7), 767-776 (2009).
- Ding, S., et al. Enhanced astrocytic Ca2+ signals contribute to neuronal excitotoxicity after status epilepticus. The Journal of Neuroscience. 27 (40), 10674-10684 (2007).
- Gobel, J., et al. Mitochondria-endoplasmic reticulum contacts in reactive astrocytes promote vascular remodeling. Cell Metabolism. 31 (4), 791-808 (2020).
- Diaz-Garcia, C. M., et al. The distinct roles of calcium in rapid control of neuronal glycolysis and the tricarboxylic acid cycle. eLife. 10, 64821 (2021).
