Визуализация поглощения митохондриального Ca2+ в астроцитах и нейронах с использованием генетически закодированных индикаторов Ca2+ (GECI)

Summary

Этот проктокол призван обеспечить метод визуализации митохондрий Ca²⁺ in vitro и in vivo в астроцитах и нейронах.

Abstract

Митохондриальный Ca²⁺ играет решающую роль в контроле цитозольной буферизации Ca^2+, энергетического метаболизма и трансдукции клеточного сигнала. Перегрузка митохондриального Ca²⁺ способствует различным патологическим состояниям, включая нейродегенерацию и апоптотическую гибель клеток при неврологических заболеваниях. Здесь мы представляем специфический клеточный тип и митохондрии, нацеленные на молекулярный подход для визуализации митохондрий Ca^{2 +} в астроцитах и нейронах in vitro и in vivo. Мы построили ДНК-плазмиды, кодирующие митохондрии-таргетные генетически закодированные индикаторы Ca²⁺ (GECI) GCaMP5G или GCaMP6s (GCaMP5G/6s) с астроцитарными и нейрон-специфическими промоторами gfaABC1D и CaMKII и последовательностью нацеливания на митохондрии (mito-). Для визуализации митохондрий Ca²⁺ in vitro плазмиды трансфектировались в культивируемых астроцитах и нейронах для экспрессии GCaMP5G/6s. Для визуализации in vivo митохондриального Ca²⁺ аденоассоциированные вирусные векторы (AAV) были подготовлены и введены в мозг мыши для экспрессии GCaMP5G/6s в митохондриях в астроцитах и нейронах. Наш подход предоставляет полезные средства для изображения динамики митохондриального Ca²⁺ в астроцитах и нейронах для изучения взаимосвязи между цитозольной и митохондриальной сигнализацией Ca^2+, а также взаимодействиями астроцитов и нейронов.

Introduction

Митохондрии являются динамическими субклеточными органеллами и считаются клеточными электростанциями для производства энергии. С другой стороны, митохондрии могут поглощать Ca²⁺ в матрицу в ответ на локальное или цитозольное повышение Ca^2+. Поглощение митохондриальной Ca²⁺ влияет на митохондриальную функцию, включая метаболические процессы, такие как реакции в цикле трикарбоновой кислоты (TCA) и окислительное фосфорилирование, и регулирует Ca²⁺-чувствительные белки в физиологических условиях^1,2,3,4. Перегрузка митохондрий Ca²⁺ также является определяющим фактором гибели клеток, включая некроз и апоптоз при различных заболеваниях головного мозга^5,6,7. Это вызывает открытие переходных пор митохондриальной проницаемости (мПТП) и высвобождение кофактора каспазы, которые инициируют апоптотическую гибель клеток. Поэтому важно изучать динамику митохондриального Ca²⁺ и обработку в живых клетках, чтобы лучше понять клеточную физиологию и патологию.

Митохондрии поддерживают матричный гомеостаз Ca^{2 +} через баланс между поглощением Ca^{2 +} и эффлюксом. Поглощение митохондриального Ca²⁺ в основном опосредовано митохондриальными Ca²⁺ унипортерами (MCU), в то время как митохондриальный Ca²⁺ эффлюкс опосредован Na⁺-Ca^{2 +}-Li⁺ теплообменниками (NCLX) и H⁺/ Ca^{2 +} обменниками (mHCX)^8. Баланс может быть нарушен посредством стимуляции рецепторов, связанных с G-белком (GPCR)^9. Митохондриальный гомеостаз Ca²⁺ также подвержен влиянию митохондриальной буферизации путем образования нерастворимых комплексов xCa²⁺-xPO₄x-xOH^8.

Внутриклеточные и митохондриальные изменения концентрации Ca²⁺ ([Ca²⁺]) могут быть оценены по флуоресцентным или люминесцентным показателям Ca^2+. Связывание Ca²⁺ с индикаторами вызывает спектральные модификации, позволяющие регистрировать свободную клетку [Ca^2+]в реальном времени в живых клетках. В настоящее время доступны два типа зондов для мониторинга изменений Ca²⁺ в клетках: органические химические индикаторы и генетически закодированные индикаторы Ca²⁺ (GECI). Как правило, для исследуемых биологических вопросов доступны различные варианты с различными сродствами Ca²⁺ (на основе K_d),спектральными свойствами (волны возбуждения и излучения), динамическими диапазонами и чувствительностью. Хотя многие синтетические органические индикаторы Ca²⁺ использовались для цитозольной визуализации Ca^{2+, только} некоторые из них могут быть избирательно загружены в митохондриальный матрикс для визуализации митохондриального Ca^2+, причем Род-2 является наиболее широко используемым (для обзоров см.^10,11). Тем не менее, Rhod-2 имеет серьезный недостаток утечки во время длительных экспериментов; кроме того, он разделен между митохондриями, другими органеллами и цитозолом, что затрудняет абсолютные измерения в разных подкомпартментах. Напротив, используя специфические промоторы клеточного типа и последовательности нацеливания на субклеточный компартмент, GECI могут быть экспрессированы в различных типах клеток и субклеточных компартментах для клеточной и компартмент-специфической визуализации Ca²⁺ in vitro или in vivo. Одноволновые индикаторы интенсивности флуоресценции на основе GCaMP Ca²⁺ недавно стали основными GECI^{12,13,14,15,16.} В этой статье мы предоставляем протокол для нацеливания на митохондрии и специфической экспрессии GCaMP5G и GCaMP6s (GCaMP5G / 6s) в астроцитах и нейронах, а также визуализации поглощения митохондриального Ca^{2 +} в этих типах клеток. Используя этот протокол, экспрессия GCaMP6G/6s в отдельных митохондриях может быть выявлена, а поглощение Ca²⁺ в одном митохондриальном разрешении может быть достигнуто в астроцитах и нейронах in vitro и in vivo.

Protocol

Процедуры с участием животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Университете Миссури-Колумбия. 1. Построение плазмид ДНК ПРИМЕЧАНИЕ: Для визуализации in vitro и in vivo построены плазмиды ?…

Representative Results

Целью этого исследования было предоставление методологии для изображения митохондриальных сигналов Ca2+ с использованием GECI в астроцитах и нейронах in vitro и in vivo. Здесь представлены результаты как in vitro, так и in vivo митохондриальной визуализации Ca2+. <p class="jov…

Discussion

В этой статье мы представляем метод и протокол визуализации митохондриальных сигналов Ca²⁺ в астроцитах и нейронах. Мы внедрили стратегии таргетирования митохондрий и типа клеток для экспрессии GECI GCaMP5G/6s. Чтобы нацелиться на GCaMP5G/6s в митохондриях, мы включили последовательность, на…

Materials

Artificial tears ointment	Rugby	NDC-0536-6550-91	83% white petrolatum
Cyanoacrylate glue	World Precision Instruments		3M Vetbond Adhesive
Dissecting stereomicroscope	Nikon	SMZ 2B	Surgery
Dumont forceps with fine tip	Fine Science Tools	11255-20	for removal of dura
Glass cover slips, 0.13-0.17 mm thick	Fisher Scientific	12-542A	for cranial window cover
High speed micro drill	Fine Science Tools	18000-17	with bone polishing drill bit
Injection syringe	Hamilton	2.5 ml	for viral injection
Ketamine	VEDCO	NDC-50989-996-06	100 mg/kg body weight
Low melting point agarose	Sigma-Aldrich	A9793	reducing movement artifacts
Metal frame	Custom-made	see Fig 1	for brain attachment to microscope stage
MicroSyringe Pump Controller	World Precision Instruments	UMP3	Injection speed controller
Mouse stereotaxic device	Stoelting	51725	for holding mice
Perfusion chamber	Warner Instruments	64-0284
Persfusion system	ALA Scientific Instruments	ALA-VM8
Self-regulating heating pad	Fine Science Tools	21061	to prevent hypothermia of mice
Sulforhodamine 101	Invitrogen	S-359	red fluorescent dye to label astrocytes
Surgical scissors, 12 cm	Fine Science Tools	14002-12	for dissection
Trephine	Fine Science Tools	18004-23	for clearing of material
Xylazine	VEDCO	NDC-50989-234-11	10 mg/kg body weight