Bildgebung der mitochondrialen Ca2+ Aufnahme in Astrozyten und Neuronen unter Verwendung von genetisch kodierten Ca2+ Indikatoren (GECIs)
Summary
Dieses Proktokol zielt darauf ab, eine Methode für die in vitro und in vivo mitochondriale Ca2+ Bildgebung in Astrozyten und Neuronen bereitzustellen.
Abstract
MitochondrialesCa2+ spielt eine entscheidende Rolle bei der Kontrolle der zytosolischenCa2+-Pufferung, des Energiestoffwechsels und der zellulären Signaltransduktion. Die Überlastung des mitochondrialen Ca2+ trägt zu verschiedenen pathologischen Zuständen bei, einschließlich Neurodegeneration und apoptotischem Zelltod bei neurologischen Erkrankungen. Hier stellen wir einen zelltypspezifischen und auf Mitochondrien abzielenden molekularen Ansatz für die mitochondriale Ca2+ Bildgebung in Astrozyten und Neuronen in vitro und in vivovor. Wir konstruierten DNA-Plasmide, die für Mitochondrien kodieren, die auf genetisch kodierte Ca2+ Indikatoren (GECIs) GCaMP5G oder GCaMP6s (GCaMP5G/6s) mit astrozyten- und neuronenspezifischen Promotoren gfaABC1D und CaMKII und mitochondrien-Targeting-Sequenz (mito-) abzielen. Für die in vitro mitochondriale Ca2+ Bildgebung wurden die Plasmide in kultivierten Astrozyten und Neuronen transfiziert, um GCaMP5G/6s zu exprimieren. Für die in vivo mitochondriale Ca2+ Bildgebung wurden adeno-assoziierte virale Vektoren (AAVs) hergestellt und in das Gehirn der Maus injiziert, um GCaMP5G/6s in Mitochondrien in Astrozyten und Neuronen zu exprimieren. Unser Ansatz bietet ein nützliches Mittel, um die mitochondrialeCa2+-Dynamik in Astrozyten und Neuronen abzubilden, um die Beziehung zwischen zytosolischer und mitochondrialerCa2+-Signalgebung sowie Astrozyten-Neuronen-Interaktionen zu untersuchen.
Introduction
Mitochondrien sind dynamische subzelluläre Organellen und gelten als Zellkraftwerke für die Energieproduktion. Auf der anderen Seite können MitochondrienCa2+ in die Matrix aufnehmen, als Reaktion auf lokale oder zytosolischeCa2+ Anstiege. Die mitochondrialeCa2+-Aufnahme beeinflusst die mitochondriale Funktion, einschließlich Stoffwechselprozesse wie Reaktionen im Tricarbonsäurezyklus (TCA) und oxidative Phosphorylierung, und reguliertCa2+-empfindlicheProteine unter physiologischenBedingungen 1,2,3,4. Mitochondriale Ca2+ Überlastung ist auch eine Determinante für den Zelltod, einschließlich Nekrose und Apoptose bei verschiedenen Hirnerkrankungen5,6,7. Es verursacht die Öffnung von mitochondrialen Permeabilitätsübergangsporen (mPTPs) und die Freisetzung von Caspase-Cofaktor, die den apoptotischen Zelltod einleiten. Daher ist es wichtig, die mitochondrialeCa2+-Dynamik und -Handhabung in lebenden Zellen zu untersuchen, um die zelluläre Physiologie und Pathologie besser zu verstehen.
Mitochondrien erhalten die MatrixCa2+ Homöostase durch ein Gleichgewicht zwischen Ca2+ Aufnahme und Efflux. Die mitochondrialeCa2+-Aufnahme wird hauptsächlich durch mitochondrialeCa2+-Uniporter (MCUs) vermittelt, während der mitochondrialeCa2+-Efflux durch die Na+-Ca2+-Li+-Austauscher (NCLXs) und dieH+/Ca2+-Austauscher(mHCXs)8vermittelt wird. Das Gleichgewicht kann durch die Stimulation von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs) gestört werden9. MitochondrialeCa2+ Homöostase wird auch durch mitochondriale Pufferung durch die Bildung von unlöslichenxCa2+-xPO4x-xOH-Komplexenbeeinflusst 8.
Intrazelluläre und mitochondriale Veränderungen derCa2+-Konzentration ([Ca2+])können durch fluoreszierende oder lumineszierendeCa2+-Indikatoren bewertet werden. Die Bindung von Ca2+ an Indikatoren verursacht spektrale Modifikationen, die es ermöglichen, freie zelluläre [Ca2+] in Echtzeit in lebenden Zellen aufzuzeichnen. Derzeit stehen zwei Arten von Sonden zur Verfügung, um Ca2+-Veränderungen in Zellen zu überwachen: organisch-chemische Indikatoren und genetisch kodierteCa2+-Indikatoren (GECIs). Im Allgemeinen stehen für die untersuchten biologischen Fragestellungen unterschiedliche Varianten mit unterschiedlichenCa2+-Affinitäten (basierend auf Kd),spektralen Eigenschaften (Anregungs- und Emissionswellenlängen), Dynamikbereichen und Sensitivitäten zur Verfügung. Obwohl viele synthetische organische Ca2+-Indikatoren für die zytosolischeCa2+-Bildgebung verwendet wurden, können nur wenige selektiv in die mitochondriale Matrix für die mitochondrialeCa2+-Bildgebung geladen werden, wobei Rhod-2 am weitesten verbreitet ist (für Reviews siehe10,11). Rhod-2 hat jedoch einen großen Nachteil der Leckage bei langen Zeitverlaufsexperimenten; Darüber hinaus ist es zwischen Mitochondrien, anderen Organellen und dem Zytosol aufgeteilt, was absolute Messungen in verschiedenen Unterkompartimenten erschwert. Im Gegensatz dazu können GECIs durch die Verwendung von zelltypspezifischen Promotoren und subzellulären Kompartiment-Targeting-Sequenzen in verschiedenen Zelltypen und subzellulären Kompartimenten für die zell- und kompartimentspezifischeCa2+-Bildgebung in vitro oder in vivoexprimiert werden. Einwellenlängen-Fluoreszenzintensitäts-basierte GCaMP Ca2+ Indikatoren haben sich kürzlich als Haupt-GECIs12,13,14,15,16herausgestellt. In diesem Artikel stellen wir ein Protokoll für das Mitochondria-Targeting und die zelltypspezifische Expression von GCaMP5G und GCaMP6s (GCaMP5G/6s) in Astrozyten und Neuronen sowie die Abbildung der mitochondrialen Ca2+-Aufnahme in diesen Zelltypen zur Verfügung. Mit diesem Protokoll kann die Expression von GCaMP6G/6s in einzelnen Mitochondrien aufgedeckt werden, und ca2+ Aufnahme in einzelner mitochondrialer Auflösung kann in Astrozyten und Neuronen in vitro und in vivoerreicht werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
In diesem Artikel stellen wir eine Methode und ein Protokoll zur Abbildung mitochondrialer Ca2+-Signale in Astrozyten und Neuronen zur Verfügung. Wir implementierten Mitochondria-Targeting- und zelltypspezifische Strategien, um GECI GCaMP5G/6s zu exprimieren. Um GCaMP5G/6s in Mitochondrien anzugreifen, haben wir eine Mitochondrien-Targeting-Sequenz in die Plasmide aufgenommen. Um GCaMP5G/6s in Astrozyten und Neuronen in vivo zu exprimieren,haben wir einen Astrozyten-spezifischen Promotor gfaABC1D und…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom National Institute of Health unterstützt Das National Institute of Neurological Disorders and Stroke (NINDS) gewährt R01NS069726 und R01NS094539 an SD. Wir danken Erica DeMers für die Audioaufnahme.
Materials
| Artificial tears ointment | Rugby | NDC-0536-6550-91 | 83% white petrolatum |
| Cyanoacrylate glue | World Precision Instruments | 3M Vetbond Adhesive | |
| Dissecting stereomicroscope | Nikon | SMZ 2B | Surgery |
| Dumont forceps with fine tip | Fine Science Tools | 11255-20 | for removal of dura |
| Glass cover slips, 0.13-0.17 mm thick | Fisher Scientific | 12-542A | for cranial window cover |
| High speed micro drill | Fine Science Tools | 18000-17 | with bone polishing drill bit |
| Injection syringe | Hamilton | 2.5 ml | for viral injection |
| Ketamine | VEDCO | NDC-50989-996-06 | 100 mg/kg body weight |
| Low melting point agarose | Sigma-Aldrich | A9793 | reducing movement artifacts |
| Metal frame | Custom-made | see Fig 1 | for brain attachment to microscope stage |
| MicroSyringe Pump Controller | World Precision Instruments | UMP3 | Injection speed controller |
| Mouse stereotaxic device | Stoelting | 51725 | for holding mice |
| Perfusion chamber | Warner Instruments | 64-0284 | |
| Persfusion system | ALA Scientific Instruments | ALA-VM8 | |
| Self-regulating heating pad | Fine Science Tools | 21061 | to prevent hypothermia of mice |
| Sulforhodamine 101 | Invitrogen | S-359 | red fluorescent dye to label astrocytes |
| Surgical scissors, 12 cm | Fine Science Tools | 14002-12 | for dissection |
| Trephine | Fine Science Tools | 18004-23 | for clearing of material |
| Xylazine | VEDCO | NDC-50989-234-11 | 10 mg/kg body weight |
Referências
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